タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

Summary

タンパク質アルギニンメチル化酵素、すなわちクラスによって触媒。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）は、タンパク質内のアルギニンのメチル基の酵素添加の過程である。 インビトロメチル化アッセイは、既知または新規のPRMT基質のメチル化状態を評価するための最も信頼できるツールである。

Abstract

タンパク質アルギニンメチル化は、核内で最も豊富な翻訳後修飾の一つである。タンパク質アルギニンメチル化は、識別および/または決定プロテオミクスのアプローチを介して、および/またはメチル-アルギニン特異的抗体を用いたイムノブロッティングすることができる。しかしながら、これらの技術は、時には誤解を招くことがあり、しばしば、偽陽性の結果を与えることができる。最も重要なことは、これらの技術は、PRMTの基質特異性を支持する直接的な証拠を提供することができない。 インビトロメチル化アッセイ、一方、敏感である有用な生化学的ア ​​ッセイであり、同定されたタンパク質が実際にPRMT基質である場合には一貫して明らかにした。典型的なインビトロメチル化アッセイは、精製され、アクティブPRMTs、精製された基板と、放射性同位体標識されたメチル供与体（S-アデノシル-L-[メチル- ³ H]メチオニン）が含まれています。ここでは、触媒的に活性なPRMT1、普遍的に発現PRMTファミリーメンバーを単離するためにステップバイステップのプロトコルを記述します。私に精製PRMT1のメチルトランスフェラーゼ活性は、後でS-アデノシル-L-メチル供与体としての[メチル- ³ H]メチオニンの存在下で、タンパク質1（G3BP1）に結合Rasは、GTPアーゼ活性化タンパク質、既知のPRMT基板上に試験した。このプロトコルは、新たな生理PRMT1基質のメチル化状態を確立するためだけでなく、タンパク質アルギニンメチル化の基本的なメカニズムを理解するためだけでなく、使用することができる。

Introduction

タンパク質のメチル化は、最初に1968年¹に記載された。それは、研究者は、この翻訳後修飾²の重要性を認めるようになったことを、1996年にPRMT1の最初のクローニングまでではなかった。興味深いことに、核抽出物のタンパク質中のアルギニン残基の約​​2％は、本変形例の存在量を示す^、3メチル化されている。アルギニンは、塩基性側鎖を有するアミノ酸を正に帯電している窒素/ sのアルギニンの側鎖中には、翻訳後にメチル基、アルギニンのメチル化^4-6として知られているプロセスの添加によって修飾することができる。アルギニンメチル化は、酵素、すなわちクラスによって触媒される。、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（PRMTs）。アルギニンはモノメチル化またはジメチル化し、後者は、工程^4-6を触媒PRMTsの種類に応じて、対称または非対称のいずれかであり得ることがことができます。

アルギニンを表示するタンパク質電子グリシンリッチモチーフはPRMT媒介触媒作用のための潜在的標的である。基質のPRMT媒介メチル化は、正常な細胞ホメオスタシス^7-9に重要である全てが、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-核酸相互作用、タンパク質機能、遺伝子発現、および/ ​​または細胞内シグナル伝達を調節することが示されている。タンパク質アルギニンメチル化の生物学的役割を理解するために、正確で効率的かつ再現可能なアッセイを同定PRMT基質のメチル化状態を確立するために必要とされる。

それらの基質のメチル化を触媒する精製PRMTsの能力を評価するインビトロメチル化アッセイでは 、アルギニンメチル化^10-12を研究するための広く受け入れられアッセイである。このアッセイの全体的な成功は、主に精製されたPRMTsの活性に依存している。 PRMTsを発現させ、細菌、または哺乳動物細胞^10,11から精製することができる。 dと、このインビトロメチル化アッセイ、プロトコルセクションでetailed、もともとチニと同僚¹⁰によって記載された方法に基づいている。このプロトコルでは、詳細には哺乳動物細胞におけるPRMT1の発現および精製に関与するステップを示す。タンパク質結合タンパク質1（G3BP1）、既知のPRMT基板^8を 、活性化はRas-GTPアーゼ上のメチル化を触媒する精製PRMT1の能力は、後述のようなS-アデノシル-L-[メチル- ³ H]メチオニンの存在下で評価した。メチル供与体。このアッセイを用いて、確実に、タンパク質アルギニンメチル化の研究における主要なステップであるメチ小説や既知の基質にPRMTsの能力を定義することができます。

Protocol

発現構築物の調製

1. プロトコルを開始する前に、N末端エピトープタグ（MycのまたはHA）、および細菌細胞から高レベルのタンパク質発現および精製のための基質インフレームグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）とを有する哺乳動物発現ベクターにクローンPRMTs標準的な分子生物学的技術を用いて、溶解物、。

PRMTs 2。精製

1. ヒト気管支上皮細胞（Beas2B）を維持するために、100mmの培養皿を使用してください。継代細胞3日ごとにし、それらがコンフルエンスまで成長させてください。
2. トランスフェクションの前日に、100mm培養皿中の10mlの培地中7.5×10 ⁵の細胞を播種する。スワールは細胞を均一に分散し、5％加湿CO ₂インキュベーター中、37℃でインキュベートする。
3. 翌日、培地を吸引除去し、血清および抗生物質を含まない培地の5ミリリットルを追加します。旋回やメディアを吸引除去する。このステップを繰り返し1最終的にはより多くの時間、および血清/抗生物質を含まない培地の5ミリリットルを追加し、トランスフェクションに進んでください。
4. 無菌1.5ミリリットルのプラスチック遠心管中の無血清培地を750μlにプラスミドDNA6μgの希釈する。
5. 別の1.5ミリリットルのプラスチック遠心管では、無血清培地750μlの中にトランスフェクション試薬30μlの希釈する。
6. 希釈したDNA（ステップ2.4​​）を含有するチューブに希釈したトランスフェクション試薬溶液（ステップ2.5）を転送します。数回ピペッティングにより穏やかに混合します。
7. 15分間室温でトランスフェクション混合物をインキュベートする。
8. 15分後、細胞の上に静かにトランスフェクション混合物をピペットで、スワールが均一に混合し、5％加湿CO ₂インキュベーター中、37℃でインキュベートする。
9. 3時間後、細胞からトランスフェクション混合物を含有する培地を吸引する。血清および抗生物質を補充した新鮮な細胞培養培地を加える。
10. 5％加湿CO ₂中、37℃でインキュベートする48時間インキュベーター。
11. 48時間後、溶解緩衝液1ml中に細胞を溶解し（1×リン酸緩衝生理食塩水、1％のNonidet P-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、および1μg/ mlのphenlymethylスルホニルフルオリド）。セルリフターのプラスチック遠心管に溶解物を収集し、氷上で30分間溶解物をインキュベートする。
12. 細胞破片からの溶解物をクリアするためにベンチトップ遠心機で10分間15,000×gで溶解物を遠心。 [*これは、高度にメチル化アッセイのための酵素の精製に進む前に、抗HA抗体を用いた溶解物のアリコートの免疫ブロッティングを経由して、HA-PRMT1の発現を確認することをお勧めします。]
13. PRMTsの精製のために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の抗HAアフィニティマトリックスの50:50懸濁液の30μlを用いた細胞溶解物3mgのインキュベートし、チューブローテーター中で4℃で一晩回転させる。
14. 翌日、収集するために2分間ベンチトップ遠心分離機で14000×gでチューブを回転ビーズ。上清を破棄し、2、14,000×gで遠心分離し、各洗浄で[、20mMトリス（pH8.0）に150mMのNaCl、5mMのEDTA及び1％トリトン-X-100]をビーズはRIPA 1mlのバッファーで3回洗浄分。 3回目の洗浄の後、メチル化緩衝液100μlで一回ビーズを洗浄緩衝液（50mM Tris pH8.5の、20のKCl、10mMのMgCl _2、1mMのβ-メルカプトエタノール、100mMのスクロース）。遠心分離後、上清を除去します。固定化PRMTsを含むビーズは、メチル化アッセイで使用される準備ができている。 [*これは非常にすぐにメチル化アッセイに固定化PRMTsを使用することを推奨します。]

基質の精製

1. GST-G3BP1の単一コロニーを接種し、100μg/ mlのアンピシリンを含むルリア - ベルターニ（LB）培地5mlにBL21を形質転換した。 250rpmで振盪しながら37℃で一晩培養を育てる。
2. 翌日、新鮮なLB培地と続き、50mlの一晩培養物を移す（これは、約2時間かかります）0.5〜0.7のOD ₆₀₀まで成長するinue。
3. OD _600が 0.5〜0.7に達したときに、1 mMの最終濃度になるようにイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）を添加し、250rpmで振盪しながら37℃でさらに4時間培養を続ける。
4. 10分間1500×gでの遠心分離によって細胞を採取し、-80℃でGST精製またはストアのペレットを処理する。
5. 再懸濁溶解緩衝液5ml（プロテアーゼ阻害剤、リゾチーム100μg/ mlの、及び0.1％のTriton-X-100と1×PBS）における細菌ペレットを、30分間、37℃でライセートをインキュベートする。この時、溶解物は、細菌ゲノムDNAのリリースに濁った、粘性が表示されます。
6. 超音波処理（30％の振幅に1秒の10パルスごと）によりゲノムDNAを剪断。
7. 10分間15000×gでの遠心分離によって溶解物をクリアし、15mlチューブに透明な上清を移す。上清をcentrifuを繰り返し明確ではない場合ゲーションプロセスをもう一度。
8. 一方、氷冷PBSで2回、GST-セファロースビーズを洗浄し、PBS中のGST-セファロースの50:50懸濁液を作製。クリア細菌細胞溶解液に、GST-セファロース懸濁液200μlを加え、1時間、4℃で回転させます。
9. 1時間後、ビーズを収集するために3分間500×gでチューブを遠心する。ビーズは氷冷PBSで3回洗浄する。
10. 最後の洗浄後、溶出緩衝液100μl（50mMトリスpH8.0で、150mMのNaCl、30mMのグルタチオン）中でビーズを再懸濁し、10分間4℃で回転させる。
11. 2分間15000×gでチューブを遠心し、別のプラスチック製遠心管に精製したタンパク質を含む上清を移す。精製タンパク質の濃度を推定するためにウシ血清アルブミン（BSA）の既知量と一緒に精製されたタンパク質を5μlにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析を行う。

4。メチル化アッセイ

注：放射性同位元素の仕事のために、放射性同位体で実験を行う上で機関のプロトコルに準拠して指定された別の領域に、次の手順を実行します。

1. 精製されたGST-基質および1×メチル化バッファー（50mMトリスpH8.5の、20のKCl、10mMのMgCl _2、1mMのβ-メルカプトエタノール、100mMのスクロース）、1μCiの含有するマスターミックス2μgの追加のS-アデノシルL-[メチル- ³ H]メチオニン、水、固定化PRMTs（ステップ2.13）に10μlの最終体積にし、1時間、30℃で反応をインキュベートする。
2. 1時間後、2×SDS試料緩衝液10μlを添加することにより反応を停止。 10分間95℃での試料の変性後、SDS-PAGEゲルでサンプルを分離する。
3. 以降、半乾燥電気泳動トランスファーを用いてニトロセルロース膜にSDSゲルから分離されたタンパク質を移す。
4. 転写後、を有する膜をカバーutofluor（オートラジオグラフィーイメージインテンシファイア）と、穏やかに室温で2時間揺らし。 2時間後、オートフルオーを捨てる、後で使用するために保持します。 [*放射性物質などのチューブにラベルを付ける]
5. 迅速空気は、ろ紙上の膜を乾燥ビニール袋に入れて密封し、-20℃でX線フィルムに膜を露出させる。十分な露光時間は5〜30日の間の範囲である。

PRMT発現と基質の等しい負荷の5。確認

1. 十分なエクスポージャーを達成した後、ブロッキングバッファーを含むプラスチック箱[トゥイーン20（TBST + 3％脱脂乳）をトリス緩衝生理食塩水]を、膜を転送し、穏やかに1時間揺らし。
2. 放射性廃棄物としてブロッキングバッファーを捨てます。 4℃で一晩TBST中：（1,000希釈1）抗HA抗体で膜をインキュベート 穏やかに揺らしながら°C、。
3. TBSTで3回で膜を洗浄し、HRP標識抗マウス二次抗体で膜をインキュベート穏やかに揺らしながら1時間室温でTBST中：（1 5000希釈）。
4. 1時間後、TBST 3倍の膜を洗浄し、HRP基質を有するタンパク質の化学発光検出を行う。
5. HAタグ付きPRMTsを検出した後、室温で5分間Ponseau-S染色液で膜をインキュベートする。すぐにGSTタグ基質を検出するために、水と、膜3回洗う。画像をスキャンします。

Representative Results

GST-G3BP1をメチル化するためにHA-PRMT1の能力は、インビトロメチル化アッセイによって決定した。 Beas2B細胞溶解物から精製されたHAタグ付きPRMT1をメチル供与体として、GST-G3BP1、および1 S-アデノシル-L-のμCiの[メチル- ³ H]メチオニンを含むメチル化反応で使用した。 PRMT1を効率的に、GST-G3BP1（ 図1、上のパネル）のメチル化を触媒することができます。空のベクターの溶解物に対して実施プルダウンを使用してメチル化反応は、Beas2B細胞は、陰性対照（ 図1、上パネル、レーン1）を務めトランスフェクトした。 PRMT1の発現は、抗HA抗体を用いて確認さイムノブロッティング（ 図1、中央のパネル）。 Ponseau-S染色は反応（ 図1、下のパネル）の両方におけるGST-G3BP1の等しい負荷を示すために使用された。

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図1 PRMT1のメチレートのG3BP1。PRMT1媒介G3BP1メチル化はE.から精製されたBeas2B細胞溶解物、GST-G3BP1から精製したHAタグ付きPRMT1を含むin vitroでのメチル化反応を用いて評価した。メチル供与体として大腸菌 、およびS-アデノシル-L-[メチル- ³ H]メチオニン、。上のパネルはG3BP1メチル化fluorographを表します。中央のパネルは、HA-タグ付きPRMT1の発現を確認したイムノブロットを表す。そして、下部パネルは、基板（GST-G3BP1）の等しい負荷を決定するためのPonseau-S染色ブロットを表す。

Discussion

本明細書に記載のプロトコルは、日常的に同定PRMT基質のメチル化状態を確立するために使用される。この強力、かつ一貫性のアッセイはまた、それらの基質のためのPRMTsの特異性に決定的な証拠を提供します。このアッセイの成功のための重要なコンポーネントは次のとおりです。哺乳動物細胞におけるPRMTsの1の発現、精製PRMTs 0002活性、基質の3発現および精製、ニトロセルロース膜へのタンパク質の4。完全な西部の転送。

組換えPRMTsを発現させ、細菌から精製はまた、 インビトロでのメチル化反応^10,11,13に用いることができる。各PRMTは、異なる精製戦略を、保存条件、及び保管温度を必要とするので、 インビトロでのメチル化反応における組換えPRMTsの使用は理想的ではないかもしれない。また、組換えPRMTsも短命¹¹です。これらの課題を考慮すると、私たちはそのPURを信じる哺乳動物細胞からPRMTsのification は、in vitroメチル化反応を行うことが便利で一貫している。哺乳動物細胞におけるPRMTsの一過性の発現が不便であることが表示された場合、あるいは、人はPRMTsための安定した細胞株をすることを検討することができます。最も重要なことは、哺乳動物細胞におけるPRMTsの発現は、例えば 、成長因子、サイトカインなどの刺激に応答してPRMT触媒活性を決定するために利用できる唯一の方法である

哺乳動物供給源から精製PRMTsを使用することの主な制限は、精製プロセス中に他のPRMTsによる汚染である。しかし、人は追加のコントロールとしてメチルトランスフェラーゼ活性を欠いているPRMTsの変異体構築を使用することができます。調査中のPRMTsはホモ二量体を形成することができるならば、突然変異体構築物は、優れたコントロールではないかもしれません。あるいは、ネガティブコントロールとしての目標PRMTsが枯渇細胞から精製PRMTsを使用することを検討または組換えを使用することができます細菌源からPRMTs。提示されたプロトコルは、タンパク質アルギニンメチル化をプローブするための、シンプルで便利で一貫性のあるアッセイを記載。記載された方法は、新規PRMT基質のメチル化状態の同定および確立のためだけでなく、タンパク質アルギニンメチル化のメカニズムの私達の基本的な理解のためだけではなく必須である。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine	Perkin Elmer
Ecoscint ultra	National Diagnostics	LS-270
Bottle top dispenser	National Diagnostics	LS-900
AutoFluor	National Diagnostics	LS-315
6 ml Scintillation Vials	National Diagnostics	SKU:SVC-06
GST-sepharose	GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced	Sigma	G4251
Lipofectamine	Invitrogen		Transfection reagent
Beas2B	ATCC
Optimem	Invitrogen
NP-40	US-Biologicals
SDS	Sigma
Sodium deoxycholate	Sigma
PMSF	Sigma
anti-HA affinity matrix	Roche
Tris	Sigma
Nacl	Sigma
Bio-rad gel doc	Bio Rad
anti-HA antibody	roche
Ponseau S	Fisher Scientific