Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Glutamat-receptorer medierar majoriteten av excitatorisk synaptisk transmission vid centrala nervsystemet synapser. De två viktiga subtyper av jonotropiska glutamatreceptorer lokaliserade i ryggrad huvudet av det postsynaptiska membranet är N-metyl-D-aspartat (NMDA) och α-amino-3-hydroxi-5-metylisoxazol-4-proprionsyra (AMPA) receptorer. Vid vila membranpotentialer, AMPA receptorer bär de flesta av de postsynaptiska ström under synaptisk transmission. I hippocampus spelar NMDA-receptorn en viktig roll för att utlösa förändringar i antalet AMPA-receptorer i postsynaptiska membranet: genom att agera som en "tillfällighet detektor" 1 för att initiera förändringar i synaptisk styrka 1, deltar NMDA-receptorn i synaptiska mekanismerna som är tänkt att stödja inlärning och minne på en subcellulär nivå. Som svar på depolarisering av den postsynaptiska neuron parallellt med frisläppandet presynaptisk sändare, går kalcium via NMDAreceptor att inleda AMPA receptor insättning eller borttagning 2. Dessa receptordynamik ligger bakom synaps plasticitet: en ökning av synaptisk styrka är långsiktig potentiering 2,3 (LTP), medan en minskning i synaptisk styrka är långvarig depression 4 (LTD). Därför AMPA-receptorrörelse tros vara ansvarig för synaptisk plasticitet uttryck, medan NMDA-receptorer tros reglera sin induktion.
Fastställande av exakta mekanismerna synaptisk transmission och plasticitet underliggande kräver att studera små populationer av synapser, helst enstaka synapser. Medan vissa synapser är mycket lämpad för studier på denna nivå, till exempel, den Calyx av Held 5, för de flesta synaptiska populationer detta är extremt svårt på grund av de små och diffusa karaktären av de synapsförbindelser. Två större elektrofysiologiska tekniker har utvecklats för att undersöka enskilda synapsförbindelser: Den första är minimal stimulans, where en presynaptisk fiber antas stimuleras extracellulärt. Den andra tekniken är parad inspelningar, där två samtidiga hela cell inspelningar från synaptically anslutna nervceller utförs. En stor fördel med minimal stimulering är att den är snabb och relativt enkla att utföra, som involverar placering av en extracellulär stimulerande elektrod i axonal tarmkanalen samtidigt inspelning från en postsynaptisk neuron. Det viktigaste när man använder denna teknik är att tillförlitlig stimulering av en enda cell sällan kan garanteras rättegång efter rättegång.
Under de senaste femton åren har vi rutinmässigt används parat hel-cell inspelningar från två synaptically anslutna pyramidala nervceller 6-17. Den stora fördelen med denna teknik är att endast ett presynaptiska neuronen är konsekvent och tillförlitligt sätt stimuleras. Det gör också inte bara elektrofysiologiska karakterisering utan även farmakologisk manipulation av presynaptiska neuron 6,18 </ Sup>. Emellertid är sannolikheten för synaptisk konnektivitet mellan neuroner låg, vilket gör anslutna parvis svårt att erhålla 19. Användningen av organotypiska hjärn slice kulturer kringgår detta hinder som synaptiska uppkoppling kan återupprätta in vitro och dessutom vilken typ av resulte anslutning liknar den i normal hjärnvävnad 20. Dessutom organotypiska kulturer uttrycker LTP, LTD 7-10,12-15,21 och ytterligare former av kortsiktiga synaptisk plasticitet inklusive parade puls underlättande (PPF) och depression (PPD) 6,22,23, vilket möjliggör plasticitet mekanismer för att studeras i par av neuroner. Här beskriver vi de specificerade metoder involverade i framgångsrikt uppnå parade inspelningar i detta in vitro-system. Denna information kan lätt anpassas till andra experimentella system, inklusive akut skivor och andra hjärnregioner.
Här har vi beskrivit kraven för upprättande framgångsrika parade hela cell inspelningar i organotypic hippocampus slice kulturer. Kopplade inspelningar kan också utföras i flera preparat, inklusive akut skivor och dissocierade odlingssystem 26,27. Medan fokus här har varit på induktion av längre former av synaptisk plasticitet (dvs. LTP och LTD), är det viktigt att framhäva att parade hela cell inspelningar i organotypisk, akut skiva och dissocierade cellpreparat har gett viktiga insikter i quantal…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Organotypic cultures | Paired recordings | ||
Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
HEPES buffer solution | DIC camera | ||
1M Tris stock solution | Amplifier | ||
Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
Horse Serum | Vibration isolation table | ||
plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
manual tissue chopper | Electrode puller | ||
#2 filter paper | Faraday cage | ||
#5 forceps | |||
Membrane inserts | |||
CO2 incubator | |||
Dissection hood | |||
Class II hood |