Summary
Apresenta-se um protocolo para a utilização de um sistema de rádio-telemétrico para registar os parâmetros cardiovasculares em ratos T4 medular transeccionados oito semanas após o tronco cerebral embrionária das células estaminais neurais de enxerto no local da lesão. A telemetria é uma técnica avançada para avaliar com precisão a função cardiovascular em que se movem livremente na medula espinhal ratos lesionados conscientes.
Abstract
Alta lesão medular torácica ou cervical (SCI) pode levar à disfunção cardiovascular. Para monitorar os parâmetros cardiovasculares, que implantou um cateter ligado a um transmissor de rádio na artéria femoral de ratos que foram submetidos a um T4 espinhal transection cabo com ou sem enxerto de células-tronco embrionárias neural derivado do tronco cerebral que expressam a proteína fluorescente verde. Em comparação com outros métodos, como a inserção de uma cânula ou tail-cuff, a telemetria é vantajoso para monitorar continuamente a pressão arterial e freqüência cardíaca nos animais que se movem livremente. Ela também é capaz de longa duração de dados de aquisições múltiplas. Na medula espinhal feridos ratos, os dados cardiovasculares basais sob condição desenfreada e Disreflexia autonômico em resposta à distensão colorretal foram gravadas com sucesso. Além disso, os parâmetros cardiovasculares antes e depois da SCI pode ser comparada no mesmo rato, se um transmissor é implantado antes uma transecção da medula espinal. Uma limitação do Telemet descritory procedimento é que a implantação na artéria femoral podem influenciar o suprimento de sangue para o membro posterior ipsilateral.
Introduction
Disfunção cardiovascular ocorre após lesão da medula espinhal (SCI) em níveis elevados. Ela se manifesta na pressão desordenada arterial e freqüência cardíaca em repouso, hipotensão ortostática, hipotensão induzida por exercício, e Disreflexia autônomo, caracterizadas por episódios de hipertensão e bradicardia mediada pelo barorreflexo em resposta a estímulos sensoriais abaixo do nível da lesão 1,2. Estes sintomas interferem com a vida diária de pacientes feridos medula espinhal. Assim, é importante estabelecer instrumentos eficazes para a investigação das alterações cardiovasculares em animais com lesão medular e tratamentos experimentais.
Para investigar a função cardiovascular em animais, várias técnicas têm sido usadas para monitorar a pressão arterial e freqüência cardíaca. Parâmetros cardiovasculares centrais podem ser registados através de inserção de cânula e de telemetria, ao passo que não invasivos cauda-punhos pode ser empregue para medir a pressão arterial periférica 3. Em comparação com outros métodos, teletria tem como principal vantagem que permite a gravação contínua em animais que se movem livremente e acompanhamento a longo prazo da função cardiovascular 4. Em modelos animais, SCI, as mudanças na pressão do sangue periférico após estimulação experimental pode não ser suficientemente grande para ser detectada. Assim, a técnica de monitoramento cardíaco adequado deve ser seleccionado para animais com SCI.
No presente estudo, um sistema de rádio-telemetria foi introduzido para monitorar a função cardiovascular em ratos adultos após a transecção completa da medula espinhal. Os ratos receberam enxertos de rato singênico dia embrionário 14 (E14) células-tronco neurais derivadas de tronco cerebral (BS-NSC) no local da lesão. Ratos com lesões e sem transplante e ingênuos, ratos lesionados serviram como controle. O procedimento inclui a esterilização de telemetria transmissor e o implante (Figura 1), a gravação de parâmetros cardiovasculares basal, as respostas induzidas por distensão colorectal, e a limpeza e transmissorarmazenamento.
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Protocol
Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC). Diretrizes do NIH para cuidados com animais de laboratório e segurança sejam rigorosamente seguidas. Os animais com procedimentos cirúrgicos foram tratadas adequadamente para minimizar a dor eo desconforto.
1. Medular Curgery e enxerto celular
- Instrumentos cirúrgicos autoclave antes de todas as cirurgias. Use Hot Bead Sterilizer (Ferramentas Ciência Belas) para remover patógenos e contaminantes microbianos de instrumentos entre os procedimentos em diferentes animais. Use luvas estéreis cirúrgicas, vestido e cortinas durante a cirurgia. Empregar técnica cirúrgica asséptica para cada procedimento cirúrgico.
- Anestesiar ratos Fisher 344 fêmea com uma combinação (2 ml / kg) de cetamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml), e acepromazina (0,25 mg / ml) administrados através de injecção intraperitoneal (ip).
- Raspar área nas costas e limpar a pele com Betadine e repetidamente etanol.
- Cortar a pele usando uma lâmina # 10 e sem rodeios dissecar músculos camadas. Use um bisturi para isolar as vértebras, expor a vértebra T3, e realizar uma laminectomia dorsal utilizando uma ponta fina fórceps.
- Faça uma incisão na dura longitudinalmente e transecto a medula espinhal no nível T4 usando uma combinação de Iridectomia tesoura e microaspirações para criar uma lacuna rostrocaudal aproximadamente 1 mm entre os cotos na medula espinhal.
- Espere cerca de 1-2 minutos até que o sangramento totalmente interrompida, voltando músculos sutura com 3-0 Vycril e fechar a pele com grampos de sutura.
- Injectar (5 ml) de Lactato de Ringer, buprenorfina (0,035 mg / kg), e ampicilina (33 mg / kg) por via subcutânea imediatamente após a cirurgia e manter os ratos em uma incubadora quente até acordado.
- Injectar a solução de Ampicilina uma vez por dia até 10 dias, e buprenorfina, duas vezes por dia durante 3 dias, ou até que os sinais de dor e desconforto de Ringer e desaparecer. Não devolva um animal de companhia de outros animais até fully recuperado.
- Esvaziar manualmente a bexiga duas vezes por dia por cerca de duas semanas, até o estabelecimento de bexiga reflexo esvaziamento, e, em seguida, esvaziar a bexiga, uma vez por dia durante toda a sobrevivência, se necessário.
- Duas semanas mais tarde, voltar a anestesiar ratos SCI como descrito acima e re-expor o local da lesão da medula espinal. Mantenha a dura fechado para reter células implantadas no local da lesão.
- Injectar 10 ml de solução de células (3,5 × 10 5 mL), coletados a partir de E14 GFP onipresente embriões de ratos transgênicos e incorporado em fibrinogênio e trombina 5,6, no epicentro da cavidade lesão ea interface rostral e caudal da lesão com injeção múltipla locais, utilizando uma micropipeta de vidro puxado com um diâmetro interno de 40 um, ligado a uma seringa Hamilton.
- Suturar as camadas musculares e fechar a pele com agrafos.
- Realize injeção pós-operatório e cuidados bexiga conforme descrito nas etapas 1,6-1,8.
- Uma semana serfore perfusão, injetar 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml em água destilada) por via intraperitoneal a etiqueta retrógrada simpáticas neurônios pré-ganglionares na medula espinhal 7.
2 Transmissor Implantação
- Soak transmittersin solução de glutaraldeído a 2% (4 ml de glutaraldeído a 50% em 96 ml de água destilada) por pelo menos 1 - 2 h (até 10 horas) à temperatura ambiente durante a esterilização.
- Lavar cuidadosamente com transmissores estéril a 0,9% de solução salina 3 vezes e armazená-los em solução salina até à sua utilização (não mais do que 1 hora).
- Oito semanas após o transplante de células E14 (10 semanas após a lesão), reanesthetize os ratos que foram submetidos a um SCI, com ou sem enxerto de células e ratos controle ingênuos.
- Raspar a região abdominal e membros posteriores. Limpe a pele com Betadine. Coloque o rato na mesa cirúrgica em decúbito dorsal.
- Incisar a pele do abdómen ventral coxa e interior, no lado direito, usando uma lâmina de # 15.
- Corte através dos stecidos conjuntivos ubcutaneous para expor o conjunto de vasos femorais e nervo usando uma pequena tesoura.
- Separe a artéria femoral da veia eo nervo usando uma pinça fina com ponta curva.
- Coloque três suturas de seda por baixo da artéria e fazer um nó frouxo em cada sutura.
- Aplicar 0,1 ml de lidocaína (2%) para a superfície da artéria para provocar vasodilatação para cateterismo subsequente.
- Fixe o vaso distal com um nó de seda permanente e bloqueio temporário proximal por esticão um fio de seda frouxa.
- Perfurar a artéria utilizando uma agulha curva de calibre 20 e inserir a ponta do cateter telémetro (8 cm de comprimento) utilizando uma ferramenta de inserção do cateter.
- Insira o cateter rostral até 4 centímetros colocando assim a ponta na aorta torácica.
- Ancorar o cateter no interior do vaso, amarrando três suturas de seda em torno da artéria femoral.
- Adicione uma bolsa subcutânea ao longo do flanco entre a extremidade caudal do tórax e tele extensão mais cranial da gama de joelho com uma tesoura sem corte.
- Inserir o corpo do transmissor para o bolso e sutura ao tecido conjuntivo em torno do transmissor a fim de evitar o movimento excessivo.
- Sutura da pele com fio de seda n º 6.
- Injectar (5 ml) de Lactato de Ringer, buprenorfina (0,035 mg / kg), e ampicilina (33 mg / kg) por via subcutânea imediatamente após a cirurgia e manter os ratos em uma incubadora quente até acordado.
3. Basal Pressão Arterial (MAPA) e freqüência cardíaca (FC) de gravação
- Quanto mais cedo um dia após a implantação transmissor, coloque um único animal no bloco receptor e ligue o transmissor. Aguarde cerca de 10-15 min para habituar o animal e estabilizar os parâmetros cardiovasculares.
- Ficha de repouso e MAP HR, que são derivados a partir da pressão de pulso arterial com um sistema computadorizado de aquisição de dados para, pelo menos, 1 hora. Coletar dados a cada 5 segundos.
- Monitorar a umanimais produtores de forma contínua e remover pontos de dados durante a ocorrência de espasmos visíveis. Para cada animal, pontos de dados médios obter valores médios.
4. Colorretal Distensão induzida Disreflexia Autonômica
- Contenha ratos NSC-enxertados ou controle SCI em uma toalha fornecidos com grãos de ração dentro do receptor transmissor. Normalmente, os ratos podem ficar cooperativamente durante o procedimento.
- Inserir um cateter com ponta de balão de látex no reto por cerca de dois centímetros e prenda-o para a cauda com fita 8.
- Ligue o transmissor e esperar por 10-15 min permitindo que a pressão arterial para voltar à pré-inserção da linha de base.
- Induzir a distensão colorectal por inflação do balão, lentamente ao longo de 10 segundos com 1,4 mL de ar para 1 min, para gerar uma pressão de aproximadamente 30 mmHg.
- MAP Record e HR 1 min antes, durante 1 min e 1 min após distensão colorretal; dados de amostra a cada 3 s durante o procedimento de 3 min.
- Execute 2-3 ensaios por animal, com pelo menos 15 min de intervalo de recuperação entre os dois ensaios.
- Animais Overdose (ip) com combinação de anestesia dose dupla descrita acima, se mais nenhuma avaliação. Perfundir animais com soro fisiológico seguido por paraformaldeído a 4%.
- Para cada animal, a média dos valores antes e durante a distensão colorectal, respectivamente; calcular a diferença entre os valores iniciais e PAM e FC mudanças induzidas pela distensão para cada ensaio; média dos 2-3 ensaios obter valores médios.
5. Transmissor Limpeza
- Retire o transmissor do corpo do animal após a anestesia, mas antes da perfusão. Soak imediatamente num copo cheio com água destilada até que a limpeza; evitar a secagem do dispositivo telêmetro.
- Transferir o telémetro de 1% de solução de limpeza enzimática Terg-A-Zyme (10 g / L de água) durante 24 horas à temperatura ambiente.
- Regel a ponta do cateter de transmissor com uma agulha de calibre 30 rombaligado à seringa regel.
- Secar cuidadosamente o transmissor usando um tecido macio dobrado e armazená-lo na bandeja de plástico original.
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Representative Results
Usando a técnica de telemetria acima descrito, registramos com sucesso parâmetros cardiovasculares em medula espinhal de animais feridos. Em animais com só SCI, MAP foi significativamente reduzida enquanto HR aumentou em relação a animais sem tratamento prévio, de acordo com relatórios anteriores 9. Em animais com BS-NSC enxertia, PAM e FC aproximou níveis medidos em animais ingênuos (Figura 2). Durante a distensão colorectal, um rato foi considerado como dysreflexic se o estímulo nocivo produzido um aumento no MAP e uma diminuição no HR 3,8. Hipertensão episódica e bradicardia mediada pelo barorreflexo foram inevitavelmente desencadeada em todos os animais, mas na medida diferiu entre os grupos. Aumento MAP em animais enxertados com BS-NSC era muito inferior (16,9 ± 3,1 mmHg, n = 3) do que os animais com lesão sozinha (64,1 ± 1,6 mmHg, n = 3) (Figura 3). No entanto, a diminuição da FC durante a distensão retal não diferiram significativamente entre o grupos. Como bradicardia é mediada por mecanismos barorreflexo, esta discrepância pode ser devida à reduzida sensibilidade dos barorreceptores após SCI 10. Espasmo ocorreu durante a distensão retal, na maioria dos ratos, independentemente do tratamento.
Após a análise histológica, imunomarcação indicado excelente sobrevida do enxerto na medula espinhal implantados com BS-NSC mas uma lacuna na medula espinhal dos animais controle feridos sem enxerto. NSC fetais preenchido completamente o local da lesão e só foram observadas cavidades menores. Implantes integrado no cinza acolhimento e substância branca tanto rostral e caudal. Um grande número de TH + catecolaminérgicos e 5-HT + serotoninérgicos neurônios foram encontrados dentro de implantes BS-NSC, e numerosos axônios topograficamente inervados neurônios pré-ganglionares simpáticos caudal na coluna célula intermediolateral em longas distâncias (Figura 4). Em contraste, nos animais lesionados sem enxerto, TH + / 5-HT + fIBERS não foram detectados na medula espinhal thoracolumbar abaixo da lesão (não mostrado).
Figura 1:. Diagrama mostrando cateterização da artéria femoral A artéria femoral (A.) é dissecado do nervo (N.) e veia (V.), e depois perfurado com uma agulha curva. O cateter ligado ao transmissor é inserido na artéria, colocando a ponta do cateter ao nível da aorta torácica de gravação cardiovascular (a 4 cm).
Figura 2: MAP Basal e HR recuperar na medula espinhal feridos ratos enxertadas com BS-NSC Em uma coorte representativa (n = 3 / grupo), a gravação de telemetria indica significativamente menor MAP basal e maior FC em ratos com lesão medular e sem tratamento de 10 wee. mf após a lesão (* p <0,05). Em contraste, ambos os parâmetros cardiovasculares recuperar para o nível de ratos sem tratamento prévio com 8 semanas após a BS-NSC enxerto (10 semanas pós-lesão) (ambos p <0,05; ANOVA seguido pelo post hoc de Fisher).
Figura 3: distensão colorretal (CRD) induzida dysreflexic autônomo Disreflexia Autônomo é acionado durante a 1 min CRD em ambos os animais enxertados SCI e BS-NSC, que se manifesta como hipertensão episódica acompanhada por bradicardia.. (A) Em um rato de controlo lesionado, MAP aumenta em cerca de 60 mmHg durante a distensão do cólon. (B) No entanto, o aumento da MAP é fortemente reduzida a 10-20 mmHg em um rato enxertado com BS-NSC.
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Figura 4: Transplantado BS-NSC integrar no adulto hospedeiro espinal medula e diferenciarem-se em neurónios serotonérgicos e catecolaminérgicos (A) Oito semanas após a BS-NSC enxertia, GFP e GFAP dupla imunomarcação demonstra enchimento do local da lesão, com células de GFP marcada implantados em. uma secção longitudinal da medula espinal. (B) Em contraste, existe uma lacuna na espinal medula seccionado sem enxerto. (C, D) de imunomarcação para tirosina hidroxilase (TH) e serotonina (5-HT) e revela muitos neurónios TH positivos de 5-HT no interior do enxerto. (E, F) de enxerto derivadas de TH + e 5-HT + axónios estendem e inervam neurónios pré-ganglionares caudal simpáticas marcadas com Fluorogold na coluna de células intermediolateral. Barras de escala: 1 mm (B), 25 um (D), e de 50 um (F).
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Discussion
Tradicionalmente, um fluido de preenchimento de uma cânula é inserida na artéria e ligada a um transdutor de pressão para registar os parâmetros cardiovasculares como um instantâneo de terminal em cada animal 11. Para monitorar continuamente o desempenho cardiovascular por um longo tempo, os sistemas de rádio-telemetria são empregados em muitos laboratórios. Esta ferramenta mais refinada pode gravar a pressão arterial em animais conscientes e movendo-se livremente. Em comparação com cateteres cheios de fluido, a telemetria é considerada uma técnica mais avançada para avaliar com precisão a função cardiovascular em animais SCI. Apesar de no presente estudo foi implantado um transmissor apenas 1 dia antes da gravação, que podem ser implantados, antes ou depois de SCI para aquisição de dados múltiplos, dependendo dos requisitos experimentais 12. Para a pressão basal de sangue e de RH, ou gravação central ou periférico pode ser alcançado. No entanto, a resposta cardiovascular à distensão colorectal não pode ser detectado pelo método à base de cauda do não-invasivo,nossa experiência. Análise telemétrico recentes verificaram a persistência a longo prazo de hipotensão e taquicardia após alta transecção espinal torácica completa cabo em ratos 9,13. O MAP basal inferior e superior de RH em nossos ratos controle SCI são consistentes com o relatório anterior, utilizando mesma técnica de gravação. Induzida por Colorretal Disreflexia autônomo foi aliviada em ratos que receberam enxerto de células. Com base em nossos evidência histológica, catecolaminérgicos e serotoninérgicos entradas para SPNs em vários segmentos da coluna podem ser responsáveis pelas melhorias fisiológicas.
Transmissor cateterismo é fundamental para o sucesso da implantação e gravação. Em ratos cordão espinal seccionados, o diâmetro da artéria femoral é menor do que o normal devido à falta de funções motoras e sensoriais dos membros posteriores. Paralisia completa geralmente resulta em atrofia muscular. Os cirurgiões podem encontrar a ponta do cateter para ser maior do que a artéria. Neste caso, a aplicação de 2% de lidocaína nasuperfície da artéria provocar vasodilatação permite a ponta do cateter para ser facilmente inserido nos vasos perfurados. Notavelmente, lidocaína vasodilatação induzida por persistir aproximadamente 4-5 min. Assim, punção navio e cateterização deve ser executada tão rapidamente quanto possível. No período de aquisição de dados de parâmetros basais, foram coletados pontos de dados a cada 5 segundos por 1 hora. Durante a gravação rectal induzida por distensão 3 min, no entanto, os dados foram amostrados a cada 3 segundos, de modo a obter mais pontos de dados para uma média mais precisa ao longo deste curto período.
O implante de um cateter na artéria femoral pode interferir com o fornecimento de sangue do membro posterior e induzir a necrose de tecidos, especialmente se a artéria distai é suturada. Selar o ponto de inserção do cateter no interior da artéria, com uma pequena gota de cola de tecidos, em vez de um fio de sutura de seda pode restaurar, pelo menos parcialmente, o fluxo sanguíneo. Desse modo, os animais seria mais saudável para o monitoramento de longo prazo.Alternativamente, o cateter do transmissor pode ser implantado directamente na aorta abdominal colocando o corpo do transmissor dentro da cavidade abdominal. Este método evita a deterioração do tecido no membro posterior ipsilateral mas tem um risco de influenciar a função gastrointestinal.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
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