Protocol
נהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם לN פרוטוקולי ° 071140-000821-12 ו08,052,010 אושר על ידי ועדת הכבוד לניסויים בבעלי החיים ודירקטוריון ההוראה של בית הספר לרפואה, Universidad de la רפובליקה - אורוגוואי.
.1 Sublingual מנהל של הסוכן הטיפולי
- הכן את התמיסה המכילה סוכן הטיפולי להיבדק. התאם את הריכוז כדי לנהל נפח מרבי של 10 μl לכל עכבר.
הערה: לקבלת flagellin מטוהרת מserovar enterica סלמונלה typhimurium המינון האופטימלי כדי לגרום להגנה בעכבר נגוע במנה הקטלנית הראשונה של ס ' סרוטיפ pneumoniae E1586 1, גורם לתמותת 100% היא 10 מיקרוגרם / עכבר. פתרון flagellin חייב להיות מחומם על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על מנת להבטיח שחרורו של מונומרים. לקבלת מידע נוסף על טיהור flagellin ראה התייחסות 26.- Varריכוז y היעיל של סוכני המערכת החיסונית שונים בהתאם לגודלו המולקולרי, טוהר, רגישות לproteolysis והשימוש בסוכני mucoadhesive. התאם את הריכוז אופטימלי עבור כל מתחם להיבדק על מנת למקסם את ההשפעות שלה. אם מחקרים קודמים על ידי מסלול אף שנערכו למתחם מסוים, להשתמש במינון ההתחלתי של 5 עד 10 פעמים גבוהות יותר כדי לבחון את יעילותה על ידי תוואי תת לשוניים.
- לטשטש את העכברים על ידי הזרקת קוקטייל המכיל 110 מ"ג / קילוגרם קטמין עם 5.5 מ"ג / קילוגרם Xylacine ותנו לחיות לנוח במשך 7 עד 10 דקות.
- לאשר הרדמה נאותה על ידי הלחיצה בעדינות שודדת הדרכים של אחת מרגליו האחוריות; אם מורדם כראוי בבעלי החיים לא יעברו בתגובה לגירוי.
- מורחים שכבה דקה של משחה וטרינר על העיניים של כל עכבר כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
הערה: הרדמה Inhalatory כמו isofluorane ניתן גם להשתמש במקום קטמין / Xylacine אם מערכת לציידped עם קונוסים קאמריים והאף אינדוקציה זמין. השתמש בתא האינדוקציה לanaesthetise בעלי החיים ולנהל את המערכת החיסונית על ידי תוואי תת לשוני. מייד לחבר את בעלי החיים לחרטומו לפחות 15 דקות כדי לשמור אותו בהרדמה, כדי למנוע בליעה ולאפשר ספיגת מרכיבים הטיפולית. - פיפטה הפתרון המכיל את פתרון המערכת החיסוני או שליטה ברכב; באמצעות האגודל ואצבע המורה של היד הלא הדומיננטית לקחת את העכבר והחזק אותו במצב אנכי.
- שימוש ביד המקום הדומיננטי זוג מלקחיים סגורים מתחת ללשון ולהחזיקו במקום באמצעות האצבעות האמצעיות וטבעת, לפתוח את המלקחיים מעט להרים את הלשון.
- קח טפטפת ולנהל את הפתרון על הרצפה בצד הפה וגב של הלשון.
- הסר את המלקחיים ולתת מנוחת העכבר במשך 3 עד 5 דקות לפני שהכניס אותו בחזרה לכלוב. כדי להבטיח הטמפרטורה הנורמלית שנשמרה במיקרופון המורדםדואר, לחבר את הכלובים למערכת חימום כלוב. אם מערכת כזו אינה זמינה, עכברי מקום המשתייכים לאותה קבוצת הטיפול בחזרה לאחד הכלוב המקביל אחד ליד שני על המצעים ובחלקו לכסות אותם ביריעות נייר טישו נקיות כדי לעזור להם לשמור על טמפרטורת הגוף.
- לאסוף דגימות רקמה בכל נקודה לאחר החדרת סוכן המערכת החיסונית של זמן כדי לנתח שינויים באוכלוסיות תאים הנגרמות על ידי הטיפול.
הערה: בממשל פרוטוקול המסוים הזה של flagellin בוצעה 2 שעות לפני האתגר. לקבוע זמן אופטימלי בין טיפול ואתגר עבור כל סוכן טיפולי מסוים והפתוגן להיבדק.
2 הכנת ההשעיה החיידקים ואף אתגר עם Streptococcus pneumoniae
הערה: ס pneumoniae הוא הפתוגן אנושי טבעי שיכול לגרום למחל מסכנות חיים כמו דלקת ריאות פולשנית, אלח דםודלקת קרום מוח. הילוכים עלולים להתרחש כאשר בשאיפה או במגע עם רירית. לכן, כל הדגימות שעשויות היו במגע עם ס ' pneumoniae חייב להיות מטופלים במתקן רמת ביטחון ביולוגי השני מתאים באמצעות קבינט בטיחות ביולוגי בכיתה השנייה. בדקו את נהלי הפעולה התקנית של המוסד שלך לגבי טיפול בגורמי מחלה מסוג II לביגוד מגן, סילוק פסולת ואמצעי אבטחה נוסף שעשויות לחול. צריכים להיות כל הזמן בעלי חיים נגועים בכלובים מאווררים בנפרד במבודדים מצוידים במסנני HEPA. חיסונים נגד דלקת ריאות וטיפול אנטיביוטי זמינים. לקבלת מידע נוסף, ראה אזכור 27 ו1.
- להפשיר aliquot של השעיה המניה עובדת של Streptococcus pneumoniae של מספר CFU חיידקים הידוע שהוכן כמתואר ב15.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב2,500 XG וRT.
- בטל supernatant ולשטוף את כדור החיידקים על ידי השעיית זה ב 1 מ"ל של stתמיסת מלח erile. השתמש בעצות מסנן בעת הכנת השעיה חיידקים, דילולים או לאתגר בעלי חיים.
- צנטריפוגה שוב כמתואר בשלב 2.2.
- בטל supernatant וresuspend גלולה בנפח המתאים של תמיסת מלח סטרילית לקבל השעיה של 4x10 5 CFU / 50 μl. מינון זה מתאים למנת חיידקי המינימום של ש ' סרוטיפ pneumoniae E1586 1 שגורם לתמותת 100% בעכברים / ג BALB על פי מחקרים קודמים 15.
הערה: בעת הקמת מודל של דלקת ריאות דלקת ריאות בעכברים, מינון חיידקי המינימום גורם לתמותה 100% צריכים להיקבע עבור כל שילוב מסוים של זן חיידקים, סרוטיפ וזן עכבר. - Homogenize ההשעיה חיידקים על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים.
- עומס 50 μl של ההשעיה החיידקים באמצעות קצה סינון סטרילי ולהנחיל את הנפח הכולל לתוך הנחיריים של עכבר מורדם. החזק את upri העכברght למשך 2 דקות ולתת לו לנוח בתנוחת גב למשך 2 דקות נוספות. החל המשחה וטרינר על העיניים ולהחזיר את בעלי החיים לכלוב; הקפד לשמור על טמפרטורה נורמלית ואילו בהרדמה.
הערה: במחקר זה אתגר חיידקים בוצע בהיקף של 50 μl כדי להבטיח אספקה של לפחות 90% מCFU סך הכל לריאות, כפי שנקבע בעבר ב15,28. כדי למזער את המצוקה של כמויות הקטנות יותר של בעלי החיים (למשל, 20 μl) יכול לשמש. עם זאת, אספקה יעילה של חיידקים לריאות יש לבדוק; זה יכול להיעשות על ידי קצירת הריאות 5 דקות אחרי האתגר וספירת CFU בhomogenates 'ריאות על ידי ציפוי דילולים סדרתי על צלחות דם אגר. - לאשר את מספרי CFU בהשעית החיידקים המשמשות לזיהום על ידי ציפוי דילולים פי 10 סידוריים על גבי צלחות אגר דם. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולספור את מספר המושבות ריריות הצגה אופייני הילה ירוקה של אלחיידקים המוליטית תרו.
אוסף רקמות .3 והכנת דוגמאות לניתוח cytometry זרימה (FACS)
3.1) אוסף רקמות
- להרדים את בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם או באמצעות CO 2 קאמריים; לפתוח את חלל בית החזה כל הדרך עד לצוואר ועושה חתך לאורך הרגליים הקדמיות כדי לחשוף את הצד הגחוני של הצוואר ואזור submandibular.
- עם המלקחיים קצה מעוגל הדקים משוך בעדינות את בלוטות רוק וברקמות רכות סמוכות כדי לחשוף את צד הגב של רצפת הפה. בעזרת מלקחיים קצה דקים מעוקלים, לקחת את הלסת התחתונה ובלוטות לימפה בלסת תחתונות, אבזר על ידי משייכתו בעדינות ומניח אותם בצינור המכיל מלא RPMI (cRPMI, ל500 ml- 10% בסרום שור עוברי, 5 מ"ל של תמיסה המכילה 10,000 U / ml פתרון פניצילין ו10 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין ו5 מ"ל של L-גלוטמין 200 מ"מ) או פתרון משמר חומצות גרעין בהתאם לנוהל במורד הזרם שיהיהלהתבצע מאוחר יותר.
- כדי לפתוח את חלל בית החזה לעשות חתך בסרעפת; באמצעות זוג המלקחיים עכברוש שיניים מהדק את סחוס xyphoid של עצם החזה ובזהירות לחתוך את הצלעות בשני הצדדים הגב החל מצלעות שווא כל הדרך עד שהגיע לנקודה שבה הצלעות האמיתיות לפגוש manubrium של עצם החזה.
- על ידי לחיצה על סחוס xyphoid של עצם החזה עם המלקחיים, למשוך בעדינות כדי לחשוף את האיברים של חלל בית החזה.
- הסר את הצלעות לחלוטין על ידי חיתוך הצלעות הראשונות ועצם הבריח. התימוס יופיע כמבנה לבן של שתי אונות ממוקמות בחלק anteroventral של קרוב החזה לבסיס של הלב.
- קח את אחד מהאונות על ידי כיווץ אותו עם זוג המלקחיים ולהשתמש במספריים כדי להסיר את הרצועות בין הפנים הנחותים שלה וקרום הלב. המשך להסיר את האונה השנייה.
- זהה את חלל הבטן ולפתוח אותו על ידי חיתוך לאורך ציר החציון של מ 'קיר uscular לחשוף את האיברים. עם זוג המלקחיים לחתוך את הווריד נבוב האחורי ואב עורקים החזי; להסיר את העודפים של דם עם רקמה סופגת.
- כדי לנתח את אוכלוסיות תאי תושב וההסתננות של alveoli לבצע שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). חותך את השרירים בחלק הגחוני של הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה והוושט; כדי להפריד ביניהם לעשות חתכים בצדדים לרוחב וגב של המבנים.
- להרים את קנה הנשימה עם המלקחיים ולעשות חתך קטן עם אזמל להציג פיפטה העברה דק טיפ מלא 1 מ"ל של PBS ללא Ca 2 + / Mg 2 + תוספת 1 mM EDTA. להחדיר ולשאוב את הנפח הכולל לפחות שלוש פעמים; לשאוב ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 1.5 מ"ל סטרילי ולמקם אותו על קרח.
- כדי לנתח את אוכלוסיות תאים הנמצאות בparenchyma ריאה, תנקב ראשון ריאות על ידי הזרקת 5 מ"ל של PBS ללא Ca 2 + / Mg 2 + תוספת 1 mM EDTA לחדר ממנישל הלב.
הערה: זה יהיה לחסל את רוב תאי הדם האדומים ותאי חיסון הנוכחיים לכלי הדם של הריאות. אם זלוף בוצע בצורה נכונה, צבע ריאות יעבור מורוד ללבן. - לבודד את הלב מהריאות על ידי כיווץ אותו מהבסיס של החדר השמאלי ובעדינות לחתוך את כלי דם במספריים כדי להסיר אותו לחלוטין. קחו את ריאות perfused ולמקם אותם בcRPMI או פתרון משמר חומצות גרעין בהתאם לניתוח במורד הזרם שיש לבצע.
- לניתוח של אוכלוסיות תאים ברירית sublingual, לבודד את ראשו של בעל החיים ולהסיר את בלוטות רוק וברקמות רכות סמוכות אם זה לא נעשה בשלב 3.2.1.
- עושה חתך בכל צד של הפה עד שמגיע למפרק הלסת התחתונה ולהפריד את הלסת הנחותה יחד עם הלשון ורצפת הפה, באמצעות סיכות לתקן את זה על הלוח לנתיחה. משוך את הלשון; באמצעות אזמל לעשות חתך שבו base של הלשון פוגש רצפת הפה עד שמגיע לטוחנות שלישי לחשוף את רירית sublingual.
- הסר את הלשון לגמרי; לקחת ביופסית 0.5 מ"מ ומניח אותו בסמוך לחותכות התחתונות. לחתוך מהכנסת החניכיים של הרקמות ולחצו תת הלשוניות בעדינות עד רצפת הפה נחתך לגמרי.
- חזור עוד פעם אחת עכשיו הצבת הביופסיה קרובה לטוחנות שלישי כדי להשלים את ההסרה של הרקמה תת הלשונית. מניחים על צינור נקי המכיל cRPMI או חומר משמר חומצות גרעין.
3.2) לדוגמא הכנה לניתוח FACS.
- העבר את הרקמות של הריאות מבודדות מכל עכבר לתוך צלחת 24 גם ובררת אותם עם זוג נקי של מספריים עד לקבלת חתיכות קטנות של רקמה של כ -2 מ"מ. הוסף 1 מ"ל לכל טוב של מדיום עיכול המכיל 30 מ"ג מסוג II Collagenase, 50 מיקרוגרם DNAse-I ב 1 מ"ל של RPMI ללא FBS. פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים ולדגור על37 ° C ו 5% CO 2 ל40 דקות.
- לניתוח של אוכלוסיות תאים ברקמה תת הלשונית, להחליף בינוני העיכול ב3.2.1 עם אחד המכיל 2 יחידות של Dispase, 30 הסוג השני Collagenase מ"ג, 50 מיקרוגרם DNAse-I ב 1 מ"ל של RPMI. דגירה הרקמות שנאספו מעכבר אחד ב500 μl של מדיום עיכול עבור 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס בייקר מסלולית ב50 סל"ד.
- לאחר דגירה, פיפטה למעלה ולמטה עד 10 פעמים או 30 שניות עד שרוב הרקמות שובש. סנן את ההשעיה התא אף מסננת תא סטרילי 40 מיקרומטר ולשטוף עם 5 מ"ל של PBS בתוספת 5 מ"מ EDTA.
הערה: עיכול מלא של המטריצה תאית ורקמה סיבית לא תושג. עם זאת, פעמים דגירה ארוכות יותר בנוכחות של collagenase ו / או dispase או טחינה דקה אגרסיבית אינן מומלצים שכן הוא יגרום למוות תא גדל והרס של חלבונים תאיים המשפיעים על התוצאה הכוללת של Fניתוח ACS. - צנטריפוגה ב XG 400, 5 דקות, 4 ° C.
- לניתוח של אוכלוסיות התאים בBAL, צנטריפוגה התאים ב XG 400, 5 דק ', 4 ° C והמשך לשלב 3.2.4.
- לניתוח של אוכלוסיות תאים בבלוטות לימפה, למקם את מסננת 70 מיקרומטר תא על צלחת פטרי סטרילית ולשים את הבלוטות הלימפה יחד עם 1 מ"ל של cRPMI לתוך המסננת. להוציא את הצעד של מזרק סטרילי 2 מ"ל ולהשתמש בו כעלי לרסק את בלוטות הלימפה נגד הרשת של המסננת. יש לשטוף את מסננת התא עם 1 מ"ל של cRPMI הטרי ולהעביר את התאים מצלחת פטרי לצינור סטרילי.
- קח aliquot נציג של כל דגימה ולהכתים אותו עם Trypan הכחול כדי לקבוע את המספר הנייד של קיימא.
- Resuspend תאי FACS-EDTA: PBS-5% mM EDTA-1 סרום Albumin- שור כדי לפצות השעיה של 2x10 7 תאים / מ"ל ולהוסיף 50 μl לתוך צינור cytometer.
- להכין תערובת נוגדני 2X מכילה apprשילובי opriate של נוגדנים כנגד סמני משטח וfluorochromes על פי מכשיר FACS זמין. הוסף 50 μl של תמהיל נוגדני 2X לתוך צינור אחד המכיל את ההשעיה התא.
הערה: לכייל כל נוגדן שכותרתו fluorochrome לקבוע את הכמות האופטימלית לשימוש, לפרוטוקול מפורט ראה התייחסות 29. - דגירה 30 דקות על קרח בחושך.
- לשטוף פעם אחת עם 3 מ"ל של FACS-EDTA וספין למטה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend התאים 200 μl מאותו המאגר ולנתח בCytometer זרימה.
הערה: אם טיפול במספר גדול של דגימות, הפרוטוקול מכתים לניתוח FACS שתואר לעיל יכול להתבצע ב96-גם צלחות U-תחתונה במקום צינורות cytometer. עם זאת, אם באמצעות צעדי כביסה 96-גם צלחות חייבת להתבצע על ידי הוספה עד 200 μl של FACS-EDTA וחוזר על זה 4 פעמים שצנחה התאים ב XG 400 למשך 5 דקות ב 4 ° C בין כל washiצעד ng. - בשלב זה, לתקן את הדגימות לבדיקה בזרימה cytometer מאוחר יותר (עד 72h לאחר קיבוע).
- כדי לתקן התאים, לאחר תיוג עם FACS-הנוגדנים לשטוף את התאים בPBS אין Ca 2 + / Mg 2 +, 1 mM EDTA ללא FBS. להשעות את התאים 50 μl מאותו המאגר ולהוסיף 50 μl של פתרון paraformaldehyde 4% מוכנים טרי בhypertonic (2X) PBS אין Ca 2 + / Mg 2 +.
- דגירה של 20 דקות ב RT ולשטוף 3 פעמים בFACS-EDTA.
- Resuspend התאים 200 μl של FACS-EDTA ולאחסן ב 4 ° C ומוגנים מפני האור לעד 72 h.
הערה: יכול להיות מושפע FSC-SSC על ידי קיבוע. אם תיקון הדגימות לבדוק את התאימות של נוגדנים שכותרתו fluorescently עם היצרן שכן הוא יכול להיות מושפלים צבעי טנדם בנוכחותם של סוכנים מקבע. אם דגימות מקורו מבעלי חיים נגועים קיבעון מומלץ מאוד כדי לוודא ששום פתוגנים קיימא יהיו נוכחים כאשר analyלשיר הדגימות במכונה FACS מאז יכול להיות שנוצר microaerosols במהלך הרכישה של המדגם.
.4 סך הפקת RNA, cDNA סינתזה וReal Time PCR.
4.1) מיצוי RNA וסינתזת cDNA.
- Homogenize הרקמות בפתרון משמר חומצת הגרעין של בחירה על ידי הפרעה מכאנית (למשל, באמצעות homogenizer רוטור גלגל מכון, במהירות גבוהה רועדת רקמות ruptor וחרוזים, וכו '). צנטריפוגה ב XG 12,600 עבור 15 דקות ו4 ° C. כדי להסיר את פסולת הרקמה. העבר את supernatant לצינור נקי.
- חלץ את RNA עם שיטת הבחירה הבאה הוראות יצרן.
הערה: RNA הוא רגיש מאוד להשפלה, אם זה לא הולך להיות בשימוש מייד לאחר בידוד, להפוך aliquots ולאחסן אותם בצינורות חופשיים RNAse ב -80 מעלות צלזיוס. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות. הצינורות יש לטפל בם בכפפות בכל העת. לאחר הפשרת הדגימותlways לשמור אותם על קרח. - מדוד את הספיגה של חומצות גרעין ב 260 ננומטר ולחשב את הריכוז במיקרוגרם / μl.
- הכן DNAse-אני מערבב על ידי תוספת של (למדגם 1): 7.6 μl מים ultrapure, 1 μl של 10X DNAse-חיץ, 0.4 μl של DNAse-I (כיתה הגברה) מניות 1 U / μl, ולהוסיף 8.4 μl של DNAse-אני מערבב לכל דגימה המכילה 1 מיקרוגרם של רנ"א הכל.
- השתמש RNA בריכוז של מיקרוגרם / μl 1 ולבצע את תגובת retrotranscription (RT-PCR) על ידי הוספת 1 μl של רנ"א הכל כתבנית. אם הדגימות הן מדוללים מדי והריכוז הוא נמוך מהצפוי, להוסיף כמויות גדולות יותר של רנ"א הכל במקום מים. אל תחרוג 20% מסופיים נפח התגובה בעת הוספת RNA במיוחד אם פרוטוקול מיצוי RNA של בחירה מעורבת תערובת פנול, כלורופורם מאז עקבות פנול יכולות להשפיע על התשואה של RT-PCR.
- דגירה 15 דקות ב RT ואחריו 10 דקות ב 4 ° C. או ice. (אל תעלה על זמן הדגירה !!)
- הוסף 1 μl של EDTA 25 מ"מ (כיתה ביולוגיה מולקולרית) על צינור אחד ולדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להשבית DNAse-I.
- הכן retrotranscription תמהיל (RT) כדלקמן (לתגובה 1): 1 μl מניית פריימרים hexamer האקראי 0.2 מ"ג / מ"ל, dNTPs μl 1 המניה 10 מ"מ, 4 μl חיץ 5X M-MLV-RT, 2 μl DTT 0.1 M, 1 μl מניית RNAse OUT 40 U / μl, וμl 1 M-MLV retrotranscriptase 200 U / μl המניה.
- הוסף 10 μl של RT-PCR לערבב לצינור תגובת 10 μl DNAse-I.
- לבצע את תגובת PCR בCycler תרמית על פי התכנית הבאה:
מחזור 1X: 10 דקות, 25 ° C; 50 דקות, 37 ° C; 15 דקות, 70 מעלות צלזיוס - לדלל את cDNA 1: 5 על ידי הוספת 80 μl מים ultrapure. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
4.2) בזמן אמת PCR (qPCR).
- הכן תערובת תגובת qPCR כדלקמן (לתגובה 1): תערובת אב 5 μl מכילה תקי DNA Polymerase, צבע ירוק SYBR, PCR הצפת, תמהיל dNTP וMgCl 2 (ראו 4.2.2 להלן); 0.9 μl של פתרון 10 מיקרומטר המניה של פריימר קדימה, 0.9 μl של פתרון 10 מיקרומטר המניה של פריימר ההפוכה, מים ultrapure 1.2 μl, ו2 μl של תבנית cDNA מדולל בעבר כפי שצוינו בשלב 4.1.10.
הערה: פרוטוקולי ריכוז מגיב ורכיבה על אופניים בשימוש בסעיף זה היו מותאמים להתבצע באופן ספציפי עם ריאגנטים ומכשירים המתוארים ב" טבלה של חומרים וריאגנטים ", ניתן להשתמש במותגים אחרים, אבל כרכי תגובה, ריכוז מגיב ופרוטוקול רכיבה על אופניים עשויים להשתנות. בדקו הוראות היצרן שלך לפני ביצוע RT-qPCR. - הגדר את מכשיר qPCR כדלקמן:
מחזור 1X: 15 דקות, 95 מעלות צלזיוס
40X מחזורים: 15 שניות, 95 ° C ואחריו 1 דקות, 60 ° C (בקרינה לרכוש נקודה זו).
הערה: לכימות היחסית של mRNA לפי שיטת Ct 30 referencגן דואר יש לבחור לנורמליזציה של ערכי CT. גן ההתייחסות של בחירה צריך להיבדק בתנאי assay ספציפיים כביטוי שלה עשוי להשתנות; ACTB, GAPDH או 18S הם חלק מהגנים שנבחרו בדרך כלל כאזכור. - הגדר את ערך הסף ולנתח את הנתונים.
Representative Results
טיפול חיסוני תת לשוני ניתן להשתמש בם בהצלחה לווסת את התגובה החיסונית של ריאות. הראינו כי מנה בודדת של flagellin, אגוניסט TLR5 וNLRC4, יכולה לגרום להגברת ביטוי משמעותית של mRNA קידוד CXCL1 כמוקינים, CCL20 וציטוקינים IL-6 בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופל מלוחה. מקפלים אינדוקציה של רמות mRNA הגיעה לשיא של 8 שעות לאחר SLIT ולחזור לרמות בסיס לאחר 20 שעה (איור 1). עם זאת, כאשר SLIT בוצעה זיהום אף לפני 2 שעות עם S. Pneumoniae, רמות של Cxcl1 וIl6 mRNA נשארו הוגברו באופן משמעותי אפילו 24 שעות לאחר SLIT בהשוואה לבעלי חיים שאינם מטופלים (איור 2).
ניתוח של אוכלוסיות התאים בBAL ורקמת ריאה על ידי FACS גילה כי בעלי החיים שטופלו בפלי ידי תוואי sublingual עלו מספר הנויטרופילים בדרכי הנשימה, אך לא ברקמות של הריאות (איור 3).
s = "jove_content"> לבסוף, הישרדות לאחר אתגר דלקת ריאות הושוותה בבעלי חיים שטופלו בעבר עם פלי ידי תוואי תת לשוניים או עם מי מלח כביקורת. כפי שניתן לראות באיור 4, SLIT עם flagellin קידם הגנה והגדיל את ההישרדות נגד דלקת ריאות דלקת ריאות חריפות.
איור 1 קינטיקה של פרופיל תעתיק של הריאות לאחר טיפול חיסוני תת לשוני עם flagellin. עכברי BALB / ג שמונה ל10 שבועות (n = 4) טופלו ב10 מיקרוגרם של flagellin או מלוח על ידי תוואי תת לשוני בהרדמה. ריאות נאספו בנקודות זמן שונות והניחו במשמר חומצות גרעין. מיצוי RNA סה"כ בוצע וcDNA היה מסונתז. רמות mRNA הוערכו על ידי בזמן אמת PCR באמצעות פריימרים ספציפיים המפורטים בtabl.1 כימות יחסית דואר נעשה על פי שיטת ΔCt באמצעות רמות ACTB mRNA לנורמליזציה. תוצאות מוצגות כגידול של פי בהשוואה לקבוצה שטופל מלוחה כחציון ± SEM. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P <0.05) מחושבים על פי מבחן Mann-Whitney. תוצאות הן נציג של 2 ניסויים בלתי תלויים.
פרופיל תעתיק 'ריאות איור 2 במהלך דלקת ריאות דלקת ריאות לאחר טיפול חיסוני תת לשוני עם flagellin. עכברי BALB / ג ישנים שמונה ל10 שבועות (n = 4 לקבוצת ביקורת וn = 7 לקבוצה שטופלה) טופלו ב10 מיקרוגרם של flagellin או מלוח על ידי מסלול sublingual תחת הרדמה. 2 שעות מאוחר יותר עכברים היו תיגר על ידי מסלול אף עם המינון המינימלי הקטלני (MLD) גורם 10תמותת 0% מבודד קליני של ס ' סרוטיפ pneumoniae E1585 1, המקביל ל 4x10 5 CFU / 50 μl. ריאות נאספו 24 שעות אחרי אתגר ומאוחסנות במשמר חומצות גרעין עד מיצוי RNA וסינתזת cDNA בוצעו. זמן אמת PCR בוצע (ראה רשימת פריימר בטבלה 1) וכימות יחסי נעשה על פי שיטת ΔCt באמצעות רמות ACTB mRNA לנורמליזציה. תוצאות מוצגות כגידול של פי בהשוואה לקבוצה שטופל מלוחה כחציון ± SEM. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P <0.05) מחושבים על פי מבחן Mann-Whitney.
איור ניתוח .3 של נויטרופילים polymorphonuclear (PMN) גיוס ברקמות של ריאות ודרך הנשימה לאחר SLIT. שמונה לעכברי BALB / ג 10 שבועות (n = 4) טופלו ב10 מיקרוגרם של flagellin או מלוח על ידי תוואי תת לשוני בהרדמה. 2 שעות מאוחר יותר עכברים היו תיגר על ידי מסלול אף עם MLD של ס ' סרוטיפ pneumoniae 1 E1585. 24 שעות אחרי האתגר, BAL בוצעה וריאות עובדו לניתוח FACS. PMN זוהו כתאי Ly6G גבוהים / CD11b הגבוה / CD11c שליליים ומבוסס על פרופיל FCS-SSC. תוצאות באות לידי ביטוי כאחוז מPMN ביחס של מספרים סלולריים הכולל בBAL או ריאות. ברים מייצגים חציון ± SEM. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P <0.05) מחושבים על פי כיוון אחד מבחן Mann-Whitney.
SLIT איור 4 עם flagellin מגן עכברים נגד דלקת ריאות דלקת ריאות חריפות. ס ' סרוטיפ pneumoniae 1 E1585. ההישרדות הוערכה על בסיס יומי. עקומות Kaplan-Meier הושוו על פי יומן דרגה מבחן (Mantel-Cox). כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית (P <0.05) .Results הם נציג של 2 ניסויים בלתי תלויים.
| שם | רצף 5'-3 " | אורך מוצר PCR (נ"ב) |
| MB-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| MB-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| MIL-6_F | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| MIL-6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
רשימת טבלה 1 פריימר משמשת לניתוח PCR בזמן אמת. רצפי פריימר ספציפיים המשמשים לניתוח qPCR. קדימה לאחור פריימרים לACTB עכבר, Cccl20, Cxcl1, Il6, Tnfa וCxcl1 מוצגים כרצפים '5'-3 ואורך המוצר צפוי מצויינים בזוגות בסיסים (bp).
Discussion
ממשל sublingual של סוכנים טיפוליים הוכח כאמצעי שימושי כדי לווסת את התגובה החיסונית בדרכי הנשימה. היתרון העיקרי של SLIT לטיפול במחלות דרך נשימה הוא שזה לא כרוך במשלוח ישיר של תרכובות לתוך הריאות או הנחיריים, להיות בטוח יותר מאשר טיפולים הבוסס על ממשל האף 31 ב.
טיפול חיסוני תת לשוני ניתן להשתמש בם כדי לווסת את התגובה החיסונית בדרכים שונות, או לזירוז של תגובות רגולציה שיכולה לשפר את הסימפטומים של דלקת ואסטמה 32 אלרגיות או כדי לגרום להפעלה זמנית של מנגנוני חיסון מולדים לטיפול בדלקות ריאות חריפות כפי שמוצג כאן.
מודל העכבר שהוצג בסרטון הזה הוא שיטה נוחה להקרנה של תרכובות שונות כסוכנים טיפוליים לSLIT.
מודל חיה זה מהווה כלי שימושי כדי לקבוע את ההשפעהשל SLIT בתגובה החיסונית של הריאות כמו גם באיברים אחרים (למשל., ניקוז בלוטות לימפה או באתרים ברירית דיסטלי) שלא ניתן חיקו על ידי השימוש במודלים במבחנה. למרות שיש כמה מאמרים המתארים את התוצאות שהושגו באמצעות טיפול חיסוני תת לשוני, שיטות מפורטות לנהלים של ממשל sublingual לא היו זמינות עדיין. בנוסף, המודל יכול לשמש להערכה של חיסוני sublingual במטרה להעניק הגנה מערכתית כמו גם מקומית בדרכי הנשימה.
כפי שניתן לראות בווידאו המצורף, ממשל sublingual של תרכובות הוא הליך פשוט שניתן לבצע בקלות ללא הצורך בהכשרה מקיפה. בדרך כלל, אדם בקיא בטיפול בבעלי חיים ידרוש 1 שעות לביצוע חתך בקבוצה של 10 עכברים באמצעות הרדמה בזריקות כפי שתואר בפרוטוקול זה. אם אתגר דלקת ריאות מתבצע כמו גם, יידרשו 90 דקות נוספות כדי להכין אתההשעיה והחיידקים לבצע אתגר אף של בעלי החיים.
פרוטוקולי FACS שהוצגו כאן מאפשרים אפיון נוח של השפעה של SLIT באתר המקומי של ממשל, ניקוז בלוטות לימפה, כמו גם ההשפעות שלהם על דינמיקת התא של הריאות.
ניתוח נפרד של parenchyma התוכן וריאות רונכואלוואולרית חשוב להפלות תושב חיסוני של דרכי הנשימה והסתננות סוגי תאים מאלה שנותרו בתוך הרקמה. ניתוח של תוכן BAL מאפשר הלימוד של מחזור מקרופאג מכתשי, כמו גם דינמיקה של גיוס תאים לתוך חללי מכתשי הנגרמים על ידי טיפולים שונים, למשל., PMNs, אאוזינופילים, מונוציטים. גם BAL ניתן להשתמש כדי להעריך את הנוכחות של ציטוקינים וכמוקינים מופרשים על ידי Assay Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) או זיהוי של נוגדני IgA מופרשים שהושרו לאחר חיסון תת לשוני. מחקר של רקמת הריאותיאפשר אפיון של סוגי תאים אחרים, תאים דנדריטים קלאסיים, תאי T ותאי B.
הכנת דוגמאות BAL ובלוטות לימפה לניתוח FACS היא פשוטה. לאחר איסוף דגימה, בדרך כלל 60 דקות נדרשות כדי להשלים את הפרוטוקול מכתים ל10-20 דגימות. בניגוד לכך, בידוד של תאים מריאות או רקמה תת לשונית ידרוש זמן רב יותר מאז נדרש עיכול של מטריקס. קליטתו של הסוכן הטיפולי מועבר על ידי תוואי sublingual ניתן לטפל על ידי מעקב של מולקולות fluorescently או שכותרתו רדיואקטיבית תוך שימוש במערכות ההדמיה vivo.
טיפול חיסוני תת לשוני הוא שיטה אטרקטיבית כדי לגרום ליעילות מערכת חיסונית בדרכי הנשימה, כמו גם באופן מערכתי שיכול לשמש כדי לטפל או למנוע מחלות דרך נשימה. הבהרת מנגנוני קביעת הפעלה לעומת סובלנות של התגובה החיסונית בדרכי הנשימה אחרי שאני SLITזה חיוני כדי לאפשר תכנון רציונלים של אסטרטגיות טיפוליות חדשות שיכול לשמש לבד או בשילוב עם טיפולים זמינים כנגד תנאים שונים בדרכי הנשימה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
- Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
- Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
- Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
- Ramirez, J. A., Anzueto, A. R.
- Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
- Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
- Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
- Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
- Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
- Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
- Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
- Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
- Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
- Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
- Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
- Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
- Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
- Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
- Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
- Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
- Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
- Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
- Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999 (2009).
- Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
- Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
- Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
- Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
- Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1 (2001).
- Kubista, M., et al.
- Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
- Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).
