Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Abstract

Dit handschrift illustreert een protocol voor het efficiënt maken van-integratie vrij humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit perifeer bloed met behulp van episomale plasmiden en histondeacetylase (HDAC) -remmers. De voordelen van deze benadering zijn: (1) het gebruik van een minimale hoeveelheid perifeer bloed als grondstof; (2) nonintegrating herprogrammering vectoren; (3) een kosteneffectieve werkwijze voor het genereren vector gratis iPSCs; (4) een enkele transfectie; en (5) het gebruik van kleine moleculen epigenetische herprogrammering vergemakkelijken. Kort, perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) geïsoleerd uit routine flebotomie monsters en vervolgens gekweekt in gedefinieerde groeifactoren een zeer proliferatieve erythrocyten progenitor celpopulatie die opmerkelijk vatbaar herprogrammering leveren. Nonintegrating, nontransmissible episomale plasmiden die OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, en een p53 short hairpin (sh) RNA zijn Inleidiced in de afgeleide erytroblasten via één nucleofection. Cotransfectie van een episoom dat tot expressie versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) zorgt voor gemakkelijke identificatie van getransfecteerde cellen. Een aparte replicatie-deficiënte plasmide dat Epstein-Barr nucleair antigeen 1 (EBNA1) wordt ook toegevoegd aan het reactiemengsel verhoogde expressie van episomale eiwitten. Getransfecteerde cellen worden daarna uitgeplaat op een laag van bestraalde muis embryonale fibroblasten (iMEFs) voor verdere herprogrammering. Zodra iPSC-achtige kolonies verschijnen ongeveer twaalf dagen na nucleofection zijn HDAC inhibitoren toegevoegd aan het medium epigenetische remodeling vergemakkelijken. We hebben gevonden dat de opname van HDAC inhibitoren routinematig verhoogt de productie van volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies van 2 maal. Zodra iPSC kolonies vertonen typisch menselijke embryonale stamcellen (hESC) morfologie, worden ze voorzichtig overgebracht naar individuele Imef-gecoate weefselkweek platen voor verdere groei en expansie.

Introduction

iPSCs zijn afgeleid van somatische weefsels via ectopische expressie van een minimale set van pluripotency genen. Deze techniek werd aanvankelijk aangetoond door retrovirale transductie van humane fibroblasten met OCT4, SOX2, KLF4 en cMYC die hoog tot expressie in de pluripotente toestand ^1. Deze tijdelijk tot expressie "herprogrammering factoren" veranderen de doel cel epigenetische landschap en genexpressie profiel analoog aan menselijke embryonale stamcellen ^2. Eens gemaakt, kan iPSCs potentieel worden onderscheiden in elk type weefsel voor verder onderzoek. Zo is zij in het bezit belofte voor gebruik in regeneratieve geneeskunde, ziekte modelleren, en gentherapie toepassingen. Echter, verstoren het genoom met integrerende virussen heeft de potentie om endogene genexpressie beïnvloeden cellulaire fenotype te veranderen, en uiteindelijk vertekenen wetenschappelijke resultaten. Bovendien kunnen willekeurige virale integraties leiden tot schadelijke cellulaire effects, met inbegrip van de mogelijkheid van een maligne transformatie ³ of re-expressie van de oncogene transgenen ^4. Toekomstige klinische toepassingen zullen niet-integrerende iPSC generatie vereisen.

Episomen, die extra chromosomaal circulaire DNA moleculen zijn, bieden een strategie om kosteneffectieve, integratie gratis iPSCs ⁵ genereren. De combinatie van episomale vectoren in tabel 1 geven de herprogrammering factoren OCT4, SOX2, KLF4, MYCL en LIN28A. De pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F plasmide bevat ook een p53 shRNA tijdelijke onderdrukking van TP53 cellulaire herprogrammering ⁶ verbeteren. De replicatie deficiënte pCXWB-EBNA1 vector bevordert amplificatie van herprogrammering factoren en verhoogde efficiëntie herprogrammering door een tijdelijke toename EBNA1 expressie ^7. De pCXLE_EGFP plasmide kan de nucleofectie mengsel worden toegevoegd met het doel van determining de transfectie-efficiëntie of voor celsortering toepassingen. Met uitzondering van p-CXWB EBNA1, het episomale plasmiden die in dit protocol bevat het Epstein-Barr virus oorsprong van virale replicatie en EBNA1 gen dat replicatie en verdeling van de episoom bemiddelen bij deling van de gastheercel ^8. De episomen spontaan verloren opeenvolgende iPSC expansie ^7. Subklonering en karakterisatie van iPSCs met episomale vector verlies, dat kan worden afgeleid uit het verlies van eGFP expressie kan leiden tot integratie volledig vrij iPSCs voor toekomstige klinische toepassingen.

Inherent aan het proces van iPSC generatie onderdrukking van lijnspecifieke genen en reactivering van pluripotentie-geassocieerde genen. Regulatie van genexpressie plaatsvindt op verschillende niveaus binnen de kern, waaronder wijzigingen van DNA en chromatine transcriptiefactoren mogelijk, regulerende DNA-elementen, en RNA polymerase toegang targetengenen. Herinrichting van de epigenetische landschap via wereldwijde chromatine modificaties is een belangrijk onderdeel om opnieuw uitdrukking van de pluripotency genetisch programma. Een specifieke chromatine modificatie dat belangrijk is bij de regulatie van genexpressie acetylering van histonen op bepaalde lysineresten, dat toegang tot genen richten door verminderde spanning van de histon-DNA coil. HDAC remmers zijn kleine moleculen die zijn aangetoond iPSC herprogrammering en hESC zelfvernieuwing ^9,10 verbeteren, waarschijnlijk door het ondersteunen van de geacetyleerde toestand ^11. De hieronder beschreven protocol, aangepast van een voorafgaande publicatie met integratie lentivirussen ^12, wordt stap voor stap methode voor optimale iPSC generatie uit perifeer volbloed met behulp episomen en HDAC inhibitoren. De HDAC inhibitor concentraties die hier gebruikt zijn de helft van die beschreven door Ware et al. ⁹ en routinematig tot een 2-voudige toename in volledig geherprogrammeerd iPSC kolonies op standaardepisomale herprogrammering protocollen zonder HDAC inhibitoren. Dit niveau van herprogrammering is op gelijke voet met de efficiëntie die we waarnemen met lentivirale methoden. Met dit protocol, hebben we snel gemaakt iPSC van individuen zo oud als 87 jaar.

Protocol

Informed consent, zoals goedgekeurd door de Institutional Review Boards van het Fred Hutchinson Cancer Research Center en het Children "s Hospital van Philadelphia, werd verkregen van patiënten voor het verzamelen van perifere bloedmonsters. Alle institutionele richtlijnen werden waargenomen. Alle dierlijke experimenten, inclusief MEF generatie en teratoma vorming werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Ficoll Scheiding van PBMC's en uitbreiding van…

Representative Results

Drie dagen na nucleofection en voor electroplating de nucleofected cellen op iMEFs, de efficiency van de succesvolle nucleofection worden geschat door fluorescentie microscopie eGFP. Figuur 1 toont een typische nucleofection experiment met ongeveer 5-10% van de totale celpopulatie EGFP. Geherprogrammeerd iPSC kolonies zal beginnen om ongeveer twee weken verschijnen nadat nucleofectie. De kolonies zijn meestal rond met goed gedefinieerde grenzen en kunnen worden geïdentifice…

Discussion

Voor succesvolle iPSC genereren bij gebruik van dit protocol, zijn er verschillende belangrijke uitgangspunten dat moet worden overwogen. Tijdens de erythroblast uitbreidingsfase, moeten de media verandering schema strikt worden gevolgd, als afwijkingen kunnen leiden tot inefficiënte stimulatie van de doelgroep voorlopercellen cel populatie en een lagere efficiëntie van iPSC generatie. Het is belangrijk om nieuwe uitbreiding medium met verse dexamethason met elke media verandering te maken; en de QBSF-60 base medium e…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4°C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4°C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4°C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4°C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4°C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4°C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4°C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4°C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20°C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4°C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20°C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4°C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4°C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20°C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000X stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 mL conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μL pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624