En Radio-telemetrisk system for å overvåke kardiovaskulær funksjon i rotter med ryggmargstran og Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Summary

Vi presentere en protokoll for å bruke en radio-telemetrisk system for å registrere kardiovaskulære parametre i T4 ryggmargs transektert rotter åtte uker etter embryonale hjernestammen nevrale stamceller pode inn i lesjonen nettstedet. Telemetri er en avansert teknikk for å vurdere nøyaktig kardiovaskulær funksjon i bevisste fritt bevegelige ryggmargs skadde rotter.

Abstract

Høy thorax eller cervical ryggmargsskade (SCI) kan føre til hjerte-dysfunksjon. For å overvåke kardiovaskulære parametre, implanterte vi et kateter som er koblet til en radiosender i den femorale arterien hos rotter som gjennomgikk en T4 ryggmarg transeksjon med eller uten poding av embryonale hjerneavledet nevrale stamceller som uttrykker grønt fluorescerende protein. Sammenlignet med andre metoder som kanyle innsetting eller hale-cuff, er telemetri fordel å kontinuerlig overvåke blodtrykk og hjertefrekvens i fritt bevegelige dyr. Det er også i stand langsiktige flere data oppkjøp. I ryggmargs skadet rotter ble basal hjerte-data i henhold til hemningsløs tilstand og autonom dysrefleksi i respons til kolorektal distensjon vellykket registrert. I tillegg kan kardiovaskulære parametere før og etter SCI sammenlignes i samme rotte hvis en sender er implantert før en ryggmarg transeksjon. En begrensning av den beskrevne telemetry fremgangsmåte er at implantasjon i den femorale arterien kan påvirke blodtilførselen til den ipsilaterale bakben.

Introduction

Kardiovaskulær dysfunksjon oppstår etter ryggmargsskade (SCI) på høye nivåer. Det er manifestert i uordnede blodtrykk og hjertefrekvens ved hvile, ortostatisk hypotensjon, anstrengelsesutløst hypotensjon, og autonom dysrefleksi preget av episoder av hypertensjon og baroreflex-mediert bradykardi respons på sensoriske stimuli under skadenivået ^1,2. Disse symptomene forstyrrer dagliglivet av ryggmargs skadde pasienter. Således er det viktig å etablere effektive verktøy for undersøkelse av kardiovaskulære endringer i dyr med SCI og eksperimentelle behandlinger.

For å undersøke kardiovaskulær funksjon i dyr, er flere teknikker blitt brukt for å overvåke blodtrykket og hjertefrekvensen. Sentrale kardiovaskulære parametre kan tas opp av kanyle innsetting og telemetri, mens ikke-invasive hale-mansjetter kan brukes til å måle perifert blodtrykk ^tre. Sammenlignet med andre metoder, telemetry har den viktigste fordelen at det gir mulighet for kontinuerlig opptak i fritt bevegelige dyr og langsiktig overvåking av kardiovaskulær funksjon ^fire. I SCI dyremodeller, kan endringene i perifert blodtrykk etter eksperimentell stimulering ikke være stor nok til å bli detektert. Følgelig bør egnet hjerteovervåkning teknikk velges for dyr med SCI.

I denne studien ble en radio-telemetrisk system innført for å overvåke kardiovaskulær funksjon hos voksne rotter etter komplett ryggmargstran. Rotter fikk grafts av syngene rotte embryonale dag 14 (E14) hjernestammen-avledet nevrale stamceller (BS-NSCs) i lesjonen nettstedet. Rotter med skade og ingen transplantasjon og naiv, uskadd rotter fungerte som kontroller. Fremgangsmåten i telemetri-senderen omfatter sterilisering og implantasjon (figur 1), opptak av basale hjerte-parameter, kolorektal distensjon-induserte responser, og senderen og rengjøringlagring.

Protocol

Alle dyre protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC). NIH retningslinjer for forsøksdyr omsorg og sikkerhet følges nøye. Dyr med kirurgiske prosedyrer ble tilstrekkelig behandlet for å minimere smerte og ubehag.

1. Spinal Cord Curgery og Cell Negl

1. Autoklav kirurgiske instrumenter før alle operasjoner. Bruk Hot Bead Sterilizer (Fine Science Tools) for å fjerne patogener og mikrobielle forurensninger fra instrumenter mellom prosedyrer på forskjellige dyr. Bruk sterile kirurgiske hansker, kappe, og gardiner under operasjonen. Ansett aseptisk kirurgisk teknikk for hver kirurgiske prosedyren.
2. Bedøve hunn Fischer 344 rotter med en kombinasjon (2 ml / kg) av ketamin (25 mg / ml), xylazin (1,3 mg / ml) og acepromazin (0,25 mg / ml) administrert via intraperitoneal injeksjon (ip).
3. Barbere tilbake området og rengjør huden gjentatte ganger med Betadine og etanol.
4. Skjær huden ved hjelp av en # 10 blad og uten omsvøp dissekere muskler lag. Bruk en skalpell til å isolere ryggvirvlene, utsett T3 virvelen, og utføre en dorsal laminektomi ved hjelp av en tynn rongeurs.
5. Incise dura langs og tversgående ryggmargen på T4 nivå ved hjelp av en kombinasjon av iridectomy saks og microaspiration å skape en ca 1 mm rostrocaudal gap mellom de ryggmargs stubber.
6. Vent ca 1 - 2 minutter inntil blødnings fullt stopper, sutur muskler med 3-0 Vycril og lukke huden med sår klipp.
7. Injisere Ringer-laktat (5 ml), buprenorfin (0,035 mg / kg), og Ampicillin (33 mg / kg) subkutant umiddelbart etter operasjonen og opprettholde rotter i en varm kuvøse inntil våken.
8. Injisere Ringers og Ampicillin løsning en gang daglig i opptil 10 dager, og buprenorfin to ganger daglig i 3 dager eller til tegn på smerte og ubehag forsvinne. Ikke returner et dyr til selskap med andre dyr før fully gjenvunnet.
9. Manuelt tømme blæren to ganger daglig i to uker før etablering av refleks tømming av urinblæren, og deretter tømme blæren gang om dagen i løpet av overlevelse om nødvendig.
10. To uker senere re-bedøve SCI rotter som beskrevet ovenfor og re-eksponere ryggmargen lesjon området. Hold dura lukket for å beholde implanterte celler i lesjon området.
11. Injisere 10 mL av celle-løsning (3,5 × 10 ⁵ mL), samlet inn fra E14 stedsnærværende GFP transgen rotte embryoer og innebygd i fibrinogen og trombin ^5,6, i episenteret av lesjon hulrom og rostral og hale grensesnitt av lesjon med flere injeksjon sider, ved hjelp av et trukket glass mikropipette med en indre diameter på 40 um, som er koblet til en Hamilton sprøyte.
12. Suturer muskellagene og lukke huden med sår klipp.
13. Utfør innlegg kirurgi injeksjon og blære seg som beskrevet i trinn 1.6 til 1.8.
14. En uke væreforgrunnen perfusjon, injisere 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml i destillert vann) intraperitonealt til retrogradely label sympatiske preganglionic nevroner i ryggmargen ^7.

2. Sender Implantasjon

1. Sug transmittersin 2% glutaraldehyd-oppløsning (4 ml av 50% glutaraldhyde i 96 ml destillert vann) i minst 1 - 2 timer (inntil 10 timer) ved romtemperatur for sterilisering.
2. Vask sendere grundig med sterilt 0,9% saltvann tre ganger, og lagrer dem i saltløsning inntil bruk (ikke mer enn 1 time).
3. Åtte uker etter at E14 celletransplantasjon (10 uker etter skade), reanesthetize rottene som gjennomgikk en SCI med eller uten celle pode og naive kontroll rotter.
4. Barbere mageområdet og bakbena. Rengjør huden med Betadine. Plasser rotte på kirurgisk bordet i liggende stilling.
5. Langsgående snitt i huden på den ventrale del av magen og innsiden av låret på høyre side ved hjelp av en # 15 blad.
6. Skjær gjennom subcutaneous bindevev å avsløre bunt av femoral fartøy og nerve med en liten saks.
7. Separer lårarterien fra venen og nerve ved hjelp av en fin pinsett med buet tips.
8. Sette tre silke suturer under arterie og en løs knute i hver sutur.
9. Påfør 0,1 ml lidokain (2%) til overflaten av arterien for å fremkalle vasodilatasjon for påfølgende kateterisering.
10. Sikre fartøyet distalt med en permanent silke knute og midlertidig blokk proksimalt ved å strekke en løs silke sutur.
11. Punkter arterien ved hjelp av en 20 gauge nål og buet inn tuppen av kateteret telemeter (8 cm) ved bruk av et kateter innsettingsverktøyet.
12. Sett inn kateteret rostrally opp til 4 cm og dermed plassere spissen i thorakalaorta.
13. Feste kateteret inne i karet ved å knytte tre silke suturer rundt lårarterien.
14. Lag en subkutan lomme langs flanken mellom hale kanten av brystkasse og than mest kranie forlengelse av kneet utvalg med en sløv saks.
15. Sett senderen organ inn i lommen og sutur i bindevevet som omgir senderen for å unngå overdreven bevegelse.
16. Suturer huden med No. 6 silketråd.
17. Injisere Ringer-laktat (5 ml), buprenorfin (0,035 mg / kg), og Ampicillin (33 mg / kg) subkutant umiddelbart etter operasjonen og opprettholde rotter i en varm kuvøse inntil våken.

3. Basal gjennomsnittlig arterietrykk (MAP) og hjertefrekvens (HR) Opptak

1. Så tidlig som i én dag etter implantering senderen, sette et enkelt dyr på mottakerplaten og slå på senderen. Vente på rundt 10 - 15 min å tilvenne dyret og stabilisere kardiovaskulære parametre.
2. Record hvile MAP og HR, som er utledet fra puls arterietrykk med et datamaskinelt datafangstsystem i minst 1 time. Samle inn data hver 5 sek.
3. Overvåke enimals kontinuerlig og fjerne datapunkter i løpet av forekomsten av synlige spasmer. For hvert dyr, til gjennomsnittlig datapunkter oppnå gjennomsnittsverdier.

4. Colorectal distensjon-indusert Autonom dysrefleksi

1. Beherske NSC-podet eller SCI kontroll rotter i et håndkle som følger med mat pellets inne på senderen mottakeren. Vanligvis rotter kan bo samarbeide under prosedyren.
2. Sett inn en latex ballong-tipped kateter inn i endetarmen for ca 2 cm, og fest den til halen med tape ^åtte.
3. Slå senderen på og vente i 10 - 15 min slik at blodtrykket å gå tilbake til preinsertion baseline.
4. Fremkall kolorektal distensjon ved inflasjon av ballongen langsomt i løpet av 10 sekunder med 1,4 ml luft i 1 min, for å generere et trykk på ca 30 mm Hg.
5. Record MAP og HR 1 min før, 1 min under, og 1 min etter kolorektal distensjon; eksempeldata hver 3 sek i løpet av 3 min prosedyre.
6. Utfør 2 - 3 forsøk per dyr med minst 15 min utvinning intervallet mellom to forsøk.
7. Overdose dyr (IP) med dobbel dose bedøvelse kombinasjon beskrevet ovenfor hvis ingen ytterligere evaluering. Perfuse dyr med saltvann, etterfulgt av 4% paraformaldehyd.
8. For hvert dyr, gjennomsnittlig verdiene før og under kolorektal distensjon henholdsvis; beregne forskjellen mellom baseline og oppblåsthet-indusert MAP og HR endringer for hvert forsøk; gjennomsnitt over de 2 - 3 forsøk for å få middelverdier.

5. Sender Rengjøring

1. Fjern senderen fra dyrekroppen etter anestesi, men før perfusjon. Sug umiddelbart i et beger fylt med destillert vann til rengjøring; unngå uttørking av telemeter-enheten.
2. Overfør telemeter til 1% Terg-A-Zyme enzymatiske rengjøringsløsning (10 g / l vann) i 24 timer ved romtemperatur.
3. Regel spissen av senderen kateter med en stump 30 gauge nålkoblet til Regel sprøyten.
4. Tørke nøye senderen ved hjelp av en foldet bløtvev og lagre den i den opprinnelige plast skuffen.

Representative Results

Ved hjelp av den ovenfor beskrevne telemetri-teknikk, har vi lykkes registrert kardiovaskulære parametre i ryggmargs skadde dyr. Hos dyr med SCI alene, ble MAP betydelig redusert, mens HR økt sammenlignet med naive dyr, i samsvar med tidligere rapporter ^ni. Hos dyr med BS-NSC pode, MAP og HR nærmet nivåer målt i naive dyr (figur 2). Under kolorektal distensjon, ble en rotte ansett som dysreflexic hvis ubehagelig stimulering produsert en økning i MAP og en nedgang i HR ^3,8. Episodisk hypertensjon og baroreflex-mediert bradykardi ble uunngåelig utløst i alle dyr, men i hvilken grad skilte mellom gruppene. MAP økning i dyr podet med BS-NSCs var mye lavere (16,9 ± 3,1 mmHg, n = 3) enn dyr med skade alene (64,1 ± 1,6 mmHg, n = 3) (figur 3). Men nedgangen i HR under kolorektal distensjon ikke signifikant forskjellig mellom gruppens. Som bradykardi er mediert av baroreflex mekanismer, kan dette avviket skyldes nedsatt følsomhet for baroreceptors etter SCI ^10. Spasm skjedde under kolorektal distensjon i de fleste rotter uavhengig av behandling.

Ved histologisk analyse, immunolabeling indikert utmerket graft overlevelse i ryggmargen implantert med BS-NSCs men et gap i ryggmargen av skadde kontrolldyrene uten pode. Foster NSCs helt fylt lesjon området og kun små hulrom ble observert. Implantater integreres i verts grå og hvit substans både rostrally og caudally. Et stort antall TH ⁺ catecholaminergic og 5-HT ⁺ serotonerge nevronene ble funnet i BS-NSC implantater, og mange aksoner topografisk innerverte kaudale sympatiske preganglionic nevroner i intermediolateral celle kolonnen over lange avstander (figur 4). I kontrast, i skadde dyr uten transplantat, TH ⁺ / 5-HT ⁺ fibers ble ikke oppdaget i thoracolumbar ryggmargen under lesjon (ikke vist).

Figur 1:. Diagram som viser kateterisering av den femorale arterie lårarterie (A.) blir dissekert fra nerve (N.) og vene (V.), og deretter punktert med en buet nål. Kateteret er koblet til senderen settes inn i arterien, å plassere spissen av kateteret på nivået av den torakale aorta for hjerte-opptak (~ 4 cm).

Figur 2: Basal MAP og HR gjenopprette i ryggmargs skadet rotter podet med BS-NSCs I en representativ kohort (n = 3 / gruppe), indikerer telemetri opptak betydelig lavere basal MAP og høyere HR hos rotter med ryggmargsskade og ingen behandling 10 wee. ks etter skade (* p <0,05). I kontrast til begge kardiovaskulære parametre gjenopprette til nivået av naive rotter 8 uker etter BS-NSC poding (10 uker etter skade) (begge p> 0,05, ANOVA etterfulgt av Fishers post hoc).

Figur 3: Colorectal distensjon (CRD) -indusert autonom dysreflexic Autonom dysrefleksi utløses under en 1 min CRD i både SCI og BS-NSC podet dyr, manifestert som episodisk hypertensjon ledsaget av bradykardi.. (A) I en skadet kontroll rotte, MAP øker med ca 60 mmHg under kolon distensjon. (B) Men økningen av MAP er sterkt redusert til 10 - 20 mmHg i en rotte podet med BS-NSCs.

14 / 51914fig4highres.jpg "/>
Figur 4: Podet BS-NSCs integreres i verts voksen ryggmarg og differensieres til catecholaminergic og serotonerge nevroner (A) Åtte uker etter BS-NSC pode, GFP og GFAP dobbel immunolabeling demonstrerer fylling av lesjon området med implanterte GFP merket celler i. en langsgående ryggmargen delen. (B) I motsetning til dette eksisterer et gap i en transektert ryggmarg uten transplantat. (C, D) immunolabeling for tyrosin hydroksylase (TH) og serotonin (5-HT) åpenbarer mange TH og 5-HT-positive neuroner i løpet av pode. (E, F) Graft-avledet TH ⁺ og 5-HT ⁺ axoner forlenge og innerverer kaudal sympatiske neuroner preganglionic merket med Fluorogold i intermediolateral cellekolonne. Skala bar: 1 mm (B), 25 um (d), og 50 um (F).

Discussion

Tradisjonelt er en væskefylt kanyle settes inn i arterien og forbundet til en trykktransduser for å registrere kardiovaskulære parametre som en terminal øyeblikksbilde i hvert dyr ^11. For å kontinuerlig overvåke hjerteytelse for en lang tid, er radio-telemetrisk system anvendes i mange laboratorier. Dette mer raffinert verktøy kan ta opp blodtrykket hos bevisst, fritt bevegelige dyr. Sammenlignet med væskefylte katetre, er telemetri ansett som en mer avansert teknikk for å vurdere nøyaktig kardiovaskulær funksjon i SCI dyr. Selv om det i den foreliggende studie ble en sender implantert bare 1 dag før opptaket, kan det bli implantert før eller etter SCI for flere datainnhenting, avhengig av de eksperimentelle ¹² kravene. For basale blodtrykk og HR, enten sentralt eller perifert opptak kan oppnås. Imidlertid kan kardiovaskulær respons til kolorektal distensjon ikke bli oppdaget av ikke-invasiv hale-mansjett-metode basertvår erfaring. Nylige telemetrisk analyse bekreftet den langsiktige utholdenhet av hypotensjon og takykardi etter fullstendig høy thorax ryggmargen tran hos rotter ^9,13. Den nedre basal MAP og høyere HR i våre SCI kontroll rotter er i samsvar med tidligere rapport med samme opptaksteknikk. Kolorektal-indusert autonom dysrefleksi ble mildnet hos rotter som fikk celle pode. Basert på våre histologiske tegn, catecholaminergic og serotonerge innganger til SPNer tvers av flere spinal segmenter kan forklare de fysiologiske forbedringer.

Senderen kateterisering er avgjørende for vellykket implantasjon og opptak. I ryggmargen transektert rotter, er diameteren av lårarterie mindre enn vanlig på grunn av mangel på motorisk og sensorisk funksjon av bakbena. Fullstendig lammelse resulterer vanligvis i muskelatrofi. Kirurger finner tuppen av kateteret for å være større enn den arterie. I dette tilfellet å anvende 2% lidokain ioverflaten av arterien som fremkalte vasodilatasjon tillater spissen av kateteret for å være lett settes inn i det punkterte fartøy. Spesielt, vedvarer lidokain indusert-vasodilatasjon ca 4 - 5 minutter. Således bør fartøyet punktering og kateterisering utføres så raskt som mulig. I perioden med datainnsamling av basale parametere, vi samlet datapunkter hver 5 sek for 1 hr. I løpet av 3 min kolorektal distensjon-indusert opptak, men data var samplet hver 3 sek for å oppnå flere datapunkter for en mer nøyaktig snitt gjennom denne korte perioden.

Implantering av et kateter i lårarterien kan forstyrre tilførselen av bakben blod og indusere vevsnekrose, spesielt hvis den distale lunge sutureres. Tetting av kateterinnføringspunktet inn i arterien med en liten dråpe av vevslim i stedet for en silke sutur kan i det minste delvis å gjenopprette blodstrømmen. Dermed ville dyr være sunnere for langsiktig overvåking.Alternativt kan kateteret til senderen implanteres direkte i den abdominale aorta plassere senderen organ inn i bukhulen. Denne metoden unngår vev råte i ipsilaterale bakben, men har en risiko for å påvirke gastrointestinal funksjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension