In vitro Metylering analys för att studera protein Arginin Metylering

Summary

Protein arginin metylering, katalyserad av en klass av enzymer viz. Protein arginin metyl transferaser (PRMTs), är processen av enzymatisk tillsättning av metylgrupp (er) till argininer inom proteiner. In vitro-metylering analysen är den mest pålitliga verktyg för att bedöma metyleringsstatus av kända eller nya PRMT substrat.

Abstract

Protein arginin-metylering är en av de vanligast förekommande posttranslationella modifieringar i kärnan. Protein arginin metylering kan identifieras och / eller bestäms via proteomik metoder, och / eller immun med metyl-arginin specifika antikroppar. Men dessa tekniker kan ibland vara vilseledande och ger ofta falskt positiva resultat. Viktigast kan dessa tekniker inte ger direkta bevis till stöd för PRMT substratspecificiteten. In vitro metylering analyser, å andra sidan, är användbara biokemiska analyser, som är känsliga, och konsekvent avslöja om de identifierade proteinerna är verkligen PRMT substrat. En typisk in vitro-metylering analys innefattar renade, aktiva PRMTs, renade substratet och en radioisotop märkt metyl donator ^{(S-adenosyl-L-[metyl-3H]} metionin). Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll för att isolera katalytiskt aktiva PRMT1, en ubiquitously uttryckt PRMT familjemedlem. Den methyl transferas verksamhet renade PRMT1 senare testades på Ras-GTPas aktiverande protein bindande protein 1 (G3BP1), en känd PRMT substrat, i närvaro av S-adenosyl-L ^[metyl-3H] metionin som metyldonator. Detta protokoll kan användas inte bara för att fastställa metyleringsstatus av nya fysiologiska PRMT1 substrat, utan också för att förstå den grundläggande mekanismen av protein arginin metylering.

Introduction

Protein metylering beskrevs första gången 1968 ^1. Det var inte förrän den första kloning av PRMT1 1996, att forskare började inse betydelsen av denna post-translationell modifiering ^2. Intressant är cirka 2% av argininrester i proteinerna i kärnextrakt metylerade ^3, vilket indikerar överflödet av denna ändring. Arginin är en positivt laddad aminosyra med en basisk sidokedja och kväve / s inom sidokedjorna av arginin kan vara post-translationellt modifierat genom tillsats av en metylgrupp, en process som kallas arginin metylering ^4-6. Arginin metylering katalyseras av en klass av enzymer nämligen., Protein arginin metyl transferaser (PRMTs). Argininer kan antingen monometylerad eller dimetylerad och den senare kan vara antingen symmetrisk eller asymmetrisk beroende på typen av PRMTs katalysera process ^4-6.

Proteiner som visar arginine-glycin rika motiv är potentiella mål för PRMT-medierad katalys. PRMT medierad metylering av substrat har visats modulera protein-proteininteraktion, protein-nukleinsyra-interaktion, proteinfunktion, genuttryck och / eller cellulär signalering, som alla är kritiska för normal cellulär homeostas ^7-9. För att förstå den biologiska betydelsen av protein arginin metylering är precisa, effektiva och reproducerbara analyser som krävs för att fastställa metyleringsstatus av de identifierade PRMT substrat.

I metylering vitro, som utvärderar förmågan hos renade PRMTs att katalysera metylering av sina substrat, är en väl accepterad analys för att studera arginin metylering ^10-12. Den totala framgången för denna analys beror till stor del på aktiviteten hos de renade PRMTs. PRMTs kan uttryckas och renas från bakterier eller däggdjursceller ^10,11. Denna metylering analys in vitro, som dETALJERAD i protokoll sektion, är baserat på en metod som ursprungligen beskrivits av Tini och kollegor ^10. I detta protokoll, visar vi i detalj de steg som ingår i uttrycket och reningen av PRMT1 i däggdjursceller. Förmågan hos det renade PRMT1 att katalysera metylering på Ras-GTPas-aktiverande protein-bindande protein 1 (G3BP1), en känd PRMT substratet ^8, var senare utvärderades i närvaro av ^{S-adenosyl-L-[metyl-3H]} metionin såsom den metyl donator. Med hjälp av denna analys, kan vi på ett tillförlitligt sätt definiera förmågor PRMTs till metylat roman eller kända substrat, vilket är ett primärt steg i studiet av protein arginin metylering.

Protocol

1 Beredning av expressionskonstrukt

1. Innan protokollet, klon PRMTs till däggdjursexpressionsvektorer med en N-terminal epitopmärkning (Myc eller HA), och substratet i ram med glutation-S-transferas (GST) för hög nivå proteinuttryck och rening från bakteriecell lysat, med hjälp av standardmolekylärbiologiska tekniker.

2. Rening av PRMTs

1. Använd 100 mm odlingsskålar för att upprätthålla mänskliga bronkiella epitelceller (Beas2B). Passage cellerna var 3 dagar och inte låta dem växa till sammanflödet.
2. På dagen före transfektion, frö 7,5 x 10 ⁵ celler i 10 ml odlingsmedium i en 100 mm odlingsskål. Swirl för att jämnt dispergera cellerna och inkubera vid 37 ° C i en 5% befuktad _{CO2-inkubator.}
3. Nästa dag, aspirera media och tillsätt 5 ml odlingsmedium utan serum och antibiotika. Snurra och aspirera mediet. Upprepa detta steg ettmer tid, och slutligen lägga till 5 ml serum / antibiotikafritt medium och fortsätta till transfektion.
4. Späd 6 ^ g av plasmid-DNA i 750 | il serumfritt medium i en steril 1,5 ml centrifugrör av plast.
5. I en annan 1,5 ml centrifugrör av plast, späd 30 | il av transfektion reagens i 750 | il serumfritt medium.
6. Överför den utspädda transfektionsreagens lösning (steg 2,5) till röret som innehåller utspädd DNA (steg 2.4). Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned flera gånger.
7. Inkubera transfektion blandningen vid rumstemperatur under 15 min.
8. Efter 15 min, pipet transfektionsblandningen försiktigt på cellerna, att virvla runt blanda jämnt, och inkubera vid 37 ° C i en 5% befuktad _{CO2-inkubator.}
9. Efter 3 timmar, aspirera medium som innehåller transfektion blandningar från cellerna. Lägg färskt cellkulturmedium kompletterat med serum och antibiotika.
10. Inkubera vid 37 ° C i en 5% fuktad _CO2inkubator under 48 timmar.
11. Efter 48 tim, lysera cellerna i en ml lyseringsbuffert (1x fosfatbuffrad saltlösning, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxikolat, 0,1% natriumdodecylsulfat och 1 | ig / ml phenlymethyl sulfonyl-fluorid). Samla lysaten i ett centrifugrör av plast med en celllyftare och inkubera lysaten på is under 30 min.
12. Centrifugera lysat vid 15.000 xg under 10 min på en bänkcentrifug för att rensa lysaten från celldebris. [* Det rekommenderas starkt att bekräfta uttrycket av HA-PRMT1 via immunoblotting av en mängd av lysaten med anti-HA-antikroppar, innan du fortsätter till rening av enzymer för metylering analys.]
13. För rening av PRMTs, inkubera 3 mg cellysat med 30 pl av 50:50 suspension av anti-HA-affinitetsmatris i fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och rotera över natten vid 4 ° C i en tub rotator.
14. Nästa dag, snurra rören vid 14.000 xg på en bänk Centrifug i 2 min för att samlapärlorna. Avlägsna supernatanten och tvätta pärlorna 3 gånger med 1 ml RIPA-buffert [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA och 1% Triton-X-100] i varje tvättning följt av centrifugering vid 14.000 xg under 2 min. Efter den tredje tvätten, tvätta pärlorna en gång med 100 | il av metylering buffert (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM _MgCl2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sackaros). Efter centrifugering, avlägsna supernatanten. Pärlorna innehållande de immobiliserade PRMTs är redo att användas i metylering analys. [* Det rekommenderas starkt att omedelbart använda de immobiliserade PRMTs i metylering analysen.]

3 Rening av substrat

1. Inokulera en enda koloni av GST-G3BP1 transformerad BL21 i 5 ml Luria-Bertani (LB) medium innehållande 100 | ig / ml ampicillin. Väx odlingarna över natt vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm.
2. Nästa dag, överföra natten kultur till 50 ml färskt LB-medium och fortsinue att växa till en OD ₆₀₀ på 0,5-0,7 (Det tar ca 2 timmar).
3. När OD ₆₀₀ når 0,5 till 0,7, tillsätt isopropyl-β-D-tiogalaktosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 1 mM och fortsätta till kultur för ytterligare 4 h vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm.
4. Skörda cellerna genom centrifugering vid 1500 xg under 10 min, och bearbeta pelleten för GST rening eller förvara vid -80 ° C.
5. Återsuspendera den bakteriella pelleten i 5 ml lyseringsbuffert (1x PBS med proteashämmare, 100 pg / ml av lysozym, och 0,1% Triton-X-100) och inkubera lysaten vid 37 ° C under 30 min. Vid denna tidpunkt lysaten visas grumlig och viskös på grund av frisättning av bakteriellt genomiskt DNA.
6. Skjuva iskt DNA genom sonikering (10 pulser av en sekund var och en med en amplitud av 30%).
7. Rensa lysaten genom centrifugering vid 15.000 xg under 10 min och överföra den klara supernatanten till ett 15 ml rör. Om supernatanten är inte klart upprepa centrifugesökningsprocessen en gång till.
8. Under tiden, tvätta de GST-sepharose pärlor två gånger med iskall PBS och göra en 50:50 suspension av GST-Sepharose i PBS. Lägg 200 ul av GST-Sepharose suspension till den klarerade bakteriella cellysatet och rotera vid 4 ° C under 1 tim.
9. Efter 1 h, centrifugera rören vid 500 xg under 3 min för att samla pärlorna. Tvätta pärlor 3x med iskall PBS.
10. Efter den slutliga tvätten, återsuspendera pärlorna i 100 ul av elueringsbuffert (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutation) och rotera vid 4 ° C under 10 min.
11. Centrifugera rören vid 15.000 xg under 2 min och överför supernatanten innehållande det renade proteinet till en annan plast-centrifugrör. Utför SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)-analys på 5 | il av det renade proteinet tillsammans med kända mängder av bovint serumalbumin (BSA) för att uppskatta koncentrationen av det renade proteinet.

4. Metylering Assay

OBS: Utför följande steg i ett separat område avsett för radioisotoparbete och i enlighet med institutionens protokoll på att utföra experiment med radioaktiva isotoper.

1. Lägg 2 pg av renat GST-substrat och en huvudblandning innehållande 1x metylering buffert (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM _MgCl2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sackaros), 1 | iCi av S-adenosyl- ^L-[metyl-3H] metionin, och vatten till en slutlig volym av 10 | il till de immobiliserade PRMTs (steg 2,13) ​​och inkubera reaktionen vid 30 ° C under 1 tim.
2. Efter 1 h, stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 | il 2x SDS-provbuffert. Efter denaturering av proverna vid 95 ° C under 10 minuter, separera proverna på en SDS-PAGE-gel.
3. Senare överför de separerade proteinerna från SDS-gelen på nitrocellulosamembran med användning av en halvtorr elektroforetisk överföring.
4. Efter överföringen, täcka membranet med enutofluor (en autoradiografisk bildförstärkare) och skaka försiktigt under 2 h vid rumstemperatur. Efter 2 timmar, häll bort autofluor och spara den för senare användning. [* Märk röret som radioaktivt material]
5. Snabbt lufttorka membranet på ett filterpapper, försegla den i en plastpåse och exponera membranet till en röntgenfilm vid -20 ° C. Tillräckligt exponeringstid varierar mellan 5-30 dagar.

5. Bekräftelse av PRMT Expression och Equal Laddar substrat

1. Efter att ha uppnått tillräckliga exponeringar, över membran till en plastlåda som innehåller blockeringsbuffert [Tris-saltlösning med Tween-20 (TBST + 3% fettfri mjölk)] ​​och försiktigt gunga under 1 timme.
2. Kassera blockerande buffert som radioaktivt avfall. Inkubera membranet med anti-HA-antikroppar (1: 1,000 utspädning) i TBST natt vid 4 ° C med försiktig skakning.
3. Tvätta membranet med TBST 3x och inkubera membranet med HRP-märkt anti-mus sekundär antikropp(1: 5000 utspädning) i TBST vid rumstemperatur under 1 h med försiktig skakning.
4. Efter 1 timme, tvätta membranet med TBST 3x, och utför kemiluminiscens detektion av proteiner med ett HRP-substrat.
5. Efter detektering av de HA-etikette PRMTs, inkubera membranet med Ponseau-S färgningslösning under 5 min vid rumstemperatur. Snabbt tvätta membran 3x med vatten för att detektera GST-märkt substrat. Skanna bilden.

Representative Results

Förmågan hos HA-PRMT1 att metylera GST-G3BP1 bestämdes genom en in vitro-metylering analys. HA-tagged PRMT1 renats från Beas2B cellysat användes i en metylering reaktion innehållande GST-G3BP1 och 1 uCi av ^{S-adenosyl-L-[metyl-3H]} metionin, såsom en metyl-donator. PRMT1 kunde effektivt katalyserar metylering av GST-G3BP1 (Figur 1, övre panelen). Metyleringsreaktioner använder rullgardinsmenyerna utförda på lysat av tomma vektor transfekterade Beas2B celler tjänade som en negativ kontroll (Figur 1, övre panelen, spår 1). Immunblotting med anti-HA-antikroppar bekräftade uttrycket av PRMT1 (figur 1, mellersta panel). Ponseau-S-färgning användes för att visa lika laddning av GST-G3BP1 i båda reaktionerna (Figur 1, undre fältet).

1997 / 51997fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1 PRMT1 metylerar G3BP1. PRMT1 medierad G3BP1 metylering utvärderades genom användning av en in vitro-metyleringsreaktionen som inkluderar HA-märkt PRMT1 renats från Beas2B cellysat, GST-G3BP1 renades från E. coli och ^{S-adenosyl-L-[metyl-3H]} metionin, såsom en metyl-donator. Övre panel representerar fluorograph för G3BP1 metylering. Middle panelen representerar immunoblot bekräftar uttrycket av HA-märkta PRMT1. Och, representerar den undre panelen Ponseau-S färgade blot för att bestämma lika laddning av substratet (GST-G3BP1).

Discussion

Protokollet som beskrivs häri används rutinmässigt för att fastställa metyleringsstatus av de identifierade PRMT substrat. Denna robusta, och konsekvent analys kommer också att ge definitiva bevis på specificitet PRMTs för deras substrat. De viktigaste komponenterna för att lyckas med denna analys är: 1 Redovisning av PRMTs i däggdjursceller, 2 Aktivitet av renade PRMTs, 3 Expression och rening av substrat, och 4 Komplett västra överföring av proteinerna till nitrocellulosamembranet.

Rekombinanta PRMTs uttryckas och renas från bakterier kan även användas i metylering in vitro-reaktioner ^10,11,13. Eftersom varje PRMT kräver olika reningsstrategier, lagringsförhållanden och förvaringstemperaturer, användning av rekombinanta PRMTs i in vitro metyleringsreaktioner kanske inte är perfekt. Dessutom rekombinanta PRMTs är också kortlivade ^11. Med tanke på dessa utmaningar, anser vi att purläggande av PRMTs från däggdjursceller är bekvämt, och konsekvent för att utföra in vitro metyleringsreaktioner. Om gående uttryck av PRMTs i däggdjursceller verkar vara obekvämt, alternativt kan man överväga att göra stabila cellinjer för PRMTs. Viktigast är expression av PRMTs i däggdjursceller är det enda sättet tillgängligt för att bestämma PRMT katalytiska aktiviteter som svar på stimuli t.ex. tillväxtfaktorer, cytokiner, etc.

Den största begränsningen med att använda PRMTs renade från däggdjurskällor är kontaminering med andra PRMTs under reningsprocessen. Dock kunde man använda mutant konstruktioner av de PRMTs som saknar metyltransferas verksamhet som ytterligare kontroller. Om PRMTs under utredning kan bilda homodimerer, kanske muterade konstruktioner inte bra kontroller. Alternativt kan man överväga att använda PRMTs renade från celler utarmat av mål PRMTs som en negativ kontroll eller använda rekombinantPRMTs från bakteriekällor. Den presenterade protokoll beskriver ett enkelt, bekvämt och konsekvent analys för att undersöka protein arginin metylering. Den beskrivna metoden är inte bara nödvändigt för identifiering och inrättandet av metyleringsstatus av nya PRMT substrat, men också för vår grundläggande förståelse av mekanismen av protein arginin metylering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific