In vitro Methylering Assay til at studere protein Arginin Methylering

Summary

Protein arginin methylering, katalyseret af en klasse af enzymer, nemlig. Protein arginin metyltransferaser (PRMTs), er processen med enzymatisk tilsætning af methyl-gruppe (r) til argininer i proteiner. In vitro methylering analysen er den mest pålidelige redskab til at vurdere status for methylering af kendte eller nye PRMT substrater.

Abstract

Protein arginin methylering er en af ​​de mest rigelige post-translationelle modifikationer i kernen. Protein arginin methylering kan identificeres og / eller bestemmes via proteom tilgange, og / eller immunoblotting med methyl-arginin specifikke antistoffer. Men disse teknikker kan undertiden være vildledende og giver ofte falske positive resultater. Vigtigst er det, kan disse teknikker ikke giver direkte beviser til støtte for den PRMT substrat specificitet. In vitro-methylering assays på den anden side, er nyttige biokemiske analyser, som er følsomme, og konsekvent afsløre, om de identificerede proteiner er faktisk PRMT substrater. En typisk in vitro-methylering assayet omfatter oprensede, aktive PRMTs, renset substrat og en radioaktiv isotop mærket methyldonor (S-adenosyl-L ^[methyl-3H] methionin). Her beskriver vi en trin-for-trin-protokollen til at isolere katalytisk aktiv PRMT1, en allestedsnærværende udtrykt PRMT familiemedlem. Det migthyl transferase aktiviteter oprensede PRMT1 blev senere testet Ras-GTPase-aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), et kendt PRMT substrat, i nærvær af S-adenosyl-L ^[methyl-3H] methionin som methyl donor. Denne protokol kan anvendes ikke kun til oprettelse status for methylering af nye fysiologiske PRMT1 substrater, men også for at forstå den grundlæggende mekanisme af protein arginin methylering.

Introduction

Protein methylering blev første gang beskrevet i 1968 ^1. Det var ikke før den første kloning af PRMT1 i 1996, at forskerne begyndte at værdsætte betydningen af denne post-translationel ² modifikation. Interessant er omkring 2% af argininrester i proteiner af kerneekstrakter methyleret ^3, indikerer forekomsten af denne ændring. Arginin er en positivt ladet aminosyre med en basisk sidekæde og nitrogen / s i kæder af arginin side kan være posttranslationelt modificeret ved tilsætning af en methylgruppe, en proces kendt som arginin methylering ^4-6. Arginin methylering katalyseres af en klasse af enzymer, nemlig., Protein arginin metyltransferaser (PRMTs). Argininer kan enten monomethylerede eller dimethylerede og sidstnævnte kan enten være symmetrisk eller asymmetrisk afhængigt af PRMTs katalyserer processen ^4-6.

Proteiner, der viser arginine-glycinrigt motiver er potentielle mål for PRMT-medieret katalyse. PRMT-medieret methylering af substrater har vist sig at modulere protein-protein-interaktion, protein-nukleinsyre interaktion, proteinfunktion, genekspression og / eller cellulær signalering, som alle er kritiske for normal cellulær homøostase ^7-9. For at forstå den biologiske rolle af protein arginin methylering, er præcise, effektive og reproducerbare analyser forpligtet til at fastslå status for methylering af de identificerede PRMT substrater.

In vitro-methylering assay som vurderer evner oprensede PRMTs at katalysere methylering af deres substrater, er et godt accepteret assay for at studere arginin methylering ^10-12. Den samlede succes for denne analyse i vid udstrækning afhænger af aktiviteten af ​​de oprensede PRMTs. PRMTs kan udtrykkes og oprenses fra bakterier eller pattedyrceller ^10,11. Denne in vitro-methylering assay som dETALJERET i protokollen afsnit er baseret på en metode oprindeligt beskrevet af Tini og kolleger ^10. I denne protokol, viser vi i detaljer de trin, der er involveret i ekspression og oprensning af PRMT1 i pattedyrceller. Evnen af det oprensede PRMT1 at katalysere methylering Ras-GTPase-aktiverende protein-bindende protein 1 (G3BP1), et kendt PRMT substrat ^8, blev senere undersøgt i nærvær af S-adenosyl-L ^[methyl-3H] methionin som methyl donor. Ved hjælp af dette assay kan vi pålideligt definere evner PRMTs til methylat roman eller kendte substrater, som er en primær trin i undersøgelsen af ​​protein arginin methylering.

Protocol

1. Fremstilling af ekspressionskonstruktioner

1. Før start af protokol klon PRMTs i mammale ekspressionsvektorer med en N-terminal epitop-mærke (Myc eller HA), og substratet i ramme med glutathion-S-transferase (GST) til højt niveau proteinekspression og oprensning fra bakteriecellen lysater ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker.

2. Oprensning af PRMTs

1. Brug 100 mm dyrkningsskåle at opretholde humane bronchiale epithelceller (Beas2B). Passage cellerne hver 3 dage og ikke lade dem vokse til konfluens.
2. På dagen før transfektion frø 7,5 x 10 ⁵ celler i 10 ml dyrkningsmedium i en 100 mm dyrkningsskål. Swirl jævnt dispergere cellerne og inkuberes ved 37 ° C i en 5% befugtet _{CO2-inkubator.}
3. Den næste dag, aspireres medierne og tilsættes 5 ml kulturmedier uden serum og antibiotika. Swirl opsuges mediet. Gentag dette trin énmere tid, og til sidst tilsættes 5 ml serum / antibiotisk frit medium og fortsætte til transfektion.
4. Fortynd 6 ug plasmid-DNA i 750 ul serumfrit medium i en steril 1,5 ml centrifugerør af plastic.
5. I en anden 1,5 ml plastik centrifugerør, fortyndes 30 pi transfektionsreagens i 750 pi serumfrit medium.
6. Overfør den fortyndede transfektionsreagens opløsning (trin 2.5) til rør indeholdende fortyndet DNA (trin 2.4). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned adskillige gange.
7. Inkubér transfektion blandingen ved stuetemperatur i 15 minutter.
8. Efter 15 min afpipettér transfektion blandingen forsigtigt på cellerne, at hvirvel blandes jævnt, og der inkuberes ved 37 ° C i en 5% befugtet _{CO2-inkubator.}
9. Efter 3 timer, aspireres mediet indeholdende transfektionseksperimenter blandinger fra cellerne. Tilføj frisk cellekulturmedium suppleret med serum og antibiotika.
10. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% befugtet _CO2inkubator i 48 timer.
11. Efter 48 timer, lysere cellerne i 1 ml lysisbuffer (1x phosphatpufret saltvand, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat, og 1 ug / ml phenlymethyl sulfonyl fluorid). Saml lysaterne i en plastik centrifugerør med en celle løfteren og inkuber lysaterne på is i 30 minutter.
12. Centrifugeres lysaterne ved 15.000 xg i 10 min på en bordcentrifuge for at fjerne lysater fra cellerester. [* Det anbefales stærkt at bekræfte ekspressionen af ​​HA-PRMT1 via immunblotning af en portion af lysaterne med anti-HA-antistoffer, før du fortsætter til oprensning af enzymer til methylering analyse.]
13. Til oprensning af PRMTs, inkuberes 3 mg cellelysater med 30 pi 50:50 suspension af anti-HA-affinitetsmatrix i phosphatbufret saltvand (PBS), og rotere natten over ved 4 ° C i et rør rotator.
14. Næste dag, dreje rørene ved 14.000 xg på en bordcentrifuge i 2 minutter for at indsamleperlerne. Supernatanten fjernes, og vaske perlerne 3x med 1 ml RIPA-buffer [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCI, 5 mM EDTA og 1% Triton-X-100] i hver vask efterfulgt af centrifugering ved 14.000 xg i 2 min. Efter den tredje vask, vaske perlerne en gang med 100 ul methylering puffer (50 mM Tris, pH 8,5, 20 mM KCI, 10 mM _MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM saccharose). Efter centrifugering, supernatanten fjernes. Perlerne indeholder de immobiliserede PRMTs er klar til at blive anvendt i methylering assayet. [* Det anbefales stærkt at bruge de immobiliserede PRMTs straks i methylering analysen.]

3. Oprensning af Substrat

1. Podes en enkelt koloni af GST-G3BP1 transformeret BL21 i 5 ml Luria-Bertani (LB) medium indeholdende 100 ug / ml ampicillin. Grow kulturerne natten over ved 37 ° C med rystning ved 250 rpm.
2. Næste dag, overføre natten over kultur til 50 ml frisk LB-medium og fortsinue at vokse til en _OD600 på 0,5-0,7 (Det tager omkring 2 timer).
3. Når _OD600 når 0,5-0,7 tilsættes isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) til en slutkoncentration på 1 mM, og fortsætte til kultur yderligere 4 timer ved 37 ° C med rystning ved 250 rpm.
4. Høst cellerne ved centrifugering ved 1.500 xg i 10 min, og behandle pellets GST oprensning eller opbevares ved -80 ° C.
5. Resuspender den bakterielle pellet i 5 ml lyseringsbuffer (1x PBS med proteaseinhibitorer, 100 ug / ml lysozym og 0,1% Triton-X-100) og inkuberes lysaterne ved 37 ° C i 30 minutter. På dette tidspunkt lysaterne vises uklar og viskos på grund af frigivelse af bakterielt genomisk DNA.
6. Forskyde genomisk DNA ved hjælp af sonikering (10 pulser af 1 sek hver med en amplitude på 30%).
7. Fjern lysaterne ved centrifugering ved 15.000 x g i 10 minutter og overføre den klare supernatant til et 15 ml rør. Hvis supernatanten er ikke klart gentage centrifugelse proces en gang til.
8. I mellemtiden vaske GST-sepharoseperler to gange med iskold PBS og gøre en 50:50 suspension af GST-sepharose i PBS. Tilsæt 200 pi af GST-sepharose suspension ryddet bakterielle cellelysat og rotere ved 4 ° C i 1 time.
9. Efter 1 time, centrifugeres rørene ved 500 xg i 3 minutter at indsamle perlerne. Vask perlerne 3x med iskold PBS.
10. Efter den sidste vask resuspenderes perlerne i 100 ul elueringspuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCI, 30 mM glutathion) og rotere ved 4 ° C i 10 min.
11. Centrifuger rørene ved 15.000 xg i 2 min og overføre supernatanten indeholdende det rensede protein til et andet centrifugerør af plastic. Foretag SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)-analyse på 5 ul af det oprensede protein sammen med kendte mængder af bovint serumalbumin (BSA) for at estimere koncentrationen af ​​det oprensede protein.

4. Methylering Assay

BEMÆRK: Udfør følgende trin i et separat område, der er udpeget til radioaktive isotop arbejde og i overensstemmelse med institutionens protokoller om at udføre eksperimenter med radioaktive isotoper.

1. Tilsæt 2 ug oprenset GST-substrat og en master-blanding indeholdende 1x methylering puffer (50 mM Tris, pH 8,5, 20 mM KCI, 10 mM _MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM saccharose), 1 uCi S-adenosyl- ^{L-[methyl-3H]} methionin og vand til et slutvolumen på 10 pi til de immobiliserede PRMTs (trin 2.13) og inkubere reaktionen ved 30 ° C i 1 time.
2. Efter 1 time stoppe reaktionen ved tilsætning af 10 pi 2x SDS prøvebuffer. Efter denaturering af prøverne ved 95 ° C i 10 min, adskille prøverne på en SDS-PAGE-gel.
3. Senere overføres de adskilte proteiner fra SDS-gel nitrocellulosemembran ved anvendelse af en halvtør elektroforetisk overførsel.
4. Efter overførslen, dække membran med enutofluor (et autoradiografisk billede forstærker), og vip forsigtigt i 2 timer ved stuetemperatur. Efter 2 timer, hæld autofluor og gemme den til senere brug. [* Mærk røret som radioaktivt materiale]
5. Hurtigt lufttørre membranen på et filter papir, forsegle den i en plasticpose og udsætte membranen til en røntgenfilm ved -20 ° C. Tilstrækkelig eksponeringstid svinger mellem 5-30 dage.

5. Bekræftelse af PRMT Expression og Equal Loading af substrat

1. Efter at have opnået en tilstrækkelig eksponering overføres membranen til en plastboks indeholdende blokerende buffer [Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBST + 3% fedtfri mælk)] og vip forsigtigt i 1 time.
2. Kassér blokerende buffer som radioaktivt affald. Inkuber membranen med anti-HA-antistof (1: 1.000 fortynding) i TBST natten over ved 4 ° C med blid vuggen.
3. Vask membranen med TBST 3x og inkuberes membranen med HRP-mærket anti-muse-sekundært antistof(1: 5.000 fortynding) i TBST ved stuetemperatur i 1 time med forsigtig vipning.
4. Efter 1 time vaskes membranen med TBST 3x og udføre kemiluminiscens påvisning af proteiner med et HRP-substrat.
5. Efter påvisning af HA-mærket PRMTs inkuberes membranen med Ponseau-S-farveopløsning i 5 minutter ved stuetemperatur. Hurtigt vaske membran 3x med vand for at registrere de GST-mærkede substrater. Scanne billedet.

Representative Results

De evner HA-PRMT1 at methylere GST-G3BP1 blev bestemt ved en in vitro methylering analyse. HA-mærkede PRMT1 oprenset fra Beas2B cellelysater blev ansat i en methylering reaktion indeholdende GST-G3BP1 og 1 pCi S-adenosyl-L ^[methyl-3H] methionin, som methyldonor. PRMT1 effektivt kunne katalysere methylering af GST-G3BP1 (figur 1, øverste panel). Methylering reaktioner under anvendelse af pull-downs udføres på lysater af tom vektor transficerede Beas2B celler tjente som en negativ kontrol (figur 1, øverste panel, bane 1). Immunoblotting med anti-HA-antistoffer bekræftede ekspressionen af PRMT1 (figur 1, midterste panel). Ponseau-S-farvning blev anvendt til at vise ens belastning af GST-G3BP1 i begge reaktioner (figur 1, nedre panel).

1997 / 51997fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. PRMT1 methylerer G3BP1. PRMT1-medieret G3BP1 methylering blev vurderet ved anvendelse af en in vitro-methyleringsreaktion, som omfatter HA-mærket PRMT1 oprenset fra Beas2B cellelysater, GST-G3BP1 oprenset fra E. coli, og S-adenosyl-L ^[methyl-3H] methionin som et methyldonor. Overpanel repræsenterer fluorograph til G3BP1 methylering. Midterste panel repræsenterer immunblot bekræfter ekspression af HA-mærkede PRMT1. Og den nederste panel repræsenterer Ponseau-S farvede skamplet for fastsættelse lige belastning af underlaget (GST-G3BP1).

Discussion

Den heri beskrevne protokol anvendes rutinemæssigt til at fastslå status for methylering af de identificerede PRMT substrater. Denne robuste, og konsekvent analyse vil også give endegyldige bevis på specificitet PRMTs for deres substrater. De centrale komponenter til succes i denne analyse er: 1. Angivelse af PRMTs i pattedyrceller, 2. Aktivitet af oprensede PRMTs 3. Ekspression og oprensning af substrat, og 4. Komplet vestlige overførsel af proteinerne til nitrocellulosemembranen.

Rekombinante PRMTs udtrykt og oprenset fra bakterier kan også anvendes i in vitro-methylering reaktioner ^10,11,13. Men da hver PRMT kræver forskellig rensning strategier, opbevaringsbetingelser, og opbevaringstemperaturer, brug af rekombinante PRMTs in vitro methylering reaktioner kan ikke være ideel. Desuden rekombinante PRMTs er også kortvarig ^11. I betragtning af disse udfordringer, mener vi, at PURverifikationsprogrammet af PRMTs fra pattedyrceller er praktisk, og konsekvent at udføre in vitro methylering reaktioner. Hvis forbigående ekspression af PRMTs i pattedyrceller synes at være ubelejligt, alternativt kan man overveje at gøre stabile cellelinjer til PRMTs. Vigtigst ekspression af PRMTs i pattedyrceller er den eneste måde til at afgøre PRMT katalytiske aktiviteter i respons på stimuli fx vækstfaktorer, cytokiner etc.

Den største begrænsning for anvendelse af PRMTs oprenset fra mammale kilder er forurening med andre PRMTs under rensningsprocessen. Imidlertid kunne man bruge mutant konstruktioner af de PRMTs, der er blottet for methyl transferase aktiviteter som yderligere kontroller. Hvis PRMTs under undersøgelse kan danne homodimerer, kan mutante konstruktioner ikke være gode kontrol. Alternativt kan man overveje at bruge PRMTs oprenset fra celler forarmet af target PRMTs som negativ kontrol eller bruge rekombinantPRMTs fra bakterielle kilder. Den præsenterede protokol beskriver en enkel, praktisk og konsekvent analyse til at undersøge protein-arginin methylering. Den beskrevne metode er ikke kun vigtigt for identifikation og etableringen af ​​methyleringsstatus af nye PRMT substrater, men også for vores grundlæggende forståelse af den mekanisme af protein arginin methylering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific