Summary
We presenteren een protocol voor het gebruik van een radio-telemetriesysteem cardiovasculaire parameters T4 ruggenmerg doorgesneden ratten acht weken na hersenstam embryonale neurale stamcel transplantatie in de laesie te nemen. Telemetrie is een geavanceerde techniek om de cardiovasculaire functie in bewuste vrij bewegende ruggemerglaesie ratten nauwkeurig te evalueren.
Abstract
Thoracale of cervicale dwarslaesie (SCI) kan leiden tot hart-dysfunctie. Cardiovasculaire parameters bewaken we een geïmplanteerde katheter verbonden met een zender in de femorale slagader van ratten die een T4 ruggenmerg doorsnijding ondergaan met of zonder enten van embryonale hersenstam-afgeleide neurale stamcellen tot expressie groen fluorescent eiwit. In vergelijking met andere methoden zoals canule insertie of staart-manchet, telemetrie voordelig continu bewaken van de bloeddruk en hartslag in vrij bewegende dieren. Het kan ook langdurige meerdere data acquisities. In ruggemerglaesie ratten, werden basale cardiovasculaire gegevens onder ongeremde conditie en autonome dysreflexie in reactie op colorectale uitzetting met succes geregistreerd. Bovendien kan cardiovasculaire parameters voor en na SCI vergeleken in dezelfde rat als een zender geïmplanteerd bij een ruggenmerg doorsnijding. Een beperking van de beschreven Telemetry procedure is dat implantatie in de femorale slagader van de bloedtoevoer naar de ipsilaterale achterbeen kunnen beïnvloeden.
Introduction
Cardiovasculaire dysfunctie optreedt na ruggenmergletsel (SCI) op een hoog niveau. Dit manifesteert zich in ongeordende bloeddruk en hartslag in rust, orthostatische hypotensie, oefening geïnduceerde hypotensie en autonome dysreflexie gekenmerkt door episodes van hypertensie en bradycardie baroreflex gemedieerde reactie op sensorische stimuli onder de letselniveau 1,2. Deze symptomen interfereren met het dagelijks functioneren van ruggenmerg gewonde patiënten. Het is dus belangrijk om effectieve middelen te stellen voor het onderzoeken van cardiovasculaire veranderingen bij dieren met SCI en experimentele behandelingen.
Om cardiovasculaire functie bij dieren te onderzoeken, zijn verschillende technieken zijn gebruikt om de bloeddruk en hartslag te controleren. Central cardiovasculaire parameters worden geregistreerd door canule inbrengen en telemetrie, dat invasieve tail-manchetten kunnen worden toegepast perifere bloeddruk meten 3. In vergelijking met andere methoden, telemetrie heeft het grote voordeel dat een ononderbroken opname in vrij bewegende dieren en langdurige controle van cardiovasculaire functie 4. In SCI diermodellen kunnen de veranderingen in perifere bloeddruk na experimenteel stimulatie niet groot genoeg om te worden gedetecteerd. Bijgevolg moet geschikt hartbewaking techniek worden gekozen voor dieren met een dwarslaesie.
In de huidige studie werd een radio-telemetrische systeem ingevoerd om de cardiovasculaire functie bij volwassen ratten te monitoren na volledige ruggenmerg doorsnijding. Ratten kregen enten van syngene rat embryonale dag 14 (E14)-hersenstam afgeleide neurale stamcellen (NSC-BS) in de laesie. Ratten met letsel en zonder transplantatie en naïef, ongedeerd ratten diende als controlegroep. De werkwijze omvat telemetrie zender sterilisatie en implantatie (figuur 1), registratie van basale cardiovasculaire parameters, colorectale distensie geïnduceerde responsen, en zender reiniging enopslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). NIH richtlijnen voor het proefdier zorg en veiligheid worden strikt opgevolgd. Dieren met chirurgische procedures werden adequaat behandeld voor het minimaliseren van pijn en ongemak.
1 Spinal Cord Curgery en Cell enten
- Autoclaaf chirurgische instrumenten voor alle operaties. Gebruik Hot Bead Sterilisator (Fine Science Tools) voor ziekteverwekkers en microbiële verontreinigingen van instrumenten tussen procedures op verschillende dieren te verwijderen. Gebruik steriele chirurgische handschoenen, jurk, en gordijnen tijdens de operatie. Employ aseptische chirurgische techniek voor elke chirurgische ingreep.
- Verdoven vrouwelijke Fischer 344-ratten met een combinatie (2 ml / kg) van ketamine (25 mg / ml), xylazine (1,3 mg / ml), en acepromazine (0,25 mg / ml) toegediend via intraperitoneale injectie (ip).
- Scheer de baklijn en reinig herhaaldelijk de huid met betadine en ethanol.
- Snijd de huid met behulp van een # 10 blad en botweg ontleden spieren lagen. Gebruik een scalpel om de wervels te isoleren, de T3 wervel bloot te leggen, en het uitvoeren van een dorsale laminectomie met een fijne punt rongeurs.
- Incise de dura lengterichting doorsnijden en het ruggenmerg op T4 is via een combinatie van iridectomiescharen en microaspiration tot een ongeveer 1 mm rostrocaudal tussen het ruggenmerg stompen maken.
- Wacht ongeveer 1-2 minuten totdat het bloeden volledig stopt, dan hechtdraad spieren met 3-0 Vycril en sluit de huid met wond clips.
- Injecteer Ringerlactaat (5 ml), buprenorfine (0.035 mg / kg) en ampicilline (33 mg / kg) subcutaan direct na operatie en ratten in een warme incubator handhaven tot wakker.
- Injecteer de Ringer-oplossing en ampicilline eenmaal daags tot 10 dagen, en buprenorfine tweemaal daags gedurende 3 dagen of tot tekenen van pijn en verdriet verdwijnen. Heeft een dier niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren tot fully hersteld.
- Handmatig legen van de blaas twee keer per dag voor ongeveer twee weken tot de oprichting van reflex blaas legen, en leeg de blaas een keer per dag in het hele voortbestaan indien nodig.
- Twee weken later opnieuw verdoven SCI ratten zoals hierboven beschreven en het ruggenmerg laesie opnieuw bloot. Houd de dura gesloten geïmplanteerde cellen in de laesie behouden.
- Injecteer 10 ul van cel-oplossing (3,5 × 10 5 pl), van E14 alomtegenwoordige GFP transgene rat embryo's verzameld en ingebed in fibrinogeen en trombine 5,6, in het epicentrum van de laesie holte en de rostrale en caudale-interface van de laesie met meervoudige injectie plaatsen, met een getrokken glazen micropipet met een inwendige diameter van 40 urn, verbonden met een Hamilton spuit.
- Hecht de spieren lagen en sluit de huid met wond clips.
- Voeren na de operatie injectie en blaas zorg zoals beschreven in de stappen 1,6-1,8.
- Een weekvoorgrond perfusie, injecteer 0,5% Fluorogold (FG, 0.4 ml in gedestilleerd water) intraperitoneaal aan retrograde label sympathische preganglionic neuronen in het ruggenmerg 7.
2 Zender Implantatie
- Geniet transmittersin 2% glutaaraldehyde-oplossing (4 ml 50% glutaraldhyde in 96 ml gedestilleerd water) gedurende ten minste 1-2 uur (tot 10 uur) bij kamertemperatuur sterilisatie.
- Was zenders grondig met steriele 0,9% zoutoplossing 3 keer en bewaar ze in een zoutoplossing tot gebruik (niet meer dan 1 uur).
- Acht weken na de E14 celtransplantatie (10 weken na de verwonding), reanesthetize de ratten die een SCI ondergaan met of zonder cel enten en naïef controle ratten.
- Scheer de buikstreek en achterpoten. Reinig de huid met Betadine. Plaats de rat op de operatietafel in rugligging.
- Incise de huid op de ventrale buik en dijbeen rechts met een # 15 blad.
- Dwars door de subcutaneous bindweefsel om de bundel van femorale vaten en zenuwen met behulp van een klein schaartje bloot.
- Scheid de dijbeenslagader uit de ader en de zenuw met een fijn pincet met gebogen tips.
- Leg drie zijden hechtdraden onder de slagader en een losse knoop in elke hechtdraad.
- Breng 0,1 ml lidocaïne (2%) op het oppervlak van de slagader om vaatverwijding te wekken voor daaropvolgende katheterisatie.
- Zet het vat distaal met een permanente zijde knoop en tijdelijke blok proximaal door het rekken een losse zijden hechtdraad.
- Punctie de slagader met een 20 gauge naald gebogen en steek de punt van de catheter afstandsmeter (8 cm lang) met een catheter inbrengen tool.
- Plaats de katheter rostraal tot 4 cm daardoor dat de tip in de thoracale aorta.
- Veranker de katheter in het vat door koppelverkoop drie zijden hechtingen rond de slagader.
- Maak een subcutane pocket langs de flank tussen de caudale rand van de ribbenkast en thij het meest craniale uitbreiding van het bereik knie met een botte schaar.
- Plaats de transmitter lichaam in de zak en hechting aan het bindweefsel rond de transmitter overmatige beweging voorkomen.
- Hechten van de huid met nr 6 zijden draad.
- Injecteer Ringerlactaat (5 ml), buprenorfine (0.035 mg / kg) en ampicilline (33 mg / kg) subcutaan direct na operatie en ratten in een warme incubator handhaven tot wakker.
3 Basale gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP) en hartslag (HR) Opname
- Zo vroeg als een dag na de implantatie zender, zet een enkel dier op de ontvanger pad en zet de zender op. Wacht ongeveer 10 - 15 min aan het dier gewennen en stabilisering van de cardiovasculaire parameters.
- Record rusten MAP en HR, die zijn afgeleid van de puls arteriële druk met een geautomatiseerd gegevensverzamelsysteem ten minste 1 uur. Verzamelen van gegevens om de 5 sec.
- Toezicht houden op de eenij dieren continu en datapunten te verwijderen tijdens het optreden van zichtbare spasmen. Voor elk dier, gemiddelde datapunten om gemiddelde waarden te verkrijgen.
4 Colorectale Distensie-geïnduceerde autonome dysreflexie
- Bedwingen NSC-geënt of SCI controle ratten in een met voedsel pellets binnen op de zender-ontvanger geleverd handdoek. Meestal ratten kunnen coöperatief blijven tijdens de procedure.
- Plaats een latex ballon katheter in het rectum voor ongeveer 2 cm en zet deze vast aan de staart met tape 8.
- Zet de zender aan en wacht 10 - 15 min waardoor de bloeddruk te keren naar pre-insertie baseline.
- Induceren colorectale distensie door inflatie van de ballon langzaam gedurende 10 sec met 1,4 ml lucht gedurende 1 min, met een druk van ongeveer 30 mmHg genereren.
- Record MAP en HR 1 min voor, 1 min tijdens en 1 min na colorectale buik; sample data om de 3 sec tijdens de 3 min procedure.
- Presteren 2-3 proeven per dier met ten minste 15 min herstel interval tussen twee studies.
- Overdosering dieren (ip) met dubbele dosis verdoving combinatie boven als er geen verdere evaluatie beschreven. Perfuseren dieren met zoutoplossing gevolgd door 4% paraformaldehyde.
- Voor elk dier, het gemiddelde van de waarden voor en tijdens respectievelijk colorectale buik; bereken het verschil tussen de basislijn en de-buik geïnduceerde MAP en HR veranderingen voor elk onderzoek; gemiddelde over de 2-3 proeven om gemiddelde waarden te verkrijgen.
5 Zender Cleaning
- Verwijder de zender uit het dierlijk lichaam na de anesthesie, maar voordat perfusie. Onmiddellijk weken in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water tot reiniging; voorkomen drogen van de afstandsmeter apparaat.
- Breng de afstandsmeter tot 1% Terg-A-Zyme enzymatische reinigingsoplossing (10 g / l water) gedurende 24 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Regel de punt van zender katheter met een stompe 30 gauge naaldverbonden met de Regel spuit.
- Droog zorgvuldig de zender met behulp van een gevouwen weke delen en op te slaan in de originele plastic bakje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de hierboven beschreven telemetrie techniek we succesvol geregistreerd cardiovasculaire parameters in ruggemerglaesie dieren. Bij dieren met een dwarslaesie alleen, werd MAP aanzienlijk verminderd, terwijl HR toegenomen ten opzichte van naïeve dieren, in overeenstemming met eerdere rapporten 9. Bij dieren met BS-NSC enten, MAP en HR benaderd niveaus gemeten in naïeve dieren (figuur 2). Tijdens colorectale distensie, werd een rat geacht dysreflexic wanneer de schadelijke stimulatie produceerde een toename van MAP en een afname HR 3,8. Episodische hypertensie en-baroreflex gemedieerde bradycardie werden onvermijdelijk veroorzaakt bij alle dieren, maar de mate verschilden tussen de groepen. MAP toename bij dieren geënt met BS-NSC was veel lager (16,9 ± 3,1 mmHg, n = 3) dan dieren met letsel ook (64,1 ± 1,6 mmHg, n = 3) (figuur 3). Echter, de daling van de HR tijdens colorectale buik verschilde niet significant tussen de groeps. Bradycardie wordt gemedieerd door baroreflex mechanismen, kan deze discrepantie te wijten zijn aan verminderde gevoeligheid van baroreceptoren na SCI 10. Spasmen opgetreden tijdens colorectale distensie meeste ratten ongeacht de behandeling.
Bij histologisch onderzoek, immunolabeling aangegeven uitstekende graft survival in het ruggenmerg geïmplanteerd met BS-NSC's, maar een gat in het ruggenmerg van de gewonde controle dieren zonder transplantaat. Foetale NSC volledig gevuld de laesie en slechts kleine holtes werden waargenomen. Implantaten geïntegreerd in de gastheer grijze en witte stof zowel rostraal en caudaal. Een groot aantal TH + catecholaminerge en 5-HT + serotonerge neuronen binnen BS-NSC implantaten en vele axons topografisch geïnnerveerd caudale preganglionic sympathische neuronen in de intermediolateral cel kolom over lange afstanden (figuur 4). Daarentegen gewonde dieren zonder graft, TH + / 5-HT + fIBERS niet in thoracolumbar ruggenmerg onder de laesie gedetecteerd (niet getoond).
Figuur 1:. Schematische weergave van catheterisatie van de slagader Het femoralis (A.) wordt doorsneden van de zenuw (N.) en ader (V.), en vervolgens doorboord met een gebogen naald. De katheter verbonden met de zender wordt ingebracht in de slagader, dat de tip van de katheter ter hoogte van de thoracale aorta cardiovasculaire opname (ongeveer 4 cm).
Figuur 2: Basal MAP en HR herstellen ruggemerglaesie ratten geënt met BS-NSC In een representatieve cohort (n = 3 / groep), telemetrie opname geeft significant lagere basale MAP en HR hoger in ratten met SCI en geen behandeling 10 wee. ks na een blessure (* p <0,05). Daarentegen zowel cardiovasculaire parameters herstellen tot het niveau van naïeve ratten 8 weken na BS-NSC enting (10 weken na het letsel) (beide p> 0,05, ANOVA gevolgd door Fisher's post hoc).
Figuur 3: Colorectale uitzetting (CRD) geïnduceerde autonome dysreflexic Autonome dysreflexie wordt geactiveerd tijdens een 1 min CRD in zowel SCI en BS-NSC geënte dieren, gemanifesteerd als episodische hypertensie gepaard met bradycardie.. (A) In een gewonde plaagdierbestrijding, MAP neemt toe met ongeveer 60 mmHg tijdens colon buik. (B) De toename van MAP sterk verlaagd tot 10 - 20 mmHg in een rat geënt met BS-NSC.
14 / 51914fig4highres.jpg "/>
Figuur 4: Geënt BS-NSC integreren in het ruggenmerg gastheer volwassene en differentiëren in catecholaminerge en serotonerge neuronen (A) Acht weken na BS-NSC enten, GFP en GFAP dubbele immunokleuring toont vulling van de laesie met geïmplanteerde GFP gemerkte cellen. een longitudinale ruggenmerg sectie. (B) daarentegen een kloof bestaat in een doorgesneden ruggenmerg zonder graft. (C, D) immunokleuring voor tyrosine hydroxylase (TH) en serotonine (5-HT) openbaart vele TH en 5-HT positieve neuronen in graft. (E, F) Graft-afgeleide TH + en 5-HT + axonen breiden en innerveren caudale sympathieke preganglionic neuronen gelabeld met Fluorogold in de intermediolateral cel kolom. Schaalbalken: 1 mm (B), 25 pm (D) en 50 urn (F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditioneel wordt een vloeistof gevulde canule in de slagader ingebracht en verbonden met een druktransductor cardiovasculaire parameters opnemen als terminal momentopname in elk dier 11. Om continu te controleren cardiovasculaire prestaties voor een lange tijd, zijn radio-telemetrische systemen gebruikt in veel laboratoria. Deze meer verfijnde tool kan de bloeddruk in de bewuste opname, vrij bewegende dieren. Vergeleken met vloeistof gevulde katheters, wordt telemetrie beschouwd als een meer geavanceerde techniek om de cardiovasculaire functie nauwkeurig te evalueren in SCI dieren. Hoewel in de onderhavige studie een zender geïmplanteerd slechts 1 dag vóór opname kan het worden geïmplanteerd voor of na SCI voor meerdere data acquisitie afhankelijk van de experimentele 12 behoeften. Voor basale bloeddruk en HR, centrale of perifere opname kan worden bereikt. Echter, kunnen cardiovasculaire respons op colorectale uitzetting niet worden gedetecteerd door niet-invasieve staart-cuff-gebaseerde methode inonze ervaring. Recente telemetrische analyse gecontroleerd op de lange termijn voortbestaan van hypotensie en tachycardie na volledige thoracale ruggenmerg doorsnijding bij ratten 9,13. De lagere basale MAP en hogere HR in onze SCI controle ratten zijn in overeenstemming met eerdere rapport met dezelfde opname techniek. -Colorectale geïnduceerde autonome dysreflexie werd verlicht in ratten die cel transplantaat ontvangen. Op basis van onze histologisch bewijs, catecholaminerge en serotonerge ingangen naar SPN over meerdere segmenten spinale kan verantwoordelijk zijn voor de fysiologische verbeteringen.
Zender catheterisatie is cruciaal voor een succesvolle implantatie en opnemen. In ruggenmerg doorgesneden ratten, de diameter van de femorale slagader kleiner dan gewoonlijk door het ontbreken van motorische en sensorische functie van de achterpoten. Volledige verlamming resulteert meestal in spieratrofie. Chirurgen kunnen de punt van de katheter voorbeeld groter dan de slagader. In dit geval, toepassing 2% lidocaïne opoppervlak van de slagader opwekken vaatverwijding maakt de punt van de katheter gemakkelijk worden ingebracht in de lekke vaten. Met name lidocaïne-geïnduceerde vasodilatatie blijft ongeveer 4-5 min. Daarom moet verblijf puncties en catheterisatie zo snel mogelijk worden uitgevoerd. In de periode van gegevensverzamelings basale parameters, we datapunten verzameld om de 5 seconden gedurende 1 uur. Tijdens de 3 min colorectale uitrekking geïnduceerde opname echter gegevens werden bemonsterd om de 3 seconden teneinde meer datapunten krijgen een nauwkeuriger middeling gedurende deze korte periode.
Implantatie van een catheter in de femorale slagader kunnen interfereren met de bloedtoevoer van het achterbeen en induceren weefselnecrose, vooral als het distale slagader gehecht. Afdichten van de katheter invoegpositie in de slagader met een druppeltje lijm weefsel in plaats van een zijden hechtdraad kan tenminste gedeeltelijk is bloedstroom. Daardoor zouden de dieren gezonder voor langdurige bewaking.Als alternatief kan de katheter van de zender direct geïmplanteerd in de abdominale aorta plaatsen van de transmitter lichaam in de buikholte. Deze werkwijze voorkomt weefselverval in de ipsilaterale achterbeen maar een risico beïnvloeden gastro-intestinale functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
- Krassioukov, A. V., Furlan, J. C., Fehlings, M. G. Autonomic dysreflexia in acute spinal cord injury: an under-recognized clinical entity. J Neurotrauma. 20, 707-716 (2003).
- Lindan, R., Joiner, E., Freehafer, A. A., Hazel, C. Incidence and clinical features of autonomic dysreflexia in patients with spinal cord injury. Paraplegia. 18, 285-292 (1980).
- Inskip, J. A., Ramer, L. M., Ramer, M. S., Krassioukov, A. V. Autonomic assessment of animals with spinal cord injury: tools, techniques and translation. Spinal Cord. 47, 2-35 (2009).
- Mayorov, D. N., Adams, M. A., Krassioukov, A. V. Telemetric blood pressure monitoring in conscious rats before and after compression injury of spinal cord. J Neurotrauma. 18, 727-736 (2001).
- Hou, S., Tom, V. J., Graham, L., Lu, P., Blesch, A. Partial restoration of cardiovascular function by embryonic neural stem cell grafts after complete spinal cord transection. J Neurosci. 33, 17138-17149 (2013).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Akhavan, M., Hoang, T. X., Havton, L. A. Improved detection of fluorogold-labeled neurons in long-term studies. J Neurosci Methods. 152, 156-162 (2006).
- Maiorov, D. N., Fehlings, M. G., Krassioukov, A. V. Relationship between severity of spinal cord injury and abnormalities in neurogenic cardiovascular control in conscious rats. J Neurotrauma. 15, 365-374 (1998).
- Laird, A. S., Carrive, P., Waite, P. M. Cardiovascular and temperature changes in spinal cord injured rats at rest and during autonomic dysreflexia. J Physiol. 577, 539-548 (2006).
- Phillips, A. A., Krassioukov, A. V., Ainslie, P. N., Warburton, D. E. Baroreflex function after spinal cord injury. J Neurotrauma. 29, 2431-2445 (2012).
- Osborn, J. W., Taylor, R. F., Schramm, L. P. Determinants of arterial pressure after chronic spinal transection in rats. Am J Physiol. 256, 666-673 (1989).
- Rabchevsky, A. G., et al. Effects of gabapentin on muscle spasticity and both induced as well as spontaneous autonomic dysreflexia after complete spinal cord injury. Front Physiol. 3, 329 (2012).
- Hou, S., Lu, P., Blesch, A. Characterization of supraspinal vasomotor pathways and autonomic dysreflexia after spinal cord injury in F344 rats. Auton Neurosci. 176, 54-63 (2013).
