Summary
Protein arginin metylering, katalysert av en klasse av enzymer viz. Protein arginin metyl transferaser (PRMTs), prosessen for enzymatisk tilsetning av metyl-gruppen (e) til arginines innenfor proteiner. Den in vitro-metylering analysen er den mest pålitelige verktøy for å bedømme status for metylering kjente eller nye PRMT substrater.
Abstract
Protein arginin metylering er en av de mest tallrike posttranslasjonelle modifikasjoner i kjernen. Protein arginin metylering kan identifiseres og / eller bestemmes via proteomic nærmer seg, og / eller immunoblotting med metyl-arginin-spesifikke antistoffer. Imidlertid er disse teknikker kan noen ganger være misvisende og gir ofte falske positive resultater. Viktigst, kan disse teknikkene ikke gir direkte bevis til støtte for PRMT substratspesifisitet. In vitro assays metylering, på den annen side, er nyttige biokjemiske analyser, som er følsom, og konsekvent avdekke om de identifiserte proteiner er faktisk PRMT substrater. Et typisk in vitro-analysen omfatter metylering rensede, aktive PRMTs, renset substrat og en radioisotop-merket metyl donor (S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin). Her beskriver vi en steg-for-steg-protokollen for å isolere katalytisk aktivt PRMT1, en ubiquitously uttrykt PRMT familiemedlem. Den megmetyl- transferase aktivitet av det rensede PRMT1 ble senere testet på Ras-GTPase aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), en kjent PRMT substrat, i nærvær av S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin som metyl donor. Denne protokollen kan bli benyttet ikke bare for å etablere en status metylering av nye fysiologiske PRMT1 substrater, men også for å forstå den grunnleggende mekanisme for protein arginin metylering.
Introduction
Protein metylering ble først beskrevet i 1968. 1. Det var ikke før den første kloning av PRMT1 i 1996, at forskere begynte å forstå viktigheten av denne post-translasjonell modifikasjon to. Interessant nok er omtrent 2% av arginin rester i proteiner av nukleære ekstrakter metylert 3, som indikerer at overflod av denne modifikasjon. Arginin er en positivt ladet aminosyre med en sidekjede, og grunnleggende nitrogen / s i løpet av sidekjedene av arginin kan være post-translasjonelt modifisert gjennom tilsetning av en metylgruppe, en prosess kjent som arginin metylering 4-6. Arginin metylering er katalysert av en klasse av enzymer viz. Protein, arginin metyl-transferaser (PRMTs). Arginines kan enten monomethylated eller dimethylated og sistnevnte kan være enten symmetrisk eller asymmetrisk alt etter den type PRMTs katalyserende prosess 4-6.
Proteiner som viser Arginine-glysin rike motiver er potensielle mål for PRMT-mediert katalyse. PRMT-mediert metylering av substrater er vist å modulere protein-protein interaksjon, protein-nukleinsyre interaksjon, proteinfunksjon, genekspresjon og / eller cellulær signalisering, som alle er kritisk for normal cellulær homeostase 7-9. For å forstå den biologiske rolle av protein arginin metylering, er nøyaktig, effektiv og reproduserbar analyser som kreves for å etablere den metylering status for de identifiserte PRMT substrater.
In vitro-assay metylering, som evaluerer evnene rensede PRMTs å katalysere metylering av deres substrater, er en godt akseptert test for å studere arginin metylering 10-12. Den generelle suksess for denne analysen avhenger i stor grad aktiviteten av de rensede PRMTs. PRMTs kan bli uttrykt og renset fra bakterier, pattedyrceller eller 10,11. Denne in vitro-assay metylering, som detailed i protokollen delen, er basert på en metode som opprinnelig ble beskrevet av Tini og kolleger 10. I denne protokollen, viser vi i detalj trinnene involvert i uttrykket og rensing av PRMT1 i pattedyrceller. Evnen til rensede PRMT1 å katalysere metylering på Ras-GTPase aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), en kjent PRMT substrat 8, ble senere undersøkt i nærvær av S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin som den metyl donor. Ved hjelp av dette assay, kan vi definere pålitelig evnene til PRMTs til metylat nye eller kjente substrater, som er et primært trinn i studiet av protein arginin metylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av ekspresjonskonstruksjoner
- Før start av protokollen, klone PRMTs i mammalske ekspresjonsvektorer med en N-terminal epitop tag (Myc eller HA), og substratet i-ramme med glutation-S-transferase (GST) for high-level protein ekspresjon og rensing av bakterielt celle lysater, ved hjelp av standard molekylærbiologiske teknikker.
2. Rensing av PRMTs
- Bruk 100 mm kultur retter å opprettholde menneske bronkial epitelceller (Beas2B). Passage cellene hver 3 dager og ikke la dem vokse til samløpet.
- På dagen før transfeksjon, frø 7,5 x 10 5 celler i 10 ml kulturmedium i et 100 mm dyrkningsskål. Swirl å jevnt dispergere cellene, og inkuberes ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator.
- Den neste dagen, aspirer media og tilsett 5 ml vekstmedium uten serum og antibiotika. Virvle og aspirer mediet. Gjenta dette trinnet énmer tid, og til slutt legge til 5 ml serum / antibiotika fritt medium og fortsett til transfeksjon.
- Fortynn 6 ug plasmid DNA i 750 ul serumfritt medium i et sterilt 1,5 ml plast sentrifugerør.
- I en annen 1,5 ml plast sentrifugerør, fortynne 30 pl av reagens transfeksjon inn i 750 ul serumfritt medium.
- Overfør den fortynnede transfeksjon reagens-løsning (trinn 2.5) til røret inneholdende fortynnet DNA (trinn 2.4). Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned flere ganger.
- Inkuber transfeksjon blandingen ved romtemperatur i 15 min.
- Etter 15 min, pipette transfeksjon blandingen forsiktig på cellene, til virvel blande jevnt, og inkuberes ved 37 ° C i en fuktet 5% CO2-inkubator.
- Etter 3 timer, aspirere mediet innehold transfeksjon blandinger fra cellene. Legg frisk cellekulturmedium supplert med serum og antibiotika.
- Inkuberes ved 37 ° C i en 5% fuktet CO 2inkubator i 48 timer.
- Etter 48 hr, lysere cellene i 1 ml lyseringsbuffer (1 x fosfatbufret saltløsning, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat og 1 ug / ml phenlymethyl sulfonyl fluorid). Samle lysater i en plast sentrifugerør med en celle løfteren og inkuber lysater på is i 30 min.
- Sentrifuger lysatene på 15.000 xg i 10 min på en benk-top sentrifuge for å fjerne lysatene fra celleavfall. [* Det anbefales å bekrefte ekspresjon av HA-PRMT1 via immunoblotting av en alikvot av de lysater med anti-HA-antistoffer, før man fortsetter til rensing av enzymer for metylering assay.]
- For rensing av PRMTs, inkuberes med 3 mg av cellelysater med 30 pl av 50:50 suspensjon av anti-HA affinitet matrise i fosfatbufret saltvann (PBS), og rotere over natten ved 4 ° C i et rør rotator.
- Neste dag, spinne rørene på 14.000 xg på en benk-top sentrifuger i 2 min for å samleperlene. Kast supernatanten og vasking av perlene som 3x med 1 ml RIPA-buffer [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA og 1% Triton-X-100] i hver vask, etterfulgt av sentrifugering ved 14.000 xg i 2 min. Etter den tredje vask, vaske perlene en gang med 100 mL av metylering buffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM sukrose). Etter sentrifugering, fjern supernatanten. Perlene inneholdende de immobiliserte PRMTs er klar til å bli brukt i metylering assay. [* Det anbefales sterkt å bruke immobilisert PRMTs umiddelbart i metylering analysen.]
3. Rensing av substrat
- Vaksinere en enkelt koloni av GST-G3BP1 forvandlet BL21 inn i 5 ml Luria-Bertani (LB) medium som inneholder 100 mikrogram / ml ampicillin. Grow kulturer over natten ved 37 ° C med risting ved 250 rpm.
- Neste dag, overføre natten kultur til 50 ml nytt LB-medium og fortsinue å vokse til en OD 600 av 0,5-0,7 (Det tar ca 2 timer).
- Når OD 600 når 0,5-0,7, tilsett isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 1 mM, og fortsette å kultur for ytterligere 4 timer ved 37 ° C med rysting ved 250 rpm.
- Høste cellene ved sentrifugering ved 1500 xg i 10 min, og behandle pelleten for GST rensing eller lagres ved -80 ° C.
- Re-suspen den bakterielle pelleten i 5 ml lyseringsbuffer (1 x PBS med proteaseinhibitorer, 100 ug / ml lysozym og 0,1% Triton-X-100) og inkuber lysater ved 37 ° C i 30 min. På denne tiden lysates vises grumsete og tyktflytende på grunn av utgivelsen av bakteriell genomisk DNA.
- Skjær det genomiske DNA ved sonikering (10 pulser av 1 sek hver med en amplitude på 30%).
- Fjern de lysater ved sentrifugering ved 15.000 xg i 10 min, og overføre den klare supernatanten til et 15 ml rør. Dersom supernatanten er ikke klart gjenta sentrifugaleikrings prosessen en gang til.
- I mellomtiden, vaske GST-sefarose perler to ganger med iskald PBS og foreta en 50:50 suspensjon av GST-sepharose i PBS. Tilsett 200 pl av den GST-sepharose suspensjonen til erte bakterie cellelysat og rotere ved 4 ° C i 1 time.
- Etter 1 time, sentrifugere rørene ved 500 x g i 3 min for å samle perlene. Vask kulene 3x med iskald PBS.
- Etter den siste vask, resuspendere kulene i 100 ul elueringsbuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutation) og rotere ved 4 ° C i 10 min.
- Sentrifuger ved 15.000 xg rør i 2 min, og supernatanten innehold overføre det rensede protein til en annen plast sentrifugerør. Utfør SDS polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) analyse på 5 pl av det rensede protein sammen med kjente mengder av bovint serumalbumin (BSA) for å beregne konsentrasjonen av det rensede protein.
4. Metylering Assay
MERK: Utfør følgende trinn i et eget område utpekt for radioisotop arbeid og i samsvar med institusjonens protokoller for å utføre eksperimenter med radioaktive isotoper.
- Tilsett 2 ug av renset GST-substrat og en konsentrat-blanding inneholdende 1 x metylering buffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM sakkarose), 1 uCi av S-adenosylhomocysteinhydrolasen L-[metyl-3H] metionin, og vann til et sluttvolum på 10 pl til det immobiliserte PRMTs (trinn 2.13) og inkuberes reaksjonen ved 30 ° C i 1 time.
- Etter 1 time, stopp reaksjonen ved å tilsette 10 ul av 2 x SDS-prøvebuffer. Etter denaturering av prøvene ved 95 ° C i 10 min, atskille prøvene på en SDS-PAGE-gel.
- Senere, overfører de separerte proteiner fra SDS-gelen på nitrocellulose-membran ved hjelp av en semi-tørr elektrooverføring.
- Etter overføringen dekke membranen med enutofluor (et autoradiografisk bilde forsterker), og rist i 2 timer ved romtemperatur. Etter 2 timer, hell av autofluor og beholde for senere bruk. [* Etikett røret som radioaktivt materiale]
- Raskt luft tørke membranen på et filterpapir, forsegle den i en plastpose og utsette membranen for en røntgenfilm ved -20 ° C. Tilstrekkelig eksponeringstid varierer mellom 5-30 dager.
5. Bekreftelse av PRMT Expression og lik belastning av substrat
- Etter å oppnå tilstrekkelige eksponeringer, overføre membranen til en plastboks som inneholder blokkerende buffer [tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBST + 3% ikke-fettmelk)], og rist i 1 time.
- Kast blokkering buffer som radioaktivt avfall. Inkuber membran med anti-HA-antistoff (1: 1000 fortynning) i TBST over natten ved 4 ° C, med milde rocking.
- Vask membranen med TBST 3x og inkuber membranen med HRP-merket anti-mus-sekundært antistoff(1: 5000 fortynning) i TBST ved romtemperatur i 1 time med forsiktig gynger.
- Etter 1 time, vaskes membranen med TBST 3x, og utføre chemiluminiscence påvisning av proteiner med et HRP-substrat.
- Etter påvisning av HA-tagget PRMTs, inkubere membranen med Ponseau-S farging oppløsningen i 5 minutter ved romtemperatur. Raskt vaske membran 3x med vann for å oppdage GST-merket underlag. Skanne bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evnene til HA-PRMT1 å metilat GST-G3BP1 ble bestemt av en in vitro metylering analysen. HA-merket PRMT1 renset fra Beas2B cellelysater ble anvendt i en reaksjon inneholdende GST metylering-G3BP1, og 1 uCi av S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin, som en metyl-donor. PRMT1 kunne effektivt katalysere metylering av GST-G3BP1 (Figur 1, øvre panel). Metylering reaksjoner ved bruk av rullegardin utført på lysates av tom vektor transfekterte Beas2B celler fungerte som en negativ kontroll (Figur 1, øvre panel, lane 1). Immunoblotting med anti-HA antistoff bekreftet uttrykk for PRMT1 (Figur 1, midtpanelet). Ponseau-S farging ble anvendt for å demonstrere lik belastning av GST-G3BP1 i begge reaksjonene (Figur 1, nedre panel).
1997 / 51997fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. PRMT1 methylates G3BP1. PRMT1-mediert G3BP1 metylering ble evaluert ved hjelp av en in vitro metyleringen som inkluderer HA-tagget PRMT1 renset fra Beas2B cellelysater, GST-G3BP1 renset fra E. coli, og S-adenosyl-L-[metyl-3H] metionin, som en metyl-donor. Øvre panel representerer fluorograph for G3BP1 metylering. Midtre panelet representerer immunoavtrykket bekrefter uttrykk for HA-merket PRMT1. Og, representerer den nedre platen Ponseau-S blot farget for å bestemme lik belastning av substratet (GST-G3BP1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokoll som er beskrevet her brukes rutinemessig for å etablere den metylering status for de identifiserte PRMT substrater. Denne robuste, og konsekvent analysen vil også gi definitive bevis på det spesielle ved PRMTs for sine underlag. De viktigste komponenter for suksess for denne analysen er: 1. Ekspresjon av PRMTs i pattedyrceller, 2. Aktivitet av rensede PRMTs, 3. Ekspresjon og rensing av substrat, og 4. Fullstendig western overføring av proteinene til nitrocellulose-membran.
Rekombinante PRMTs uttrykt og renset fra bakterier kan også benyttes i in vitro-metylering reaksjoner 10,11,13. Men siden hver PRMT krever ulike rense strategier, lagringsforhold og lagringstemperaturer, bruk av rekombinante PRMTs i in vitro metylering reaksjoner kan ikke være ideelt. Videre rekombinante PRMTs er også kortvarig 11. Vurderer disse utfordringene, vi tror at purreduser fuktighet av PRMTs fra pattedyrceller er praktisk, og konsekvent for å utføre in vitro metylering reaksjoner. Ved forbigående ekspresjon av PRMTs i pattedyrceller ser ut til å være upraktisk, alternativt, kan man vurdere å lage stabile cellelinjer for PRMTs. Viktigst er uttrykk for PRMTs i pattedyrceller er den eneste måte tilgjengelig for å bestemme PRMT katalytiske aktiviteter som respons på stimuli for eksempel vekstfaktorer, cytokiner, etc.
Den viktigste begrensning for å bruke PRMTs renset fra pattedyrkilder er forurensning med andre PRMTs under renseprosessen. Men man kunne bruke mutant konstruksjonen av PRMTs som er blottet for methyl transferase aktiviteter som flere kontroller. Hvis PRMTs under etterforskning kan danne homodimers, kanskje mutant konstruerer ikke være gode kontroller. Alternativt kan man vurdere å bruke PRMTs renset fra celler utarmet av målet PRMTs som en negativ kontroll eller bruke rekombinantPRMTs fra bakteriekilder. Den presenterte protokollen beskriver en enkel, praktisk og konsistent analyse for å sondere protein arginin metylering. Den beskrevne fremgangsmåte er ikke bare nødvendig for identifikasjon og etablering av metylering status av nye PRMT substrater, men også for vår grunnleggende forståelse av mekanismen for protein arginin metylering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av en Merit Award fra US Department of Veterans Affairs, og en NIH gi R01CA138528 til RW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
References
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T.
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
