Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.
Diese Handschrift zeigt ein Protokoll für die effiziente Erstellung Integration freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus dem peripheren Blut mit episomalen Plasmiden und Histon-Deacetylase (HDAC) Inhibitoren. Die Vorteile dieses Ansatzes sind: (1) die Verwendung einer minimalen Menge von peripherem Blut als Ausgangsmaterial; (2) nonintegrating Umprogrammierung Vektoren; (3) eine kostengünstige Methode zur Erzeugung von Vektor freien iPSCs; (4) einen einzigen Transfektion; und (5) die Verwendung von kleinen Molekülen an epigenetische Neuprogrammierung zu erleichtern. Kurz gesagt, werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von Routine Phlebotomie Proben isoliert und dann in einem definierten Wachstumsfaktoren kultiviert, um eine hoch proliferativen Erythrozytenvorläuferzellpopulation, die bemerkenswert zugänglich Umprogrammierung ergeben. Nonintegrating, nontransmissible episomalen Plasmiden OCT4, SOX2, KLF4, MycL, LIN28A und eine p53 short hairpin (sh) RNA sind Einfühüber eine einzige Nukleofektion in den abgeleiteten Erythroblasten ced. Kotransfektion Episom das Enhanced Green Fluorescent Protein exprimiert (eGFP) ermöglicht die einfache Identifizierung von transfizierten Zellen. Eine separate replikationsdefizienten Plasmid, Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) ebenfalls zu dem Reaktionsgemisch für eine erhöhte Expression von Proteinen episomal zugegeben. Die transfizierten Zellen werden dann auf eine Schicht aus bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten (iMEFs) zum fort Umprogrammierung plattiert. Sobald iPSC artige Kolonien erscheinen etwa zwölf Tage nach Nukleofektion, sind HDAC-Inhibitoren zu dem Medium gegeben, um epigenetische Umbau erleichtert. Wir haben gefunden, dass der Einschluss von HDAC-Inhibitoren routine erhöht die Entwicklung vollständig reprogrammiert iPSC Kolonien das 2-fache. Sobald iPSC Kolonien zeigen typischen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Morphologie, sie sanft zu einzelnen IMEF beschichteten Gewebekulturplatten für das weitere Wachstum und die Expansion übertragen werden.
iPS-Zellen werden aus somatischen Geweben über ektopische Expression von einem minimalen Satz von Pluripotenz-Gene abgeleitet. Diese Technik wurde ursprünglich von retroviralen Transduktion von humanen Fibroblasten mit OCT4, SOX2, KLF4 und cMYC, die besonders in den pluripotenten Zustand 1 ausgedrückt werden demonstriert. Diese transient exprimiert "Reprogrammierungsfaktoren" alter epigenetische Landschaft und Genexpressionsprofil der Zielzelle analog zu menschlichen embryonalen Stammzellen 2. Einmal erstellt, können iPS-Zellen potenziell in jede Gewebeart zur weiteren Untersuchung differenziert werden. So halten sie versprechen für den Einsatz in der regenerativen Medizin, Krankheitsmodelle und Gentherapieanwendungen. , Stören das Genom mit der Integration von Viren hat jedoch das Potenzial, um die endogene Genexpression beeinflussen zelluläre Phänotyp zu ändern und letztendlich vorspannen wissenschaftlichen Ergebnissen. Darüber hinaus können Zufalls virale Integrationen zu schädlichen Zell e führenUSWIRKUNGEN, einschließlich der Möglichkeit der malignen Transformation 3 oder Wieder Expression der Transgene onkogenen 4. Zukünftige klinische Anwendungen benötigen nicht-integrierenden iPSC Generation.
Episomen, die zusätzliche chromosomale zirkuläre DNA-Moleküle sind, bieten eine Strategie, um kostengünstige, Integration freien IPSCs 5 zu erzeugen. Die Kombination von in Tabelle 1 gezeigt episomalen Vektoren auszudrücken das Reprogrammierungsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4, MycL und LIN28A. Die pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-Plasmid enthält auch eine p53 shRNA für temporäre Unterdrückung der TP53 an zelluläre Reprogrammierung 6 verbessern. Die replikationsdefizienten pCXWB-EBNA1-Vektor fördert Amplifikation Reprogrammierungsfaktoren und erhöhte Effizienz Neuprogrammierung durch eine vorübergehende Erhöhung der Expression EBNA1 7. Die pCXLE_EGFP Plasmid kann zum Nukleofektion Gemisch zum Zwecke der dete hinzugefügt werdenrmining die Transfektionseffizienz oder zur Zellsortierung. Mit Ausnahme von p-CXWB EBNA1, die episomalen Plasmiden in diesem Protokoll verwendet werden, enthalten den Epstein-Barr-Virus Ursprung der viralen Replikation und EBNA1-Gen, das die Replikation und Teilung des Episom während der Teilung der Wirtszelle 8 zu vermitteln. Die Episomen spontan verlor aufeinander iPSC Expansion 7. Subklonierung und Charakterisierung von iPS-Zellen mit episomalen Vektor Verlust, die aus dem Verlust von eGFP Expression geschlossen werden kann, kann vollständig Integration kostenlos IPSCs für zukünftige klinische Anwendungen führen.
Inhärente dem Verfahren iPSC Generation Unterdrückung von linienspezifischen Genen und Reaktivierung von Pluripotenz-assoziierten Genen. Regulation der Genexpression erfolgt auf mehreren Ebenen innerhalb des Ringes, einschließlich Modifikationen an DNA und Chromatin Transkriptionsfaktoren erlauben, regulatorische DNA-Elemente, und die RNA-Polymerase den Zugang zu ZielGene. Umbau des epigenetischen Landschaft über weltweite Chromatinmodifikationen ist eine Schlüsselkomponente erneut Ausdruck der Pluripotenz genetische Programm. Eine spezifische Chromatin Modifikation, bei der Regulation der Genexpression wichtig ist, ist die Acetylierung von Histonen in bestimmten Lysinreste, die den Zugriff ermöglicht, um Gene durch die verringerte Spannung der Histon-DNA Spule Ziel. HDAC-Inhibitoren sind kleine Moleküle, die gezeigt haben, um iPSC Umprogrammierung und hESC Selbsterneuerung 9,10 erweitern, die wahrscheinlich auf die Unterstützung der acetylierten Zustand 11. Die nachfolgend beschriebene Protokoll aus einer früheren Veröffentlichung mit Integration Lentiviren 12 angepasst, bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur optimierten iPSC Generation aus dem peripheren Blut mit Episomen und HDAC-Inhibitoren. Die HDAC-Inhibitor-Konzentrationen werden dabei die Hälfte derjenigen von Ware et al. 9 und routinemäßig in eine 2-fache Zunahme in vollständig umprogrammiert iPSC Kolonien über Standard führtenepisomaler Umprogrammierung Protokolle ohne HDAC-Inhibitoren. Dieses Niveau der Umprogrammierung ist auf Augenhöhe mit der Effizienz beobachten wir mit lentiviralen Methoden. Mit diesem Protokoll haben wir effizient erzeugt iPSC von Einzelpersonen so alt wie 87 Jahre alt.
Für eine erfolgreiche iPSC Generation, wenn Sie dieses Protokoll, gibt es mehrere wichtige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Während der Erythroblasten Ausbaustufe sollte die Medienwechsel Zeitplan strikt eingehalten werden, da Abweichungen können zu einer ineffizienten Stimulation des Zielvorläuferzellpopulation und einer niedrigeren Effizienz iPSC Generation führen. Es ist wichtig, neue Expansionsmedium mit frischem Dexamethason mit jedem Medienwechsel zu machen; und die QBSF-60 Basismedium un…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die folgenden Zuschüsse aus dem NIH für die Unterstützung dieser Forschung zu bestätigen: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) und K12HL0806406 (SKS); und die JP McCarthy Foundation (AR).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4°C. |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4°C. |
fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C. |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4°C. |
penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4°C. |
Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4°C. |
2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use. |
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4°C. |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4°C. |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4°C. |
L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20°C. |
non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C, away from light. |
DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4°C. |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20°C. |
sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4°C. |
sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4°C. |
basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C. |
ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately. |
StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20°C. |
ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000X stock (100 mM) in DPBS. |
dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
15 mL conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
10 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
5 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
2 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
20 μL pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |