Summary
Белок аргинин метилирование, катализируемой класса ферментов именно., Белок аргинин метил трансферазы (PRMTs), представляет собой процесс ферментативного добавлением метилового группы (групп) в пределах аргинина белков. В пробирке метилирование анализ является самым надежным инструментом для оценки статуса метилирования известных или новых субстратов PRMT.
Abstract
Белок аргинин метилирование является одним из наиболее распространенных пост-трансляционных модификаций в ядре. Белок аргинин метилирование могут быть идентифицированы и / или определяется с помощью протеомическим подходов, и / или иммуноблоттинга с метил-аргинина специфических антител. Однако, эти методы иногда может ввести в заблуждение и часто предоставляют ложные положительные результаты. Самое главное, эти методы не могут обеспечить прямое свидетельство в поддержку PRMT субстратной специфичности. В пробирке метилирования анализы, с другой стороны, полезные биохимические анализы, которые чувствительны, и последовательно показывают, если определенные белки действительно PRMT подложки. Типичный в пробирке метилирование анализ включает очищенные активные PRMTs, очищенный субстрат и радиоизотопный помечены метил донора (S-аденозил-L [метил 3 H] метионина). Здесь мы опишем протокол шаг за шагом, чтобы изолировать каталитически активный PRMT1, а повсеместно выраженную члена PRMT семьи. Меняметил трансферазы из очищенного PRMT1 позже были протестированы на Рас-ГТФ активирующего белка связывающего белка 1 (G3BP1), известным PRMT субстрата, в присутствии S-аденозил-L- [метил-3Н] метионина в качестве донора метила. Этот протокол может быть использован не только для установления статуса метилирования новых физиологических PRMT1 субстратов, но и для понимания основной механизм белок аргинина метилирования.
Introduction
Белок метилирование был впервые описан в 1968 году 1. Он не был до первого клонирования PRMT1 в 1996 году, что исследователи начали ценить важность этого посттрансляционной модификации 2. Интересно, что примерно на 2% остатков аргинина в белках ядерных экстрактов метилированный 3, что указывает на обилие этой модификации. Аргинин представляет собой положительно заряженный аминокислотный с основной боковой цепи и азота / с в пределах боковых цепей аргинина может быть посттрансляционно изменена добавлением метильной группы, процесс, известный как аргинин метилирования 4-6. Аргинин метилирование катализируется класса ферментов именно., Белок аргинин метиловый трансферазы (PRMTs). Аргинина может быть либо монометилированного или диметилированный а последний может быть либо симметричным или асимметричным в зависимости от типа PRMTs, катализирующих процесс 4-6.
Белки, которые отображают аргинине-глицин богатые мотивы являются потенциальными мишенями для PRMT опосредованного катализа. PRMT опосредованного метилирование субстратов было показано, модулирует белок-белковое взаимодействие, взаимодействие белка-нуклеиновой кислоты, функции белка, экспрессию генов и / или передачи сигналов в клетке, все из которых имеют важное значение для нормального клеточного гомеостаза 7-9. Для того чтобы понять биологическую роль белка аргинин метилирования, точные, эффективные и воспроизводимые анализы необходимы для установления статуса метилирования выявленных PRMT субстратов.
В пробирке метилирования анализа, который оценивает способности очищенного PRMTs катализировать метилирование их субстратов, является широко признанным анализа для изучения аргинин метилирование 10-12. Общий успех этого анализа во многом зависит от активности очищенных PRMTs. PRMTs может быть выражена и очищают от бактерий или клеток млекопитающих 10,11. Это в пробирке метилирование анализ, как дetailed в разделе протокола, основана на методе, впервые описанной Tini и коллег 10. В этом протоколе, мы покажем подробно этапы в экспрессии и очистки PRMT1 в клетках млекопитающих. Способность очищенной PRMT1 катализировать метилирование на Рас-GTPase активации белка-связывающий белок 1 (G3BP1), известный PRMT подложки 8, впоследствии оценивали в присутствии S-аденозил-L-[метил-3Н] метионина в качестве метил донора. С помощью этого анализа, можно надежно определить способностей PRMTs, чтобы повести метилата или известных субстратов, который является основным шагом в изучении белок аргинина метилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Получение экспрессирующие конструкции
- Перед началом протокола, клон PRMTs минуте векторов экспрессии млекопитающих с N-терминал эпитопной меткой (Мус или HA), и подложки в рамке с глутатион-S-трансферазы (GST) для высокого уровня экспрессии белка и очистки от бактериальной клетки лизаты, с использованием стандартных молекулярно-биологических методов.
2 Очистка PRMTs
- Используйте 100 мм чашки для культивирования для поддержания человека бронхиальных эпителиальных клеток (Beas2B). Пассаж клетки каждые 3 дня и не позволяйте им расти до слияния.
- За день до трансфекции, семян 7,5 х 10 5 клеток в 10 мл культуральной среды в 100 мм блюдо культуры. Вихревой, чтобы равномерно диспергировать клетки, и инкубируют при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO 2-инкубаторе.
- На следующий день, аспирация СМИ и добавить 5 мл культуральной среде без сыворотки и антибиотиков. Вихревой и аспирации среды. Повторите этот шаг одинбольше времени, и, наконец, добавить 5 мл сыворотки / антибиотиков свободной среде и перейти к трансфекции.
- Развести 6 мкг плазмидной ДНК в 750 мкл бессывороточной среде в стерильном 1,5 мл пластиковые центрифужные пробирки.
- В другом 1,5 мл пластиковую пробирку центрифуги, разбавленной 30 мкл реагента для трансфекции в 750 мкл бессывороточной среде.
- Трансфер разбавленный раствор реагента для трансфекции (шаг 2.5) в пробирку с разбавленной ДНК (шаг 2.4). Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Инкубируйте трансфекции смеси при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Через 15 мин пипетки трансфекции смесь осторожно на клетках, вихрем, равномерно смешать и инкубировать при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO 2-инкубаторе.
- После 3 ч, аспирации среды, содержащей трансфекции смеси из клеток. Добавить свежую клеточную культуральную среду с добавлением сыворотки и антибиотиков.
- Инкубируют при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO 2инкубатор в течение 48 часов.
- Через 48 ч лизиса клеток в 1 мл лизирующего буфера (1x фосфатным буферным раствором, 1% Nonidet Р-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% додецилсульфата натрия и 1 мкг / мл phenlymethyl сульфонил фторид). Сбор лизатов в пластиковой центрифужной пробирке с сотовым подъемника и инкубировать лизатов на льду в течение 30 мин.
- Центрифуга лизатов при 15000 мкг в течение 10 мин на скамейке центрифуге, чтобы очистить лизатов из клеток мусора. [* Настоятельно рекомендуется, чтобы подтвердить экспрессию HA-PRMT1 через иммуноблотинга аликвоты лизатов с анти-Ха антител, прежде чем приступить к очистке ферментов для метилирования анализа.]
- Для очистки PRMTs, инкубировать 3 мг клеточных лизатов с 30 мкл суспензии 50:50 анти-Ха аффинной матрицы в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), и поворот в течение ночи при 4 ° С в трубчатой ротатора.
- На следующий день, спина пробирки при 14000 мкг на скамейке центрифуге в течение 2 мин, чтобы собратьшарики. Жидкость над осадком сливают и мыть шарики 3x 1 мл RIPA буфере [20 мМ Трис (рН 8,0), 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА и 1% Triton-X-100] в каждой промывки с последующим центрифугированием при 14000 х г в течение 2 мин. После третьей промывки, мыть шарики один раз 100 мкл метилирования буфере (50 мМ Трис, рН 8,5, 20 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 100 мМ сахароза). После центрифугирования удалите супернатант. Гранулы, содержащие иммобилизованные PRMTs готовы быть использованы в анализе метилирования. [* Настоятельно рекомендуется немедленно использовать иммобилизованные PRMTs в метилирования анализа.]
3 Очистка субстрата
- Инокуляции одну колонию от GST-G3BP1 преобразованы BL21 в 5 мл Лурии-Бертани (LB) среды, содержащей 100 мкг / мл ампициллина. Grow культур в течение ночи при 37 ° C при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
- На следующий день, передавать ночной культуры в 50 мл свежей LB среды и продолжениеinue расти к OD 600 из 0,5-0,7 (Она занимает около 2 ч).
- Когда наружный диаметр 600 достигает 0,5-0,7, добавить изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и продолжают культуре в течение дополнительных 4 ч при 37 ° С при встряхивании при 250 оборотах в минуту.
- Сбора клеток центрифугированием при 1500 х г в течение 10 мин, и обработать гранул для очистки GST или хранить при температуре -80 ° С.
- Повторное приостановить бактериальный осадок в 5 мл буфера для лизиса (1х PBS с ингибиторами протеазы, 100 мкг / мл лизоцима и 0,1% Triton-X-100) и лизаты инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. В это время лизаты появится мутной и вязкой вследствие высвобождения бактериальной геномной ДНК.
- На сдвиг геномной ДНК с помощью ультразвука (10 импульсов 1 сек каждой с амплитудой 30%).
- Очистка с лизатов центрифугированием при 15000 х г в течение 10 мин и передавать прозрачный супернатант в 15 мл пробирку. Если супернатант не ясно повторить centrifuдование процесс еще раз.
- Между тем, мыть GST-сефарозы дважды ледяной PBS и сделать 50:50 приостановление GST-сефарозе в PBS. Добавить 200 мкл GST-сефарозой суспензии очищенного лизата клеток бактерий и вращать при 4 ° С в течение 1 часа.
- Через 1 ч пробирки центрифуги при 500 х г в течение 3 мин, чтобы собрать шарики. Вымойте бисером 3x ледяной PBS.
- После последней промывки, ресуспендируют бисером в 100 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 30 мМ глутатион) и вращать при 4 ° С в течение 10 мин.
- Центрифуга трубки при 15000 х г в течение 2 мин и передачи супернатант, содержащий очищенный белок в другой пластиковой центрифужной пробирке. Провести электрофорез в полиакриламидном геле SDS (SDS-PAGE) Анализ на 5 мкл очищенного белка вместе с известными количествами бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы оценить концентрацию очищенного белка.
4 Метилирование Анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в отдельном районе, выделенном для радиоизотопной работы и в соответствии с протоколами учреждения по проведению экспериментов с радиоактивными изотопами.
- Добавить 2 мкг очищенного GST-подложки и мастер-смеси, содержащей 1х буфере метилирования (50 мМ Трис, рН 8,5, 20 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 100 мМ сахароза), 1 мкКи S-adenosyl- L-[метил-3Н] метионин, и вода до конечного объема 10 мкл с иммобилизованным PRMTs (шаг 2,13) и инкубируют реакционную смесь при 30 ° С в течение 1 часа.
- Через 1 час, остановить реакцию, добавив 10 мкл 2x SDS образец буфера. После денатурации образцов при 95 ° С в течение 10 мин, отдельные образцы на SDS-PAGE геле.
- Позже, передавать выделенные белки из геля ДСН на нитроцеллюлозную мембрану с использованием полусухого электрофоретического переноса.
- После передачи, покрыть мембрануutofluor (авторадиографические ЭОП), и осторожно встряхнуть в течение 2 часов при комнатной температуре. Через 2 часа, слить autofluor и сохранить для последующего использования. [* Этикетка трубку как радиоактивных материалов]
- Быстро воздух сухой мембраны на фильтровальной бумаге, запечатать его в пластиковый пакет и подвергнуть мембрану к рентгеновской пленке при -20 ° С. Достаточное время экспозиции составляет от 5-30 дней.
5 Подтверждение PRMT слова и равных Загрузка субстрата
- После достижения достаточного воздействия, передать через мембрану в пластиковой коробке, содержащей блокирующий буфер [трис-буферный солевой раствор с Tween-20 (TBST + 3% обезжиренным молоком)] и осторожно рок в течение 1 часа.
- Откажитесь от блокирующий буфер как радиоактивных отходов. Выдержите мембрану с анти-HA антитела (1: 1000 разбавления) в TBST в течение ночи при 4 ° C, с нежным покачиванием.
- Вымойте мембрану TBST 3x и инкубировать мембрану с HRP-меченными анти-мыши вторичного антитела(1: 5000 разведение) в TBST при комнатной температуре в течение 1 часа при осторожном качания.
- После 1 ч, промывают TBST мембраны с 3x, и выполнять обнаружение chemiluminiscence белков с HRP субстрат.
- После обнаружения HA-меченых PRMTs на, инкубировать мембрану Ponseau-S окрашивающим раствором в течение 5 мин при комнатной температуре. Быстро промыть мембраны 3 раза водой, чтобы обнаружить GST-меченый субстраты. Сканирование изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способности HA-PRMT1 метилировать GST-G3BP1 определялись в пробирке метилирования анализа. HA-меткой PRMT1 очищен из клеточных лизатов Beas2B был использован в реакции метилирования, содержащей GST-G3BP1 и 1 мкКи S-аденозил-L- [метил-3Н] метионина, как метил донора. PRMT1 может эффективно катализировать метилирование GST-G3BP1 (рис 1, верхняя панель). Метилирования реакций с использованием отжимания, выполненные на лизатов трансфицированных пустым вектором Beas2B клеток служили в качестве негативного контроля (фиг.1, верхняя панель, дорожка 1). Иммуноблоттинг с анти-ГА антител подтвердили выражение PRMT1 (Рисунок 1, средняя панель). Ponseau-S окрашивание используется для демонстрации равного загрузку GST-G3BP1 в обеих реакциях (рисунок 1, нижняя панель).
1997 / 51997fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рис.1 PRMT1 метилаты G3BP1. PRMT1 опосредованного G3BP1 метилирование оценивали с помощью экстракорпорального метилирования реакцию в который включает HA-тегами PRMT1 очищенный от Beas2B клеточных лизатов, GST-G3BP1 очищенной от Е. палочка, и S-аденозил-L-[метил-3Н] метионин, как метил донора. Верхняя панель представляет собой флюорограф для G3BP1 метилирования. Средняя панель представляет иммуноблот, подтверждающий выражение HA-меткой PRMT1. И, нижняя панель представляет Ponseau-S окрашенных блот для определения, равную нагрузку на подложке (GST-G3BP1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, обычно используется для установления статуса метилирования выявленных PRMT субстратов. Эта надежная, и в соответствии анализ также предоставит окончательные доказательства на специфике PRMTs для их субстратов. Основные компоненты для успеха этого анализа являются: 1 Экспрессия PRMTs в клетках млекопитающих, 2 Активность очищенных PRMTs, 3 Экспрессия и очистка подложки, и 4 Полный западный перенос белков к нитроцеллюлозной мембране.
Рекомбинантные PRMTs выражена, и очищенный от бактерий можно также использовать в ин витро метилирования реакций 10,11,13. Однако, так как каждый PRMT требуется отличается очистки стратегии, условия хранения и температуры хранения, использование рекомбинантных PRMTs в в пробирке метилирования реакции могут не быть идеальным. Кроме того, рекомбинантные PRMTs также недолгим 11. С учетом этих задач, мы считаем, что пурфикация из PRMTs из клеток млекопитающих удобно, и согласуется выполнять в пробирке реакции метилирования. Если переходный выражение PRMTs в клетках млекопитающих по-видимому, будет неудобно, в качестве альтернативы, можно считать, что делает стабильных клеточных линий для PRMTs. Самое главное, выражение PRMTs в клетках млекопитающих является единственным способом можно определить PRMT каталитическую активность в ответ на стимулы, например, факторы роста, цитокины и т.д.
Основное ограничение использования PRMTs очищенные от источников млекопитающих является загрязнение с другими PRMTs в процессе очистки. Тем не менее, можно было бы использовать мутантные конструкции из PRMTs, которые лишены метилтрансферазы деятельности в качестве дополнительных элементов управления. Если PRMTs под следствием могут образовывать гомодимеры, мутантные конструкции не могут быть хорошими управления. Кроме того, можно рассмотреть вопрос об использовании PRMTs очищенные из клеток истощенных целевых PRMTs в качестве отрицательного контроля или использовать рекомбинантныйPRMTs от бактериальных источников. Представленный протокол описывает простой, удобный, и последовательную анализа зондировать белка аргинин метилирование. Описанный метод является не только решающее значение для выявления и установления статуса метилирования новых PRMT субстратов, но и для нашего основного понимания механизма белок аргинина метилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Merit Award от американского Департамента по делам ветеранов, и NIH предоставить R01CA138528 чтобы RW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
References
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T.
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
