Summary
מתילציה ארגינין חלבון, מזורז על ידי כיתה של אנזימים דהינו., מתיל ארגינין חלבון transferases (PRMTs), הוא התהליך של בנוסף האנזימטית של קבוצה מתיל (ים) לarginines בתוך חלבונים. במבחנה assay מתילציה הוא הכלי האמין ביותר להערכת מצב מתילציה של מצעי PRMT ידועים או רומן.
Abstract
מתילציה ארגינין חלבון היא אחד מהשינויים שלאחר translational הנפוצים ביותר בגרעין. מתילציה ארגינין חלבון יכולה להיות מזוהה ו / או שנקבעה באמצעות גישות proteomic, ו / או immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים מתיל-ארגינין. עם זאת, טכניקות אלה לפעמים יכולות להיות מטעות, ולעתים קרובות מספקות תוצאות חיוביות כוזבות. והכי חשוב, בטכניקות אלה אינם יכולים לספק ראיות ישירות לתמיכה בסגוליות מצע PRMT. במבחנה מבחני מתילציה, לעומת זאת, הם מבחני ביוכימיים שימושיים, שהם רגישים, ולחשוף באופן עקבי אם החלבונים שזוהו הם אכן מצעי PRMT. Assay מתילציה טיפוסי במבחנה כולל PRMTs מטוהר, פעיל, מצע מטוהר ותורם רדיואיזוטופים שכותרתו מתיל (S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין). כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לבודד PRMT1 הפעילו כקטליזאטור, בן משפחת PRMT הביע כל מקום בגוף. שליפעילויות transferase thyl של PRMT1 המטוהר נבדקו מאוחר יותר על חלבון ראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע, בנוכחות S-adenosyl-L- [methyl- 3 H] מתיונין כתורם מתיל. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק לא רק להקמת מעמד מתילציה של מצעי PRMT1 פיסיולוגיים רומן, אלא גם להבנת המנגנון הבסיסי של מתילציה ארגינין החלבון.
Introduction
מתילציה החלבון תוארה לראשונה בשנת 1968 1. זה לא היה עד השיבוט הראשון של PRMT1 ב -1996, כי חוקרים החלו להעריך את החשיבות של שינוי שלאחר translational זה 2. מעניין, כ -2% משאריות ארגינין בחלבונים של תמציות גרעיניות מפוגלים 3, המציינים את השפע של שינוי זה. ארגינין הוא חומצת אמינו טעונה חיובי עם צד שרשרת בסיסית והחנקן / s בתוך הרשתות בצד של ארגינין יכול להיות שלאחר translationally שונה באמצעות התוספת של קבוצה מתיל, תהליך המכונה מתילציה ארגינין 4-6. מתילציה ארגינין היא מזורזת על ידי כיתה של אנזימים דהינו., transferases תיל ארגינין חלבון (PRMTs). יכול גם להיות monomethylated Arginines או dimethylated והאחרון יכול להיות או סימטרי או לא סימטרי, תלוי בסוג של PRMTs מזרזות התהליך 4-6.
חלבונים המציגים argininמוטיבים עשירים דואר גליצין הם יעדים פוטנציאליים לקטליזה בתיווך PRMT. מתילציה בתיווך PRMT של מצעים הוכח לווסת אינטראקציה בין חלבונים, אינטראקציה חומצת חלבון גרעין, תפקוד חלבון, ביטוי גנים, ו / או איתות תאית, כל אלה הם הגורמים קריטיים להומאוסטזיס סלולארי רגיל 7-9. על מנת להבין את התפקיד הביולוגי של מתילציה ארגינין חלבון, מבחני מדויקים, יעיל, לשחזור נדרשים לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים.
ב assay מתילציה מבחנה, המעריך את היכולות של PRMTs מטוהר לזרז מתילציה של מצעים שלהם, הוא assay מקובל היטב ללימוד מתילציה ארגינין 10-12. ההצלחה הכוללת של assay זה תלוי במידה רבה על הפעילות של PRMTs המטוהר. ניתן לבטא PRMTs ומטוהר מחיידקים, או תאי יונקים 10,11. assay זה במבחנה מתילציה, כמו דetailed בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה המתוארת במקור על ידי Tini ועמיתים 10. בפרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט את השלבים כרוכים בביטוי והטיהור של PRMT1 בתאי יונקים. היכולת של PRMT1 המטוהר לזרז מתילציה בראס-GTPase הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1), מצע PRMT ידוע 8, מאוחר יותר העריכה בנוכחות מתיונין S-adenosyl-L- [methyl- 3 ח] כ תורם מתיל. שימוש assay זה, אנו יכולים באופן מהימן להגדיר את היכולות של PRMTs לרומן methylate או מצעים ידועים, שבו הוא צעד ראשוני במחקר של מתילציה ארגינין החלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת בונת ביטוי
- לפני שמתחיל את הפרוטוקול, PRMTs שיבוט לתוך וקטורי ביטוי יונקים עם תג N-מסוף epitope (Myc או HA), ואת המצע במסגרת עם גלוטתיון-S-transferase (GST) לביטוי ברמה הגבוהה של חלבון וטיהור מתא חיידק lysates, תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות מולקולריות סטנדרטית.
.2 טיהור PRMTs
- השתמש 100 תרבות מנות מ"מ כדי לשמור על תאים אנושיים אפיתל הסימפונות (Beas2B). מעבר התאים כל 3 ימים ולא נותן להם לגדול למפגש.
- ביום שלפני transfection, זרע 7.5 x 10 5 תאים במדיום תרבות 10 מ"ל בצלחת תרבות 100 מ"מ. מערבולת כדי לפזר באופן שווה את התאים, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5%.
- למחרת, לשאוב את התקשורת ולהוסיף 5 מ"ל של תקשורת בתרבות ללא סרום ואנטיביוטיקה. מערבולת ולשאוב את המדיום. חזור על פעולה זו אחתיותר זמן, ולבסוף מוסיף 5 מ"ל של סרום / בינוני אנטיביוטיקה ללא ולהמשיך transfection.
- לדלל 6 מיקרוגרם של פלסמיד דנ"א לתוך 750 μl של מדיום סרום ללא בצינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ"ל סטרילי.
- בעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק 1.5 מ"ל, לדלל 30 μl של מגיב transfection ל750 μl של מדיום חופשי בסרום.
- מעבירים את הפתרון בדילול מלא מגיב transfection (שלב 2.5) לצינור המכיל DNA בדילול מלא (שלב 2.4). מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
- דגירה את תערובת transfection בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
- לאחר 15 דקות, פיפטה תערובת transfection בעדינות על גבי התאים, מערבולת לערבב באופן שווה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5%.
- אחרי 3 שעות, לשאוב את המדיום המכיל תערובות transfection מהתאים. הוסף בינוני תרבית תאים טריות בתוספת סרום ואנטיביוטיקה.
- דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 humidifiedחממה ל48 שעות.
- לאחר 48 שעה, lyse התאים ב 1 מ"ל של חיץ תמוגה (שנאגרו מלוח 1x פוספט, 1% P-40, 0.5% deoxycholate נתרן, 0.1% סולפט dodecyl נתרן Nonidet, ו1 מיקרוגרם / מ"ל phenlymethyl sulphonyl פלואוריד). לאסוף lysates לתוך צינור צנטריפוגות פלסטיק עם מרים תא דגירה lysates על קרח למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה lysates ב15,000 XG 10 דקות בצנטריפוגה ספסל העליונה כדי לנקות את lysates מפסולת תא. [* מומלץ מאוד כדי לאשר את הביטוי של HA-PRMT1 באמצעות immunoblotting של aliquot של lysates עם אנטי HA נוגדנים, לפני שתמשיך לטיהור של האנזימים עבור assay מתילציה.]
- לטיהור של PRMTs, דגירה 3 מ"ג של lysates תא עם 30 μl של 50:50 השעיה של אנטי HA מטריצת זיקה שבנאגרה מלוח פוספט (PBS), ולסובב את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במסובבי צינור.
- למחרת, לסובב את הצינורות ב 14,000 XG בצנטריפוגה ספסל העליון למשך 2 דקות כדי לאסוףחרוזים. בטל supernatant ולשטוף את החרוזים 3x עם 1 מ"ל של Ripa חיץ [20 מ"מ טריס (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 מ"מ EDTA ו1% Triton-X-100] בכל שטיפה אחריו צנטריפוגה ב 14,000 XG עבור 2 דקות. לאחר לשטוף השלישי, לשטוף את החרוזים פעם אחת עם של חיץ מתילציה 100 μl (50 מ"מ טריס pH 8.5, 20 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl 2, 1 מ"מ β-mercaptoethanol, 100 סוכרוז מ"מ). לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant. חרוזים המכילים את PRMTs המשותק מוכנים לשימוש assay מתילציה. [* מומלץ מאוד להשתמש PRMTs המשותק באופן מיידי בassay מתילציה.]
.3 טיהור של מצע
- לחסן מושבה אחת של GST-G3BP1 הפכה BL21 לתוך 5 מ"ל של מדיום לוריא-Bertani (LB) מכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין. לגדול תרבויות לילה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל"ד.
- למחרת, להעביר את תרבות הלילה ל50 מ"ל של מדיום LB טרי והמשךinue לגדול ל OD 600 של 0.5-0.7 (זה לוקח בערך 2 שעות).
- כאשר OD 600 מגיע 0.5-0.7, להוסיף איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ"מ ולהמשיך לתרבות ל4 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב250 סל"ד.
- לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב1,500 XG עבור 10 דקות, ולעבד את גלולה לטיהור GST או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- להשעות Re גלולה חיידקים ב5 מ"ל של חיץ תמוגה (1x PBS עם מעכבי פרוטאז, 100 מיקרוגרם / מ"ל של ליזוזים, ו0.1% Triton-X-100) ו דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בשלב זה lysates יופיע עכור וצמיג עקב השחרור של הדנ"א הגנומי חיידקים.
- גזירה הדנ"א הגנומי ידי sonication (10 פעימות של 1 שניות כל אחד עם משרעת של 30%).
- נקה את lysates על ידי צנטריפוגה ב15,000 XG 10 דקות ולהעביר את supernatant ברור לצינור 15 מ"ל. אם supernatant לא ברור לחזור על centrifuתהליך gation עוד פעם אחת.
- בינתיים, לשטוף את חרוזי GST-sepharose פעמיים עם PBS הקר כקרח ולהפוך את ההשעיה 50:50 של GST-sepharose בPBS. הוסף 200 μl של ההשעיה GST-sepharose לlysate תא החיידק פינה ולסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- אחרי שעה 1, צנטריפוגה הצינורות ב XG 500 במשך 3 דקות כדי לאסוף את חרוזים. שטוף את החרוזים 3x עם קרח הקר PBS.
- לאחר לשטוף הסופי, resuspend את החרוזים של חיץ elution (50 מ"מ טריס pH 8.0, 150 mM NaCl, גלוטתיון 30 מ"מ) 100 μl ולסובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה הצינורות ב 15,000 XG למשך 2 דקות ולהעביר את supernatant המכיל חלבון המטוהר לעוד צינור צנטריפוגות פלסטיק. לבצע אלקטרופורזה SDS ג'ל polyacrylamide (SDS-PAGE) ניתוח על 5 μl של החלבון המטוהר יחד עם סכומים ידועים של אלבומין בסרום שור (BSA) להעריך את הריכוז של החלבון המטוהר.
.4 מתילציה Assay
הערה: בצע את השלבים הבאים באזור נפרד המיועד לעבודת רדיואיזוטופים ובהתאם לפרוטוקולים של המוסד בביצוע ניסויים עם איזוטופים רדיואקטיביים.
- הוסף 2 מיקרוגרם של GST-מצע מטוהר ותערובת אב המכילה מאגר מתילציה 1x (50 מ"מ טריס pH 8.5, 20 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl 2, 1 מ"מ β-mercaptoethanol, סוכרוז 100 מ"מ), 1 μCi של S-adenosyl- L- [methyl- 3 H] מתיונין, ומים לנפח סופי של 10 μl לPRMTs המשותק (שלב 2.13) ו דגירה התגובה ב30 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- אחרי שעה 1, לעצור את התגובה על ידי הוספת 10 μl של חיץ מדגם 2x SDS. לאחר denaturation של הדגימות על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להפריד את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE.
- מאוחר יותר, להעביר את החלבונים הופרדו מג'ל SDS על קרום nitrocellulose באמצעות העברת electrophoretic חצי יבשה.
- לאחר ההעברה, לכסות עם הקרוםutofluor (מגבר תמונת autoradiographic), ובעדינות רוק עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. , לאחר 2 שעות לשפוך את autofluor ולשמור לשימוש מאוחר יותר. [* תווית הצינור כחומר רדיואקטיבי]
- אוויר במהירות לייבש את הקרום על נייר סינון, לאטום אותו בשקית ניילון ולחשוף את הקרום לסרט X-ray ב -20 מעלות צלזיוס. זמן חשיפה מספיק נע בין 5-30 ימים.
.5 אישור ביטוי PRMT וטוען שווים של מצע
- לאחר שהשיג חשיפות מספיק, להעביר את הקרום לקופסא פלסטיק המכילה חיץ חסימה [שנאגר מלוח טריס עם 20-Tween (TBST + חלב 3% דלי שומן)] ועדינות רוק עבור שעה 1.
- מחק את חיץ החסימה כפסולת רדיואקטיבית. דגירה הממברנה עם אנטי HA נוגדן (1: 1,000 דילול) בTBST הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס, עם נדנדה עדינה.
- לשטוף את הממברנה עם 3x TBST דגירה הממברנה עם נוגדן המשני אנטי עכבר שכותרת HRP(1: 5,000 דילול) בTBST בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 עם נדנדה עדינה.
- אחרי שעה 1, לשטוף את הממברנה עם 3x TBST, ולבצע זיהוי chemiluminiscence של חלבונים עם מצע HRP.
- לאחר זיהוי של PRMTs מתויג-HA, דגירה הקרום עם פתרון מכתים Ponseau-S למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. מהר לשטוף 3x הקרום במים כדי לאתר את מצעים מתויג GST. סרוק את התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היכולות של HA-PRMT1 לmethylate GST-G3BP1 נקבעו על ידי במבחנה assay מתילציה. PRMT1 מתויג-HA מטוהר מlysates תא Beas2B הועסק בתגובת מתילציה המכילה GST-G3BP1, ו1 μCi של S-adenosyl-L- מתיונין [methyl- 3 H], כתורם מתיל. PRMT1 יכול ביעילות לזרז מתילציה של GST-G3BP1 (איור 1, פנל עליון). תגובות מתילציה באמצעות משיכה ומורדות שבוצעו על lysates של תאי Beas2B transfected וקטור ריק שימשו כביקורת שלילית (איור 1, פנל עליון, מסלול 1). Immunoblotting עם נוגדנים נגד HA אשר את הביטוי של PRMT1 (איור 1, פנל באמצע). צביעת Ponseau-S הייתה בשימוש כדי להדגים טעינה שווה של GST-G3BP1 בשתי התגובות (איור 1, פנל תחתון).
1997 / "width =" 51997fig1highres.jpg 500 "/>
מתילציה G3BP1 איור 1 G3BP1 methylates PRMT1. PRMT1 תיווך הוערכה על ידי שימוש במבחנה תגובת מתילציה הכוללת PRMT1 HA-מתויג מטוהר מlysates התא, GST-G3BP1 Beas2B מטוהר מE. coli, וS-adenosyl-L- מתיונין [methyl- 3 H], כתורם מתיל. פנל עליון מייצג את fluorograph למתילציה G3BP1. פנל באמצע מייצג את immunoblot המאשר את הביטוי של PRMT1 מתויג-HA. ו, הפנל התחתון מייצג כתם מוכתם Ponseau-S לקביעת טעינה שווה של המצע (GST-G3BP1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה משמש באופן שגרתי לביסוס מעמדה מתילציה של מצעי PRMT המזוהים. assay חזק, ועולה בקנה אחד זה יהיה גם לספק ראיות מוחלטות על הספציפיות של PRMTs למצעים שלהם. רכיבי מפתח להצלחה של assay זה הם: .1 ביטוי של PRMTs בתאי יונקים, 2 פעילות של PRMTs המטוהר, 3 ביטוי וטיהור של מצע, ו.4 העברה מערבית מלאה של חלבוני קרום nitrocellulose.
PRMTs רקומביננטי הביע, וגם מטוהרים מחיידקים יכולים לשמש בתגובות מתילציה במבחנה 10,11,13. עם זאת, מאחר ולכל PRMT דורש אסטרטגיות טיהור שונה, תנאי אחסון, וטמפרטורות אחסון, השימוש בPRMTs רקומביננטי במבחנת תגובות מתילציה לא יכול להיות אידיאלית. יתר על כן, PRMTs רקומביננטי גם קצר ימים 11. בהתחשב באתגרים אלה, אנו מאמינים כי PURification של PRMTs מתאי יונקים הוא נוח, ועולה בקנה אחד לבצע תגובות מתילציה במבחנה. אם ביטוי חולף של PRMTs בתאי יונקים נראה לא נוח, לחלופין, ניתן לשקול ביצוע שורות תאי יציבות לPRMTs. והכי חשוב, ביטוי של PRMTs בתאי יונקים היא הדרך היחידה העומדת לרשות לקבוע פעילויות קטליטי PRMT בתגובה לגירויים למשל, גורמי גדילה, ציטוקינים, וכו '
המגבלה העיקרית של שימוש בPRMTs מטוהר ממקורות יונקים היא הזיהום עם PRMTs אחר בזמן תהליך הטיהור. עם זאת, אפשר להשתמש במבני מוטציה של PRMTs שהם חסרי פעילות transferase מתיל כבקרות נוספות. אם PRMTs תחת חקירה יכול ליצור homodimers, מבני מוטציה לא יכולים להיות שולט טוב. לחלופין, ניתן לשקול שימוש בPRMTs מטוהר מהתאים המדולדלים של PRMTs היעד כביקורת שלילית או להשתמש רקומביננטיPRMTs ממקורות חיידקים. הפרוטוקול המובא מתאר assay פשוט, נוח, ועולה בקנה אחד לחקור מתילציה ארגינין חלבון. השיטה המתוארת היא לא רק חיונית לזיהוי ולהקמתה של מעמד מתילציה של מצעי PRMT רומן, אלא גם להבנה הבסיסית שלנו של מנגנון המתילציה של ארגינין החלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי פרס הצטיינות ממשרד החוץ האמריקאי לענייני יוצאי צבא, וNIH להעניק R01CA138528 לRW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
References
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T.
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
