Summary
蛋白质精氨酸甲基化，由一类酶即催化。蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs），是酶促加入甲基组（S），以蛋白质内精氨酸的过程。 在体外甲基化测定法是最可靠的工具，以评估已知的或新型的PRMT底物的甲基化状态。
Abstract
蛋白质精氨酸甲基化是在细胞核中最丰富的翻译后修饰之一。蛋白质精氨酸甲基可以被识别和/或通过蛋白质组的方法来确定，和/或以甲基精氨酸特异性抗体进行免疫印迹。然而，这些技术有时可能会产生误导，并经常提供假阳性结果。最重要的是，这些技术不能提供支持的PRMT底物特异性的直接证据。 体外甲基化分析，在另一方面，是有用的生化分析，这是敏感的，并且始终如一地揭示，如果所识别的蛋白确实PRMT底物。一个典型的体外甲基化检测包括纯化的活性PRMTs，纯化的底物和放射性同位素标记的甲基供体（S-腺苷-L-甲基- 3 H] -甲硫氨酸）。在这里，我们描述了一个一步一步的协议隔离催化活性PRMT1一个广泛表达PRMT家族成员。在我纯化PRMT1的基苯乙基转移酶活性上的Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1），一种已知的PRMT底物后进行测试，在S-腺苷-L-甲基- 3 H] -甲硫氨酸作为甲基供体的存在下进行。这个协议可以采用不仅用于建立的新的生理PRMT1基板的甲基化状态，而且对于了解蛋白质精氨酸甲基化的基本机制。
Introduction
蛋白甲基化是在1968年1首先描述。直到PRMT1在1996年的第一个克隆，研究人员开始欣赏这种翻译后修饰2的重要性。有趣的是，约2％精氨酸残基在核提取物中的蛋白质被甲基3，说明本变形例的丰度。精氨酸是一种带正电荷的氨基酸与碱性侧链和氮/ s的精氨酸的侧链中可以在翻译后通过加入甲基，称为精氨酸甲基4-6的过程的修改。精氨酸甲基化的一类酶即催化，蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）。精氨酸既可以单甲基化或二甲基化，而 后者可以是对称或不对称的视PRMTs催化过程4-6的类型。
这显示精氨酸的蛋白质E-甘氨酸丰富的图案是PRMT介导的催化潜在目标。基板的PRMT介导的甲基化已显示调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-核酸相互作用，蛋白质功能，基因表达，和/或细胞信号，所有这些都对正常细胞稳态7-9关键。为了理解的蛋白质精氨酸甲基化的生物作用，精确，高效和可重复的试验，需要建立所标识的PRMT底物的甲基化状态。
在体外甲基化检测，评估其纯化PRMTs的能力，以促进它们的底物的甲基化，是研究精氨酸甲基化10-12广为接受检测。此测定法的总体成功在很大程度上依赖于纯化的PRMTs的活性。 PRMTs可以表示和从细菌或哺乳动物细胞10,11纯化。此体外甲基化检测，为detailed的协议部分，是基于最初由蒂尼和他的同事10中描述的方法。在这个协议中，我们显示了详细涉及PRMT1在哺乳动物细胞中的表达和纯化的步骤。纯化PRMT1的催化甲基上的Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1），一种已知的PRMT底物8的能力中的S-腺苷-L-甲基- 3 H] -甲硫氨酸的存在下作为后来评价甲基供体。使用这种方法，我们能够可靠地限定PRMTs的能力甲醇新颖的或已知的底物，这是在蛋白质精氨酸甲基化的研究的主要步骤。
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Protocol
1，制备表达构建
- 启动协议之前，克隆PRMTs成具有N-末端表位标签（Myc基因或HA），并在帧与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的底物从细菌细胞中高水平的蛋白表达和纯化的哺乳动物表达载体裂解物，使用标准的分子生物学技术。
2，净化PRMTs的
- 使用100毫米培养皿中，以维持人体支气管上皮细胞（Beas2B细）。通过细胞每3天，不要让他们成长为汇合。
- 于转染前一天，种子在100毫米培养皿7.5×10 5个细胞于10ml培养基中。漩涡均匀地分散细胞，并在5％增湿的CO 2培养箱中孵育在37℃。
- 第二天，吸出介质并加入5 ml培养基不含血清和抗生素。漩涡，吸的媒介。重复此步骤1更多的时间，最后加入5毫升血清/无抗生素的培养基中，然后继续转。
- 稀释6微克质粒DNA进入750μl的无血清培养基在无菌1.5毫升塑料离心管中。
- 在另外150毫升的塑料离心管中，稀释30微升转染试剂的成750μl的无血清培养基。
- 传送稀释转染试剂溶液（步骤2.5），以含有稀释的DNA（步骤2.4）的管中。移液器向上和向下几次轻轻混匀。
- 在室温下孵育转染混合物15分钟。
- 15分钟后，吸取了转用文火到细胞，漩涡混合均匀，并以5％的潮湿二氧化碳培养箱在37℃。
- 3小时后，吸出含有细胞的转染混合物的介质。添加补充有血清和抗生素的新鲜细胞培养基。
- 在5％的潮湿的CO 2在37℃下培养箱中培养48小时。
- 48小时后，裂解细胞在1ml裂解缓冲液（1×磷酸缓冲盐溶液，1％诺乃洗涤剂P-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，和1微克/毫升phenlymethyl磺酰氟）。收集裂解物转移至塑料离心管中的细胞挺杆和孵化的溶胞产物在冰上30分钟。
- 离心裂解液在15000 XG用于在台式离心10分钟，以清除细胞碎片的裂解液。 [*强烈建议在进行到酶的甲基化检测的纯化之前进行确认的HA-PRMT1通过用抗-HA抗体的裂解物中，等分试样的免疫印迹的表达。]
- 为PRMTs的纯化，孵育细胞裂解物的3毫克与30微升50:50悬浮抗HA亲和基质的磷酸缓冲盐水（PBS）中，并旋转过夜，在4℃在试管旋转器。
- 第二天，旋管在14000 XG在台式离心机2分钟收集珠。弃上清，洗涤珠子3倍用1ml RIPA缓冲液〔20毫摩尔Tris（pH值8.0），150 mM氯化钠，5mM的EDTA和1％的Triton-X-100]在每次洗涤后离心以14,000 xg离心2分钟。在第三次洗涤后，用100μl的甲基化缓冲一次洗珠（50毫摩尔Tris pH值8.5，20mM的氯化钾，10mM的MgCl 2的，1mM的β-巯基乙醇，100mM的蔗糖）。离心后，除去上清液。含有固定化的PRMTs珠子是准备在甲基化检测中使用。 [*强烈建议在甲基化检测，立即用固定PRMTs。]
3，净化基质
- 接种GST-G3BP1的单菌落转化BL21到5毫升的Luria-Bertani（LB）培养基中含有100微克/毫升氨苄青霉素。过夜生长的培养物在37℃下以250rpm摇动。
- 第二天，过夜培养转移到50毫升的新鲜LB培养基中，并续inue增长到外径600的0.5-0.7（约需2小时）。
- 当OD 600达到0.5-0.7，在37℃下加入异丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）至1毫米的终浓度，继续培养更多的4小时用在250转摇。
- 收获细胞，离心，在1500×g离心10分钟，并处理该沉淀为GST纯化或储存于-80℃。
- 重悬细菌沉淀在5ml裂解缓冲液（1×PBS中与蛋白酶抑制剂，溶菌酶的100微克/毫升和0.1％的Triton-X-100）和孵育的裂解液在37℃下进行30分钟。此时的裂解物中会出现混浊和粘稠由于细菌的基因组DNA的释放。
- 剪切通过超声处理的基因组DNA（10个脉冲，分别使用30％的幅度1秒）。
- 清除裂解物离心以15,000 xg离心10分钟，将上层清液转移到15毫升管。如果上清液中是不明确的重复centrifugation过程一次。
- 同时，用冰冷的PBS洗两次的GST-琼脂糖珠，并以50:50悬浮GST-琼脂糖凝胶在PBS中。加入200μl的GST-琼脂糖悬浮液中，以被清除的细菌细胞裂解液并旋转，在4℃下反应1小时。
- 1小时后，离心管中，在500×g离心3分钟以收集珠子。洗珠3倍用冰冷的PBS中。
- 最后一次洗涤后，重悬珠子在100μl洗脱缓冲液（50mM的Tris pH值8.0，150mM的氯化钠，30mM的还原型谷胱甘肽）和旋转，在4℃下进行10分钟。
- 离心管中以15,000 xg离心2分钟，并含有纯化蛋白的上清液转移到另一塑料离心管中。进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析5微升的纯化蛋白沿着与已知量的牛血清白蛋白（BSA）来估计纯化的蛋白质的浓度。
4，甲基化分析
注：请在指定的放射性同位素工作，并符合上进行实验，放射性同位素的机构的协议的一个单独的区域下面的步骤。
- 加入2微克纯化的GST-基质与含有1x甲基化缓冲液（50mM的Tris pH值8.5，20mM的氯化钾，10mM的MgCl 2的，1mM的β-巯基乙醇，100mM的蔗糖），1微居里的反应混合液的S-腺苷- L-[甲基- 3 H] -甲硫氨酸，和水加至10微升的固定PRMTs（步骤2.13），使终体积和孵育在30℃下反应1小时。
- 1小时后，停止通过加入10μl的2×SDS样品缓冲液中反应。样品的变性，在95℃下进行10分钟后，分离出的样品在SDS-PAGE凝胶上。
- 以后，通过利用半干电泳转移从SDS凝胶转移分离的蛋白质到硝酸纤维素膜上。
- 转让完成后，盖上膜utofluor（放射自显影图像增强器），并轻轻摇动2小时，在室温下进行。 2小时后，倒出autofluor并保留以备后用。 [*标签管的放射性物质]
- 很快风干膜滤纸上，密封在塑料袋中，露出膜的X光片在-20℃。 5-30天之间有足够的曝光时间范围。
5，确认PRMT表达和平等基质加载中
- 获得足够的曝光后，将膜转移至塑料盒含有封闭缓冲液[Tris缓冲盐水和吐温20（TBST +3％脱脂乳）并轻轻摇动1小时。
- 弃去封闭缓冲液作为放射性废物。孵化用抗HA抗体的膜：在TBST（1千稀释）过夜，在4 ℃，用温和的摇摆。
- 洗用TBST 3倍的膜孵育与HRP标记的抗小鼠二抗的膜（1：5000稀释）在TBST中于室温下1小时，轻轻摇动。
- 1小时后，用TBST洗涤3次洗膜，并进行化学发光检测的蛋白质与HRP底物。
- 检测HA标记的PRMTs后，孵育Ponseau-S染色溶液中的膜5分钟，在室温下进行。以水快速洗膜3次，以检测GST标记的底物。扫描图像。
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Representative Results
HA-PRMT1的能力，以甲基化的GST-G3BP1由体外甲基化测定法测定。 HA标记PRMT1从Beas2B细细胞溶胞产物纯化被用在含有GST-G3BP1甲基化反应，和1微居里的S-腺苷-L-甲基- 3 H] -蛋氨酸，作为甲基供体。 PRMT1能有效地催化GST-G3BP1（ 图1，上图）的甲基化。使用上作为阴性对照组（ 图1，上图，泳道1）转染空载体Beas2B细细胞裂解液进行拉起伏甲基化反应。免疫印迹用抗HA抗体证实PRMT1的表达（ 图1，中图）。 Ponseau-S染色法证明在这两个反应中相等的加载GST-G3BP1的（ 图1，下图）。
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图1 PRMT1甲基化G3BP1。PRMT1介导G3BP1甲基化是通过使用体外甲基化反应，其包括HA-标记的PRMT1从Beas2B细细胞裂解物，GST-G3BP1从大肠杆菌纯化，纯化的评价杆菌 ，和S-腺苷-L-甲基- 3 H] -甲硫氨酸，作为甲基供体。上图表示fluorograph的G3BP1甲基化。中间面板代表了免疫印迹证实HA标记PRMT1的表达。而且，下面板代表确定基板（GST-G3BP1）等于负载Ponseau-S沾上污点。
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Discussion
本文所描述的协议通常用于建立所标识的PRMT底物的甲基化状态。这一功能强大且一致的分析也将提供PRMTs其底物的特异性确切的证据。关键部件的该测定法的成功是：PRMTs在哺乳动物细胞中的表达1，2，活性纯化的PRMTs的，3的表达和衬底的纯化和蛋白质的4完全西方转印到硝酸纤维素膜上。
重组PRMTs表达，并从细菌中纯化的，也可以在体外甲基化反应10,11,13使用。然而，由于每个PRMT需要不同的纯化策略，储存条件和储存温度下，在使用重组PRMTs的体外甲基化反应可能并不理想。此外，重组PRMTs也短命11。考虑到这些问题，我们认为，PUR从哺乳动物细胞PRMTs的ification是方便的，一贯执行的体外甲基化反应。如果在哺乳动物细胞PRMTs的瞬时表达似乎是不方便，另外，可以考虑制作的稳定细胞株为PRMTs。最重要的是，在哺乳动物细胞中PRMTs的表达可用以确定响应PRMT催化活性的刺激，例如 ，生长因子，细胞因子等的唯一方式
使用PRMTs从哺乳动物来源的纯化的主要限制是与在纯化过程中的其他PRMTs的污染。然而，人们可以使用，缺少甲基转移酶活性的附加控制的PRMTs突变结构。如果被调查的PRMTs可以形成同源二聚体，突变体的构建可能不是很好的控制。或者，可以考虑使用PRMTs从细胞中纯化耗尽目标PRMTs的作为阴性对照，或使用重组PRMTs细菌的来源。所提出的协议描述了一个简单，方便，一致的分析，探讨蛋白质精氨酸甲基化。所描述的方法不仅对新颖的PRMT底物的甲基化状态的识别和建立必不可少的，而且对我们的基本的蛋白质精氨酸甲基化的机制的理解。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
这项研究是由美国退伍军人事务的美国国防部优异奖的支持，以及美国国立卫生研究院授予R01CA138528到RW。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
References
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