Episomes और HDAC inhibitors का उपयोग रक्त से कुशल आईपीएस सेल पीढ़ी
Summary
यहाँ हम एक episome आधारित reprogramming रणनीति और हिस्टोन deacetylase अवरोधकों का उपयोग परिधीय रक्त से मानव प्रेरित स्टेम सेल पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
इस पांडुलिपि कुशलतापूर्वक episomal प्लास्मिड और हिस्टोन deacetylase (HDAC) अवरोधकों का उपयोग परिधीय रक्त से एकीकरण मुक्त मानव प्रेरित स्टेम सेल (IPSCs) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल को दिखाता है. इस दृष्टिकोण के लाभ में शामिल हैं: (1) एक स्रोत सामग्री के रूप में परिधीय रक्त की एक न्यूनतम राशि का उपयोग; (2) reprogramming वैक्टर nonintegrating; (3) वेक्टर मुक्त IPSCs पैदा करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका; (4) एक एकल अभिकर्मक; और (5) छोटे अणुओं का उपयोग epigenetic reprogramming की सुविधा के लिए. Reprogramming उल्लेखनीय उत्तरदायी है कि एक अत्यधिक proliferative एरिथ्रोसाइट पूर्वज सेल आबादी उपज संक्षेप में, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) दिनचर्या फ़स्त खोलना नमूने से अलग कर रहे हैं और परिभाषित वृद्धि कारकों में तो सुसंस्कृत. Nonintegrating, OCT4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, और एक p53 कम बाल के लिये कांटा (एसएच) आरएनए व्यक्त nontransmissible episomal प्लास्मिड introdu हैंएक भी nucleofection के माध्यम से ली गई erythroblasts में ced. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन बढ़ाया व्यक्त करता है कि एक episome (EGFP) के Cotransfection ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है. एपस्टीन बर्र परमाणु प्रतिजन 1 (EBNA1) व्यक्त एक अलग प्रतिकृति की कमी प्लाज्मिड भी episomal प्रोटीन की वृद्धि की अभिव्यक्ति के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं तो जारी रखा reprogramming के लिए विकिरणित माउस भ्रूण fibroblasts (iMEFs) की एक परत पर चढ़ाया जाता है. जैसे ही IPSC तरह कालोनियों nucleofection के बाद के बारे में बारह दिनों में दिखाई देते हैं, HDAC अवरोधकों epigenetic remodeling की सुविधा के लिए मध्यम करने के लिए जोड़ रहे हैं. हम HDAC inhibitors का समावेश नियमित 2 गुना से पूरी तरह reprogrammed IPSC कालोनियों की पीढ़ी बढ़ जाती है कि मिल गया है. IPSC कालोनियों ठेठ मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) आकृति विज्ञान का प्रदर्शन एक बार, वे धीरे निरंतर विकास और विस्तार के लिए व्यक्तिगत iMEF लेपित टिशू कल्चर प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
Introduction
IPSCs pluripotency जीन की एक न्यूनतम सेट की अस्थानिक अभिव्यक्ति के माध्यम से दैहिक ऊतकों से निकाली गई है. इस तकनीक को शुरू में अत्यधिक pluripotent राज्य 1 में व्यक्त कर रहे हैं जो OCT4, Sox2, KLF4, और cMYC साथ मानव fibroblasts की रेट्रोवायरल पारगमन द्वारा प्रदर्शन किया गया. ये क्षणिक व्यक्त "reprogramming के कारकों" मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से 2 लक्ष्य सेल के epigenetic परिदृश्य और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अनुरूप बदल. बनाया एक बार, IPSCs संभवतः आगे की जांच के लिए किसी भी ऊतक प्रकार में भेदभाव किया जा सकता. इस प्रकार, वे पुनर्योजी चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, और जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए वादा पकड़. हालांकि, को एकीकृत वायरस के साथ जीनोम में खलल न डालें अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति, प्रभाव सेलुलर फेनोटाइप को बदलने की क्षमता है, और अंत में वैज्ञानिक परिणाम पूर्वाग्रह. इसके अलावा, यादृच्छिक वायरल एकीकरण हानिकारक सेलुलर ई करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंघातक परिवर्तन 3 या oncogenic ट्रांसजीन 4 की फिर से अभिव्यक्ति की संभावना सहित ffects,. भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों गैर समेकित करने IPSC पीढ़ी की आवश्यकता होगी.
अतिरिक्त गुणसूत्र परिपत्र डीएनए अणु होते हैं जो Episomes, लागत प्रभावी, एकीकरण से मुक्त IPSCs 5 उत्पन्न करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं. तालिका 1 में दिखाया गया episomal वैक्टर के संयोजन reprogramming OCT4, Sox2, KLF4, MYCL, और LIN28A कारकों व्यक्त करते हैं. pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-एफ प्लाज्मिड भी सेलुलर reprogramming 6 बढ़ाने के लिए TP53 के अस्थायी दमन के लिए एक p53 shRNA गये हैं. प्रतिकृति की कमी pCXWB-EBNA1 वेक्टर EBNA1 अभिव्यक्ति 7 में एक क्षणिक वृद्धि प्रदान करके reprogramming के कारकों के प्रवर्धन और बढ़ reprogramming दक्षता को बढ़ावा देता है. pCXLE_EGFP प्लाज्मिड देते के प्रयोजन के लिए nucleofection मिश्रण करने के लिए जोड़ा जा सकता हैसेल छँटाई अनुप्रयोगों के लिए अभिकर्मक दक्षता या rmining. पी CXWB-EBNA1 के अपवाद के साथ, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया episomal प्लास्मिड मेजबान सेल 8 के विभाजन के दौरान नकल और episome का विभाजन मध्यस्थता जो वायरल प्रतिकृति और EBNA1 जीन, के एपस्टीन-बर्र वायरस मूल होते हैं. episomes अनायास लगातार IPSC विस्तार 7 के साथ खो रहे हैं. Subcloning और EGFP अभिव्यक्ति की हानि से अनुमान लगाया जा सकता है जो episomal वेक्टर नुकसान, साथ IPSCs के लक्षण, भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए पूरी तरह से एकीकरण मुक्त IPSCs बढ़ सकता है.
IPSC पीढ़ी की प्रक्रिया के लिए निहित वंश विशिष्ट जीन का दमन और pluripotency जुड़े जीन की पुनर्सक्रियन है. जीन अभिव्यक्ति के नियमन को लक्षित करने के प्रतिलेखन कारक अनुमति देने के लिए डीएनए और chromatin के लिए संशोधन, विनियामक डीएनए तत्वों, और शाही सेना पोलीमरेज़ उपयोग सहित, नाभिक के भीतर कई स्तरों पर होता हैजीन. वैश्विक क्रोमेटिन संशोधनों के माध्यम से epigenetic परिदृश्य के पुनर्गठन फिर से अभिव्यक्ति के लिए एक प्रमुख घटक pluripotency आनुवंशिक प्रोग्राम की है. जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण है कि एक विशिष्ट क्रोमेटिन संशोधन हिस्टोन-डीएनए का तार की कमी हुई तनाव के माध्यम से जीन को लक्षित करने के लिए उपयोग की अनुमति देता है जो विशेष लाइसिन अवशेषों पर हिस्टोन के एसिटिलीकरण, है. HDAC अवरोधकों के कारण acetylated राज्य में 11 का समर्थन करने की संभावना है, IPSC reprogramming और hESC आत्म नवीकरण 9,10 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है कि छोटे अणु होते हैं. एकीकृत करने lentiviruses 12 का उपयोग करते हुए एक पूर्व प्रकाशन से अनुकूलित नीचे वर्णित प्रोटोकॉल, परिधीय रक्त का उपयोग episomes और HDAC अवरोधकों से अनुकूलित IPSC पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम विधि प्रदान करता है. यहां इस्तेमाल HDAC अवरोध करनेवाला सांद्रता वेयर द्वारा वर्णित उन में से आधे हैं, एट अल. 9, और नियमित रूप से मानक से अधिक पूरी तरह से reprogrammed IPSC कालोनियों में एक 2 गुना वृद्धि हुई हैHDAC inhibitors के बिना episomal reprogramming प्रोटोकॉल. Reprogramming की इस स्तर हम lentiviral तरीकों के साथ निरीक्षण दक्षता के साथ बराबर है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम कुशलतापूर्वक उम्र के 87 वर्ष के रूप में के रूप में पुराने व्यक्तियों से IPSC उत्पन्न किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय सफल IPSC पीढ़ी के लिए, पर विचार किया जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण निरंतर कर रहे हैं. विचलन लक्ष्य पूर्वज सेल की आबादी का अकुशल उत्तेजना और IPSC पीढ़ी के एक कम क्षमता को जन्म दे सक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों इस शोध के समर्थन के लिए एनआईएच से निम्नलिखित अनुदान स्वीकार करने की इच्छा: K08DK082783 (एआर), P30DK56465 (बीटीएस), U01HL099993 (बीटीएस), T32HL00715036 (एसकेएस), और K12HL0806406 (एसकेएस); और जेपी मैकार्थी फाउंडेशन (एआर).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4°C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4°C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4°C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4°C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4°C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4°C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4°C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4°C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4°C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4°C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4°C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000X stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 mL conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μL pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
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