Summary
Nous décrivons ici un protocole pour générer des cellules souches pluripotentes induites humaines du sang périphérique en utilisant une stratégie de reprogrammation de episome base et les inhibiteurs d'histone déacétylase.
Abstract
Ce manuscrit illustre un protocole pour créer efficacement des cellules gratuit intégration humains souches pluripotentes induites (CISP) du sang périphérique en utilisant des plasmides épisomiques et histone déacétylase (HDAC) inhibiteurs. Les avantages de cette approche sont les suivants: (1) l'utilisation d'une quantité minimale de sang périphérique en tant que matériau de source; (2) nonintegrating vecteurs de reprogrammation; (3) une méthode rentable pour générer des vecteurs iPSCs libres; (4) une seule transfection; et (5) l'utilisation de petites molécules pour faciliter la reprogrammation épigénétique. En bref, des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir d'échantillons de phlébotomie routine et ensuite mises en culture dans des facteurs de croissance définies pour obtenir une population de cellules progénitrices érythrocytaires hautement proliférative qui est remarquablement prêtent à une reprogrammation. Nonintegrating, plasmides épisomiques non transmissibles exprimant OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, et un court en épingle à cheveux (sh) ARN p53 sont introduced dans les érythroblastes dérivés via une seule nucléofection. La co-transfection d'un épisome qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) permet une identification facile des cellules transfectées. Un plasmide à réplication déficiente séparé d'Epstein-Barr exprimant l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) est également ajouté au mélange réactionnel pour une expression accrue de protéines de épisomiques. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées (les iMEFs) pour une reprogrammation continue. Dès que des colonies apparaissent comme iPSC à environ douze jours après nucléofection, les inhibiteurs de HDAC sont ajoutés au milieu pour faciliter le remodelage épigénétique. Nous avons trouvé que l'inclusion d'inhibiteurs HDAC augmente régulièrement la génération de colonies iPSC entièrement reprogrammé par 2 fois. Une fois colonies iPSC présentent typique cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) morphologie, ils sont délicatement transférés à Imef tissus enduits des plaques de culture individuels pour la croissance et l'expansion continue.
Introduction
iPSCs sont dérivées de tissus somatiques par l'expression ectopique d'un ensemble minimal de gènes de pluripotence. Cette technique a d'abord été démontré par transduction rétrovirale des fibroblastes humains avec OCT4, SOX2, KLF4, et cmyc, qui sont fortement exprimés dans l'état pluripotent 1. Ces exprimés de façon transitoire "facteurs de reprogrammation épigénétique" modifient le paysage et profil d'expression génique de la cellule cible analogue aux cellules souches embryonnaires humaines 2. Une fois créé, iPSCs peut potentiellement être différenciées en tout type de tissu pour complément d'enquête. Ainsi, ils sont prometteurs pour l'utilisation dans la médecine régénérative, la modélisation des maladies, et des applications de thérapie génique. Cependant, ce qui perturbe le génome des virus intégrant a le potentiel de modifier l'expression du gène endogène, influence le phénotype cellulaire, et en fin de compte de biaiser les résultats scientifiques. En outre, les intégrations virales aléatoires peuvent conduire à délétère e cellulaireffets, y compris la possibilité d'une transformation maligne 3 ou ré-expression des transgènes oncogènes 4. Futures applications cliniques, il faudra intégrer les non-génération iPSC.
Qu'épisomes, qui sont chromosomiques circulaire molécules d'ADN supplémentaires, offrent une stratégie visant à générer iPSCs rentables, sans intégration-5. La combinaison de vecteurs épisomiques indiqués dans le tableau 1 expriment la reprogrammation facteurs OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, et LIN28A. Le plasmide pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F contient également une p53 shRNA pour la suppression temporaire de TP53 à améliorer la reprogrammation cellulaire 6. Le déficient vecteur pCXWB-EBNA1 réplication favorise l'amplification des facteurs de reprogrammation et une efficacité accrue de reprogrammation en fournissant une augmentation transitoire de l'expression de EBNA1 7. Le plasmide pCXLE_EGFP peut être ajouté au mélange de nucléofection dans le but de determining l'efficacité de transfection ou pour des applications de tri des cellules. A l'exception du p-EBNA1 CXWB, des plasmides épisomiques utilisées dans ce protocole contiennent l'origine du virus d'Epstein-Barr de la réplication du virus et le gène EBNA1, qui médient la réplication et la partition de l'épisome au cours de la division de la cellule hôte 8. Les qu'épisomes sont spontanément perdu avec extensions successives iPSC 7. Sous-clonage et la caractérisation des CSPi avec épisomaux perte de vecteur, qui peut être déduit de la perte d'expression eGFP, peuvent conduire à l'intégration complètement iPSCs gratuits pour futures applications cliniques.
Inhérente au processus de génération iPSC est la suppression de gènes spécifiques de la lignée et la réactivation des gènes de pluripotence associée. Régulation de l'expression des gènes se produit à plusieurs niveaux dans le noyau, y compris les modifications de l'ADN et la chromatine pour permettre des facteurs de transcription, des éléments d'ADN régulatrices, et l'accès de l'ARN polymérase à ciblergènes. Rénovation du paysage épigénétique via des modifications globales de la chromatine est un élément clé de ré-expression du programme génétique de la pluripotence. Une modification de la chromatine spécifique qui est importante dans la régulation de l'expression génique est l'acétylation des histones particulier à des résidus lysine, permettant l'accès à cibler des gènes par le biais diminution de la tension de la bobine d'histone-ADN. Les inhibiteurs de HDAC sont de petites molécules qui ont été montré pour améliorer la reprogrammation de cellules iPSC et CSEh auto-renouvellement 9,10, probablement en raison de l'appui de l'état acétylé 11. Le protocole décrit ci-dessous, adapté d'une publication préalable en utilisant des lentivirus intégrant 12, fournit une méthode étape par étape pour la production de cellules iPSC optimisé de sang périphérique en utilisant qu'épisomes et les inhibiteurs d'HDAC. Les concentrations d'inhibiteur d'HDAC utilisés ici sont la moitié de ceux décrits par Ware, et al. 9, et ont systématiquement conduit à une augmentation de 2 fois dans les colonies iPSC entièrement reprogrammés plus de normeprotocoles de reprogrammation épisomaux sans inhibiteurs d'HDAC. Ce niveau de reprogrammation va de pair avec l'efficacité que nous observons avec les méthodes lentiviraux. En utilisant ce protocole, nous avons généré efficacement iPSC de personnes comme vieux de 87 ans.
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Protocol
Le consentement éclairé, tel qu'approuvé par les Institutional Review Board de la Cancer Research Center Fred Hutchinson et de l'hôpital de Philadelphie s enfants », a été obtenu à partir de patients avant de recueillir des échantillons de sang périphérique. Toutes les lignes directrices institutionnelles ont été observées. Toutes les expériences animales, y compris la génération MEF et formation de tératome ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et institutionnel.
1. Ficoll séparation des PBMC et Expansion des érythroblastes - Jour 0
- Diluer le sang périphérique de 1: 1 avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Dans un tuyau à fond rond en polystyrène de 15 ml, 7 ml soigneusement la couche de sang dilué sur 3 ml de la température ambiante de Ficoll-Hypaque.
- Centrifuger l'échantillon à 400 g pendant 30 min.
- Les PBMC aura réglé à l'interface entre le plasma et le Ficoll-Hypaque, vu comme une couche blanche trouble. L'utilisation d'un transfert pipette stérile, recueillir le PBMC dans un tube de 15 ml conique. Porter le volume à 10 ml à l'aide de DPBS.
- En utilisant un hématimètre, compter les PBMC.
- Pipette 2 × 10 6 PBMC dans un tube de 15 ml conique séparé et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Centrifuger les cellules restantes et le gel à une concentration de 2 x 10 6 CMSP / ml dans 90% de sérum bovin fœtal (FBS) / 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Préparer Expansion: milieu libre QBSF-60 sérum (abri de la lumière) + pénicilline / streptomycine (1%) + acide ascorbique (50 ng / ml) + facteur des cellules souches (SCF, 50 ng / ml) + interleukine 3 (IL 3, 10 ng / ml) + érythropoïétine (EPO, 2 U / ml) + insuline-like growth factor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexaméthasone (1 uM; abri de la lumière; dégeler une partie aliquote de chaque média changer).
- Remettre en suspension 2 × 10 6 PBMC dans 2 ml de fraîchement préparé milieu d'expansion et le placer dans un puits d'une plaque de culture de 12 tissu puits et incuber dans un incubateur humidifié à 37 ° avec une atmosphère de 5% O 2, 5% CO 2 et 90% N 2.
- Le jour 3 et le jour 6, remplacer médias.
- Recueillir les cellules et laver le puits avec 2 ml de QBSF-60 pour recueillir toutes les cellules restantes.
- Centrifuger la suspension de cellules à 300 xg pendant 5 min et le surnageant aspiré.
- Reprendre les cellules dans 2 ml de la nouvelle extension moyenne et les retourner à la même plaque 12 puits.
2. reprogrammation des cellules par nucléofection - Jour 9
- Pipeter les plasmides de reprogrammation dans un tube Eppendorf de 1,5 ml stérile (tableau 1).
- Mélanger la solution de nucléofection avec supplément (fourni par le fabricant) et la pipette dans un tube Eppendorf de 1,5 ml stérile.
- Introduire à la pipette 2 ml de moyen d'extension dans un puits d'une plaque 12 puits et la place dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) pour atteindre l'équilibre avant l'ajout de cellules.
- Recueillir leLavage des cellules cultivées et le puits avec 2 ml de QBSF-60 pour recueillir les cellules restantes.
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
- Laver les cellules par remise en suspension dans 5 ml de DPBS et centrifugation à 300 xg pendant 5 min.
- Aspirer le surnageant.
- Reprendre le culot cellulaire dans 100 pi de solution de nucléofection + Supplément, en prenant soin d'éviter les bulles de production.
- Introduire à la pipette la suspension cellulaire dans le tube contenant les plasmides de reprogrammation, pipette de haut en bas une fois, et la pipette l'échantillon dans le fond de la cuvette de nucléofection.
- Placez la cuvette dans la machine de nucléofection et exécuter le programme T-019.
- Transférer 100 ul de l'expansion préchauffé moyen (à partir de la plaque d'équilibrage à l'étape 2.3) dans la cuvette de nucléofection.
- Recueillir immédiatement l'ensemble de l'échantillon et le dépôt dans le puits de préchauffé Moyen Foisonnement. Éviter de recueillir le, des débris flottants de cellules mortes blanc. Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) pour la croissance.
3. Placage Feeder cellules - Jour 10 ou 11
- Au jour 10, les cellules plaque d'alimentation.
- Revêtez un 6 et plaque de culture de tissu avec de la gélatine.
- Introduire à la pipette 1 m de gélatine à 0,1% en solution saline tamponnée de Hank (HBSS) dans chaque puits de la plaque.
- Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur pendant au moins 5 min.
- Immédiatement avant utilisation, aspirer la solution de gélatine à partir de la plaque.
- Décongeler une fiole de 2 x 10 6 fibroblastes embryonnaires de souris irradiées à 3000 cGy dans 10 ml d'préchauffé MEF Media (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + pénicilline / streptomycine (1%)).
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Reprendre les cellules dans 12 ml de MEF médias et pipette 2 ml inPour chaque puits de la plaque 6 puits revêtu de gélatine. Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) jusqu'au jour 12.
- Revêtez un 6 et plaque de culture de tissu avec de la gélatine.
4. étalement des cellules sur des cellules nourricières et changement de support - Jour 12
- Recueillir les cellules dans une nucleofected 15 ml tube conique et collecter toutes les cellules restantes par un lavage des puits avec 2 ml de QBSF-60. Centrifuger l'échantillon à 300 g pendant 5 min.
- Préparer reprogrammation moyenne: Iscove modification de Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + non animale L-glutamine (1 mM) + non-acides aminés essentiels (NEAA, 1%) + pénicilline / streptomycine (1%) + β mercaptoéthanol (0,1 mM) + le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF, ajoutées à l'alimentation fraîche, 10 ng / ml) + acide ascorbique (frais ajoutés à l'alimentation, 50 pg / ml).
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 12 ml de reprogrammation moyenne. Introduire à la pipette 2 ml par puits de la suspension de cellules dansla plaque à 6 puits de cellules nourricières (tel que préparé dans la section 3). Centrifuger la plaque à 50 xg pendant 30 min à température ambiante.
- Placer la plaque dans une humidifié à 37 ° C incubateur (5% de O 2, 5% CO 2 et 90% N 2) pour la croissance. Changer la reprogrammation moyenne tous les deux jours jusqu'à ce que les colonies iPSC commencent à apparaître (1-2 semaines).
- Préparer hESC moyenne: DMEM / F12 1: 1 + Knockout sérum de remplacement (20%) + pénicilline / streptomycine (1%) + NEAA (1%) + non animale L-glutamine (1 mM) + pyruvate de sodium (1%) + bicarbonate de sodium (0,12%) + β-mercaptoéthanol (0,1 mM) + bFGF (ajoutés à l'alimentation fraîche, 10 ng / ml)
- Préparer les inhibiteurs de HDAC: butyrate de sodium (ajouté à l'alimentation fraîche, 100 M), de l'acide suberanilohydroxamic (SAHA, a ajouté à l'alimentation fraîche, 200 nM). Une fois colonies iPSC apparaissent, commencent à se nourrir les cellules avec des inhibiteurs de CSEh moyen + HDAC, le changement moyen chaque jour.
REMARQUE: le butyrate de sodium est une petite molécule qui est adsorbé sur des tubes en plastique, therefore stocker dans un tube en verre de borosilicate à 4 ° C.
5. Les clones isolation iPSC
- Une fois colonies iPSC sont assez grands pour être isolé (20-25 cellules), les prendre avec une pipette P20.
- Préparer les inhibiteurs de HDAC: butyrate de sodium (ajouté à l'alimentation fraîche, 100 M), SAHA (ajoutée à l'alimentation fraîche, 200 nM)
- Placez les colonies isolées sur iMEFs dans les différents boîtes de 35 mm contenant des inhibiteurs d'HDAC CSEh moyen + + Supplément Clonage & Recovery.
- Le jour après la cueillette des colonies, changer de support de CSEh inhibiteurs HDAC moyen +.
- Changer le support tous les jours jusqu'à ce que les colonies iPSC sont prêts pour des passages.
- Retirer les inhibiteurs d'HDAC dans le milieu une fois colonies se stabilisent à passage 2-3.
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Representative Results
Trois jours après nucléofection et avant l'étalement des cellules sur nucleofected iMEFs, l'efficacité de nucléofection réussi doit être estimée par microscopie à fluorescence pour eGFP. La figure 1 représente une expérience typique de nucléofection à environ 5-10% de la population totale des cellules exprimant eGFP.
Colonies reprogrammées iPSC vont commencer à apparaître environ deux semaines après nucléofection. Les colonies sont généralement circulaire avec des frontières bien définies et peuvent être identifiés par la morphologie de CSEh caractéristique y compris (1) petites cellules serrées avec un rapport nucléo-haut et (2) nucléoles visibles (figure 2, le champ lumineux). Cellules incomplètement reprogrammés soit détériorer ou former des masses de cellules hétérogènes qui se distinguent facilement de véritables colonies iPSC.
Sur les lignes représentatives que nous avons choisi de caractériser complètement, expriment tous les smarqueurs de pluripotence ORME (figure 2), réactiver les gènes de pluripotence endogènes (figure 2), et forment des tératomes lorsqu'elles sont injectées dans des souris NOD-SCID.
Figure 1: Nucleofected cellules stimulées PBMC trois jours après nucléofection avec des plasmides contenant OCT4, de SOX2, KLF4, MYCL, EBNA1, p53 shRNA et eGFP (barre d'échelle est de 100 um)..
Figure 2:. IPSC Caractérisation IPSC généré en utilisant cette méthode exposition CSEh comme morphologie lorsqu'elles sont cultivées sur Imef (champ clair), le test est positif pour l'activité de la phosphatase alcaline (AP), et sont positifspar immunohistochimie des marqueurs de pluripotence TRA-1-60, TRA-1-81, et SSEA4. En outre, l'expression endogène des gènes de pluripotence Oct4 (O), Sox2 (S), Klf4 (K), et cMyc (M) est détectable par RT-PCR. (Tous les barres d'échelle sont 100 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Épisome | Masse par réaction (ng) |
| pCXLE-hOct3 / 4-shp53-F | 830 |
| pCXLE-hSK | 830 |
| 830 | |
| pCXLE-EGFP | 500 |
| pCXWB-EBNA1 | 500 |
Tableau 1:. Ratio optimal de reprogrammation plasmides 6 Ces plasmides sont disponibles sur commande par Addgene.
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Discussion
Pour la réussite génération iPSC lors de l'utilisation de ce protocole, il ya plusieurs mises en garde importantes qui devraient être considérés. Au cours de la phase d'expansion des érythroblastes, le calendrier de changement de support doit être strictement suivie, que les écarts peuvent conduire à la stimulation inefficace de la population de cellules progénitrices cible et un rendement plus faible de génération iPSC. Il est important de faire de nouveaux milieu d'expansion avec la dexaméthasone frais à chaque changement de médias; et le milieu et la dexaméthasone QBSF-60 de base doivent être protégés de la lumière pendant le stockage. Pendant nucléofection, le lavage de DPBS est essentiel pour éliminer les solutés en excès à partir de la suspension de cellules qui peuvent causer le courant électrique à partir de la Nucleofector à l'arc, ce qui entraîne la mort cellulaire à grande échelle. Environ 10 jours après nucléofection, la plaque doit être examiné quotidiennement pour iPSC apparition de la colonie. Une fois que plusieurs petites colonies sont présentes, la reprogrammation moyen doit être modifié pour CSEh moyenne (avec des inhibiteurs de HDAC) comme prolongéesexposition d sérum peut induire la différenciation spontanée.
Selon laboratoire set-up et des ressources disponibles, des modifications au protocole peuvent être envisagées. Nous préférons une faible O 2 incubateur car il a été démontré conditions hypoxiques à accroître l'efficacité de la production iPSC 13; Cependant, nous avons eu du succès générer iPSCs du sang périphérique en utilisant des conditions de normoxie avec 5% de CO 2. Par conséquent, une norme incubateur à CO2 humidifié peut également être utilisé. Les MEF utilisés dans ce protocole peuvent être achetés auprès d'un fournisseur de sciences de la vie. Toutefois, en raison de la variabilité du lot commercial, nous préférons générer iMEFs de souris CF-1 suivant un protocole publié pour l'isolement MEF, la culture et l'irradiation 14. L'inclusion d'inhibiteurs HDAC est un aspect favorable de ce protocole comme le remodelage épigénétique est un aspect crucial de la reprogrammation cellulaire 9,15. inhibiteurs d'HDAC peuvent être omis, mais le nombre de fully reprogrammé colonies iPSC seront réduits. Enfin, nous avons généré iPSCs utilisant cette méthode avec un échantillon de moelle osseuse sans modifications supplémentaires nécessaires.
En résumé, ce protocole utilise un système de reprogrammation de plasmide à base qui évite certains des inconvénients de génération iPSC avec des vecteurs d'intégration, y compris les insertions aléatoires dans le génome de l'hôte et les préoccupations de sécurité concernant la manipulation du virus recombinant. En outre, la production à petite échelle de virus et la caractérisation est relativement main-d'œuvre par rapport à la génération de plasmide. l'efficacité de reprogrammation peut aussi varier considérablement en raison de la variabilité du lot inhérent à la production de virus, tandis que l'un production à grande échelle de plasmides de qualité peut conduire à la génération iPSC constante dans le temps. Combiné avec les inhibiteurs de HDAC, ce protocole offre une méthode efficace pour générer l'intégration libre et l'empreinte iPSCs gratuits pour la recherche sur les cellules souches.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les subventions suivantes du NIH pour soutenir cette recherche: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), et K12HL0806406 (SKS); et la Fondation McCarthy JP (AR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4 °C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4 °C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4 °C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4 °C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4 °C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4 °C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4 °C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4 °C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4 °C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4 °C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20 °C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000x stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μl pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
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