Protocol
Procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com os protocolos N ° 071140-000821-12 e 08.052.010 aprovado pela Comissão Honorária de Experimentação Animal e do Conselho Directivo da Faculdade de Medicina da Universidad de la República - Uruguai.
1. sublingual administração do agente terapêutico
- Preparar a solução que contém o agente terapêutico a ser testado. Ajustar a concentração para administrar um volume máximo de 10 ul por rato.
NOTA: Para a flagelina purificada a partir de Salmonella enterica serovar Typhimurium a dose óptima para induzir protecção em ratinhos infectados com a primeira dose letal de S. pneumoniae sorotipo 1 E1586, causando 100% de mortalidade é de 10 mg / mouse. Flagelina solução deve ser aquecida a 65 ° C durante 5 minutos para assegurar a libertação dos monómeros. Para mais informações sobre a purificação flagellin ver referência 26.- Varconcentração eficaz y de diferentes agentes imunomoduladores de acordo com o seu tamanho molecular, a pureza, a susceptibilidade à proteólise e à utilização de agentes mucoadesivos. Ajustar a concentração óptima para cada composto a ser testado para maximizar os seus efeitos. Se os estudos anteriores por via intranasal foram conduzidos para um composto em particular, utilizar uma dose inicial de 5 a 10 vezes maior para testar a sua eficácia por via sublingual.
- Anestesiar os camundongos injetando um coquetel contendo 110 mg / kg de cetamina com 5,5 mg / kg Xylacine e deixe os animais descansar por 7-10 min.
- Confirme anestesia adequada, pressionando suavemente a pata de uma das patas traseiras; se adequadamente anestesiado o animal não irá mover-se em resposta ao estímulo.
- Espalhe uma camada fina de pomada veterinário sobre os olhos de cada rato para evitar a secura sob anestesia.
NOTA: anestésicos por inalação, como Isofluorano pode também ser utilizado em vez ketamina / Xylacine se um sistema de equiparped com câmara e do nariz cones de indução está disponível. Utilize a câmara de indução para anestesiar os animais e administrar o imunoestimulante por via sublingual. Ligar-se imediatamente o animal a um cone do nariz, pelo menos, 15 minutos para mantê-la sob anestesia, para evitar a deglutição e permitir a absorção do composto terapêutico. - Pipetar a solução contendo a solução imunoestimulante ou controlo de veículo; usando o polegar eo dedo indicador da mão não dominante levar o mouse e mantenha-o na posição vertical.
- Usando o lugar da mão dominante de um par de pinças fechadas sob a língua e mantê-lo no lugar usando os dedos médio e anelar, abra a pinça um pouco para levantar a língua.
- Leve a pipeta e administrar a solução no chão do lado da boca e dorsal da língua.
- Remova a pinça e deixar o resto do rato por 3 a 5 minutos antes de colocá-lo de volta na gaiola. Para garantir que seja mantida a normotermia no microfone anestesiadoe, conectar as gaiolas de um sistema de aquecedor gaiola. Se tal sistema não está disponível, lugar ratinhos pertencente ao mesmo grupo de tratamento de volta para o compartimento correspondente ao lado do outro sobre a roupa de cama e cobri-las parcialmente com folhas de papel tecido limpo para ajudá-los a manter a temperatura do corpo.
- Recolha de amostras de tecido em qualquer ponto de tempo após a instilação do agente imunomodulador para analisar as alterações nas populações celulares induzidos pelo tratamento.
NOTA: Neste administração protocolo específico de flagelina foi realizada 2 h antes do desafio. Determine o tempo óptimo entre o tratamento e desafio para cada agente terapêutico particular e patogénio a ser testado.
2: Preparação da suspensão bacteriana e intranasal desafio com Streptococcus pneumoniae
NOTA: S. pneumoniae é um agente patogénico humano natural que pode causar doenças que ameaçam a vida, como pneumonia invasiva, sepsee meningite. A transmissão pode ocorrer quando inalado ou em contato com a mucosa. Portanto, todas as amostras que possam ter estado em contacto com S. pneumoniae devem ser tratados em uma unidade de Biossegurança Nível II apropriado usando uma cabine de segurança biológica classe II. Confira os Procedimentos Operacionais Padrão da sua instituição em matéria de manipulação de patógenos Tipo II para roupas de proteção, eliminação de resíduos e medidas de segurança adicionais que podem ser aplicados. Os animais infectados devem ser mantidos em gaiolas ventiladas individualmente em isoladores equipados com filtros HEPA. Vacinas anti-pneumocócicas e antibioticoterapia estão disponíveis. Para mais informações consulte as referências 27 e 1.
- Descongelar uma alíquota de uma suspensão de estoque de trabalho de Streptococcus pneumoniae do número de UFC de bactérias conhecido preparado conforme descrito em 15.
- Centrifugar durante 5 minutos a 2500 xg e RT.
- Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento bacteriano através da sua suspensão em 1 ml de rsolução salina erile. Utilize pontas com filtro durante a preparação da suspensão bacteriana, diluições ou para o desafio animal.
- Centrifugar novamente como descrito na etapa 2.2.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de soro fisiológico estéril para se obter uma suspensão de 4x10 5 CFU / 50 ul. Esta dose corresponde a uma dose mínima de bactérias S. pneumoniae serotipo 1 E1586 que causa 100% de mortalidade em ratinhos BALB / c de acordo com estudos anteriores 15.
NOTA: Ao estabelecer um modelo de pneumonia pneumocócica em ratos, a dose mínima de bactérias, causando 100% de mortalidade deve ser determinado para cada combinação específica de estirpe bacteriana, sorotipo e mouse tensão. - Homogeneizar a suspensão bacteriana em vortex ou pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
- Carga de 50 ul da suspensão bacteriana utilizando uma ponta de filtro estéril e instilar o volume total nas narinas de um rato anestesiado. Segure o UPRI ratolutar por 2 min e deixe descansar na posição dorsal para mais 2 min. Aplicar vet pomada para os olhos e voltar os animais para a jaula; certifique-se de manter a normotermia sob anestesia.
Nota: Neste estudo de desafio bacteriano foi realizada num volume de 50 ul para garantir a entrega de pelo menos 90% do total de CFU nos pulmões, tal como determinado anteriormente em 15,28. Para minimizar o perigo de volumes mais pequenos do animal (por exemplo, 20 l) podem ser utilizados. No entanto, a entrega eficiente de bactérias para dentro dos pulmões deve ser verificado; isto pode ser feito através da colheita dos pulmões 5 minutos após a provocação e contagem de UFC em homogeneizados dos pulmões através do plaqueamento de diluições em série em placas de ágar-sangue. - Confirmar os números de CFU na suspensão bacteriana utilizada para a infecção por plaqueamento de diluições em série de 10 vezes em placas de agar de sangue. Incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2 e de contagem do número de colónias mucóides apresentando uma característica de halo verde de albactérias pha hemolíticas.
3 Coleção de Tecidos e Preparação de Amostras para Citometria de Fluxo (FACS) Análise
3.1) coleta de tecido
- Eutanásia o animal por deslocamento cervical ou usando uma câmara de CO 2; abrir a cavidade torácica todo o caminho até ao pescoço e fazer uma incisão ao longo das pernas da frente para expor o lado ventral do pescoço e região submandibular.
- Com a ponta de uma pinça fina curvada puxe as glândulas salivares e tecido mole adjacente para expor o lado dorsal do soalho da boca. Usando curvas pinça de ponta fina, leve o mandibular e linfonodos mandibulares acessórios puxando delicadamente e coloque em um tubo contendo RPMI completo (cRPMI, por 500 ml-10% de soro bovino fetal, 5 ml de uma solução contendo 10.000 U / ml solução de penicilina e 10 mg / ml de estreptomicina e 5 mL de L-Glutamina 200 mM) ou solução de conservação de ácido nucleico de acordo com o processo a jusante que vaiser realizada mais tarde.
- Para abrir a cavidade torácica fazer uma incisão na membrana; usando um par de pinças de ratos com dentes prender a cartilagem xifóide do esterno e corte cuidadosamente as costelas em ambos os lados dorsais a partir das costelas falsas por todo o caminho até chegar ao ponto em que os verdadeiros costelas encontram o manúbrio do esterno.
- Ao manter a cartilagem xifóide do esterno com a pinça, puxe delicadamente para expor os órgãos da cavidade torácica.
- Retire as costelas completamente cortando as primeiras costelas e clavícula. O timo aparece como uma estrutura em branco de dois lóbulos localizada na parte ântero do tórax perto da base do coração.
- Tomar um dos lóbulos por aperto com um par de pinças e usar um par de tesouras para remover os ligamentos entre a sua face inferior e o pericárdio. Prossiga para remover o segundo lobo.
- Identificar a cavidade abdominal e abri-lo por corte ao longo do eixo médio do muscular parede para expor os órgãos. Com um par de pinças de cortar a veia cava posterior e na aorta torácica; remover o excesso de sangue com um tecido absorvente.
- Para analisar as populações de células que se infiltram e residentes dos alvéolos realizar lavagem broncoalveolar (BAL). Corte os músculos na parte ventral do pescoço para expor a traqueia eo esófago; para separá-los fazer incisões no lado lateral e dorsal das estruturas.
- Levanta a traqueia com os fórceps e fazer uma pequena incisão com um bisturi para introduzir uma pipeta de ponta fina-cheia com 1 ml de PBS, sem Ca 2 + / Mg 2 + 1 mM mais EDTA. Incutir e aspirar o volume total de pelo menos três vezes; aspirado e transferir a suspensão de células para um tubo esterilizado de 1,5 mL e colocá-lo em gelo.
- Para analisar as populações de células presentes no parênquima pulmonar, primeiro perfundir os pulmões através da injecção de 5 ml de PBS, sem Ca 2 + / Mg 2 + mais EDTA 1 mM para o ventrículo direitodo coração.
NOTA: Isto irá eliminar a maioria das células vermelhas do sangue e células imunológicas presentes nos vasos sanguíneos dos pulmões. Se a perfusão foi realizada corretamente, pulmões cor mudará de cor de rosa para branco. - Isolar o coração dos pulmões por fixação a partir da base do ventrículo esquerdo e delicadamente o corte dos vasos sanguíneos, com uma tesoura para removê-lo completamente. Toma os pulmões perfundidos e colocá-los em cRPMI ou solução conservante de ácido nucleico de acordo com a análise a ser executada a jusante.
- Para a análise de populações de células na mucosa sublingual, isolar a cabeça do animal, e remoção das glândulas salivares e do tecido mole adjacente, se não tiver sido feito no passo 3.2.1.
- Faça uma incisão em cada lado da boca até atingir a articulação da mandíbula e do maxilar inferior separar junto com a língua e assoalho da boca, usando pinos corrigi-lo no quadro de dissecção. Puxe a língua; usando um bisturi fazer uma incisão que o basi da lingueta se encontra com o chão da boca até atingir os terceiros molares para expor a mucosa sublingual.
- Remover completamente a língua; tomar uma biópsia de 0,5 mm e colocá-lo ao lado dos incisivos inferiores. Corte a partir da inserção gengival do tecido sublingual e pressione suavemente até que o assoalho da boca foi cortado completamente.
- Repita mais uma vez agora colocando o soco biópsia perto dos terceiros molares para completar a remoção do tecido sublingual. Colocar em um tubo limpo contendo cRPMI ou conservante ácido nucleico.
3.2) A preparação das amostras para análise FACS.
- Transferir o tecido isolado a partir de cada rato dos pulmões numa placa de 24 poços e mediu-los com um par de tesouras limpas até se obter pequenos pedaços de tecido de cerca de 2 mm. Adicionar 1 ml por poço de meio de digestão que continha 30 mg de colagenase tipo II, 50 mg de ADNase-I em 1 ml de meio RPMI sem FBS. Pipeta cima e para baixo cinco vezes e incubar a37 ° C e 5% de CO 2 durante 40 min.
- Para a análise de populações de células no tecido sublingual, substituir o meio de digestão em 3.2.1 com um contendo 2 unidades de Dispase, 30 mg de colagenase tipo II, 50 mg de ADNase-I em 1 ml de meio RPMI. Incubar o tecido recolhida a partir de um ratinho em 500 mL de meio de digestão de 20 minutos a 37 ° C num agitador orbital a 50 rpm.
- Após a incubação, pipeta-se para baixo e até 10 vezes ou até mais de 30 segundos do tecido foi interrompido. Filtra-se a suspensão de células através de uma célula de 40 um filtro estéril e lava-se com 5 ml de PBS suplementado com EDTA 5 mM.
NOTA: a digestão completa da matriz extracelular e tecido fibroso não será conseguido. No entanto, os tempos de incubação mais longos na presença de colagenase e / ou dispase ou trituração agressivo não são recomendadas, uma vez que irá resultar em aumento da morte celular ea destruição de proteínas extracelulares que afetam o resultado global do FACS. - Centrifuga-se a 400 x g, 5 min, 4 ° C.
- Para a análise de populações de células em BAL, centrifugar as células a 400 xg, 5 min, a 4 ° C e continuar para o passo 3.2.4.
- Para a análise de populações de células dos nodos linfáticos, colocar um filtro de 70 um da célula numa placa de Petri estéril e colocar os gânglios linfáticos em conjunto com 1 ml de cRPMI no passador. Retire a queda de um 2 ml seringa estéril e usá-lo como um pilão para esmagar os gânglios linfáticos contra malha do coador. Lavar o filtro de células com 1 ml de cRPMI fresco e transferir as células a partir da placa de Petri para um tubo estéril.
- Tomar uma aliquota de cada amostra representativa e corar com azul de tripano para determinar o número de células viáveis.
- Ressuspender as células em EDTA por FACS: PBS-EDTA 5 mM, 1% de albumina de soro de bovino para fazer-se uma suspensão de 2x10 7 células / ml e adicionar 50 ul num tubo de citómetro.
- Prepara-se uma mistura contendo o anticorpo 2X aproxopriate combinações de anticorpos contra marcadores de superfície e de acordo com fluorocromos para o instrumento FACS disponível. Adicionam-se 50 ul da mistura de anticorpo 2X dentro de cada tubo contendo a suspensão de células.
NOTA: Titular cada anticorpo marcado com fluorocromo para determinar a quantidade ideal a ser utilizada, para um protocolo detalhado ver referência 29. - Incubar 30 minutos em gelo no escuro.
- Lavar uma vez com 3 ml de FACS-EDTA e girar as células por centrifugação a 400 xg durante 5 min a 4 ° C, ressuspender as células em 200 ul do mesmo tampão e analisar num citómetro de fluxo.
NOTA: Se uma manipulação de grande número de amostras, o protocolo de coloração para análise FACS descrito acima pode ser realizado em placas de 96 poços de fundo em U em vez de tubos de citómetro. No entanto, se utilizar de 96 poços passos placas de lavagem deve ser realizada adicionando-se a 200 ul de FACS-EDTA e repetindo-lo 4 vezes centrifugando as células a 400 xg por 5 min a 4 ° C entre cada washipasso ng. - Neste ponto, fixar as amostras para análise no citómetro de fluxo posterior (até 72h após a fixação).
- Para fixar as células, após marcação com os anticorpos de FACS-lavar as células em PBS sem Ca 2 + / Mg 2 +, EDTA a 1 mM sem FBS. Suspender as células em 50 mL do mesmo tampão e adicionar 50 ul de uma solução de paraformaldeído a 4% recentemente preparada em hipertónico (2X) PBS sem Ca 2 + / Mg 2 +.
- Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente e lava-se 3 vezes em FACS-EDTA.
- Ressuspender as células em 200 ul de FACS-EDTA e armazenar a 4 ° C e protegida da luz durante até 72 h.
NOTA: FSC-SSC pode ser afetada pela fixação. Se fixa as amostras verificar a compatibilidade de anticorpos marcados com fluorescência do fabricante desde corantes em tandem pode ser degradada em presença de agentes fixadores. Se as amostras provenientes de animais infectados fixação é altamente recomendável para assegurar que não há agentes patogénicos viáveis irão estar presentes quando analycanta as amostras na máquina de FACS desde microaerosols podem ser gerados durante a aquisição da amostra.
4. Total Extração de RNA, cDNA Synthesis e PCR em Tempo Real.
4.1) A extração de RNA e síntese de cDNA.
- Homogeneizar o tecido em solução conservante de ácido nucleico escolhida por ruptura mecânica (por exemplo, utilizando um homogeneizador rotor-estator de alta velocidade de agitação do tecido-ruptor e grânulos, etc). Centrifuga-se a 12600 xg durante 15 minutos e 4 ° C para remover os fragmentos de tecido. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo.
- Extrai-se a ARN com o método de escolha, seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: RNA é altamente suscetível à degradação, se não vai ser usado imediatamente após o isolamento, faça alíquotas e armazená-los em tubos RNAse gratuitos a -80 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido. Os tubos devem ser manuseados com luvas em todos os momentos. Depois de descongelar as amostras de umlways mantê-los no gelo. - Medir a absorvância de ácidos nucleicos, a 260 nm, e calcular a concentração em mg / mL.
- Prepare-DNAse I misturar pela adição de (para um exemplo): 7,6 l de água ultrapura, 1 l de 10X DNAse I-tampão, 0,4 ul de DNAse-I (grau de amplificação) da 1 U / mL, e adicionar 8,4 mL de da ADNase I misturar-se a cada amostra contendo 1 mg de RNA total.
- Use RNA a uma concentração de 1 mg / mL e realizar a reacção de retrotranscrição (RT-PCR), através da adição de 1 ul do RNA total como molde. Se as amostras são muito diluído e a concentração é menor do que o esperado, adicionar maiores volumes de ARN total, em vez de água. Não deve exceder 20% do volume final da reacção durante a adição do ARN, especialmente se o protocolo de extracção de ARN de escolha envolvido mistura fenol-clorofórmio desde vestígios de fenol pode afectar o rendimento da RT-PCR.
- Incubar 15 minutos à temperatura ambiente seguido por 10 min a 4 ° C ou ice. (Não exceda o tempo de incubação !!)
- Adicionar 1 mL de EDTA a 25 mM (de grau de biologia molecular) a cada tubo e incubar a 65 ° C durante 10 minutos para inactivar a DNase-I.
- Prepare retrotranscrição (RT) da mistura como se segue (para uma reacção de): 1 ul banco de iniciadores de hexâmero aleatório de 0,2 mg / ml, 1 ul de dNTPs 10 mM, 4 ul de tampão 5X M-MLV-RT, 2 ul de DTT 0,1 M, 1 ml estoque RNAse OUT 40 U / mL, e 1 ul M-MLV retrotranscriptase estoque de 200 U / mL.
- Adicionar 10 uL de mistura de RT-PCR para a ADNase I-tubo de reacção de 10 ul.
- Levar a cabo a reacção de PCR, num termociclador de acordo com o seguinte programa:
1X ciclo: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C - Dilui-se o cDNA de 1: 5 por adição de 80 ul de água ultrapura. Armazenar a -20 ° C.
4.2) PCR em tempo real (qPCR).
- Preparar a mistura de reacção qPCR como se segue (para uma reacção): mistura mestre contendo 5 uL de Taq ADN Polymerase, SYBR corante verde, PCR Buffer, mix de dNTP e MgCl2 (ver 4.2.2); 0,9 ul de uma solução de estoque de 10 mM do iniciador em sentido directo, 0,9 ul de uma solução de estoque de 10 mM do iniciador inverso, 1,2 ul de água ultrapura e 2 ul de molde de ADNc previamente diluído, tal como indicado no passo 4.1.10.
NOTA: concentração de reagentes e ciclismo protocolos utilizados nesta seção foram otimizados para serem realizados especificamente com os reagentes e instrumentos descritos na "Tabela de Materiais e reagentes", outras marcas podem ser usados, mas volumes de reação, concentração de reagentes e ciclismo protocolo pode variar. Verifique as instruções do fabricante antes de realizar RT-qPCR. - Instale o instrumento qPCR da seguinte forma:
1X ciclo: 15 min, 95 ° C
40X ciclos: 15 seg, 95 ° C seguido por 1 min, 60 ° C (neste ponto, adquirem fluorescência).
NOTA: Para a quantificação relativa de ARNm de acordo com o método de 30 Ct um reference gene deve ser selecionado para a normalização dos valores de Ct. Gene de referência de escolha deve ser testado, em condições de ensaio específicas como a sua expressão pode variar; ACTB, GAPDH ou 18S são alguns dos genes normalmente seleccionado como referências. - Configure o valor limiar e analisar os dados.
Representative Results
Imunoterapia sublingual pode ser utilizado com êxito para modular a resposta imune pulmões. Mostramos que uma única dose de flagelina, o agonista TLR5 e NLRC4, pode induzir a regulação positiva significativa do mRNA que codifica a CXCL1 quimiocinas, CCL20 e a citocina IL-6, comparada com os controlos tratados com solução salina. Dobrar a indução de níveis de ARNm de um pico a 8 h após a ITSL e voltar aos níveis basais após 20 horas (Figura 1). No entanto, quando foi realizada a ITSL infecção intranasal antes de 2 horas com S. Pneumoniae, os níveis de mRNA de IL6 CXCL1 e permaneceu significativamente regulada até 24 horas após a ITSL em comparação com animais não tratados (Figura 2).
Análise das populações de células no LBA e no tecido pulmonar por FACS revelou que os animais tratados com FliC por via sublingual havia aumento do número de neutrófilos nas vias respiratórias, mas não no tecido dos pulmões (Figura 3).
Figura 4, com ITSL flagelina promoveu aumento da sobrevivência e protecção contra a pneumonia pneumocócica aguda.
Figura 1: Cinética do perfil da transcrição dos pulmões após imunoterapia sublingual com flagelina. Oito a 10 semanas de idade BALB / c (n = 4) foram tratados com 10 ug de flagelina ou soro fisiológico por via sublingual, sob anestesia. Pulmões foram coletadas em momentos diferentes e colocados em conservante ácido nucleico. Extracção de RNA total foi realizada e o cDNA foi sintetizado. níveis de mRNA foram avaliadas por PCR em tempo real utilizando primers específicos constantes do Table 1 A quantificação relativa foi realizada de acordo com método ΔCt usando níveis ACTB mRNA para a normalização. Os resultados são apresentados como aumento de vezes em comparação com o grupo tratado com solução salina em mediana ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05), calculado de acordo com o teste de Mann-Whitney. Os resultados são representativos de duas experiências independentes.
A Figura 2 o perfil de transcrição 'Pulmões durante pneumonia pneumocócica após imunoterapia sublingual com flagelina. Oito a 10 semanas de idade BALB / c (n = 4 por grupo de controlo e n = 7 por grupo tratado) foi tratado com 10 ug de flagelina ou salina por via sublingual, sob anestesia. 2 horas mais tarde, os ratinhos foram infectados por via intranasal com a dose letal mínima (MLD), provocando 10Mortalidade de 0% de um isolado clínico de S. pneumoniae serotipo 1 E1585, correspondente a 4x10 5 CFU / 50 ul. Os pulmões foram recolhidos 24 horas após o desafio e armazenado em conservante ácido nucleico até a extracção de ARN e a síntese de ADNc foram efectuadas. PCR em tempo real foi realizado (ver a lista de iniciadores na Tabela 1) e quantificação relativa foi realizada de acordo com método ΔCt utilizando os níveis de mRNA para ACTB normalização. Os resultados são apresentados como aumento de vezes em comparação com o grupo tratado com solução salina em mediana ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05), calculado de acordo com o teste de Mann-Whitney.
Figura 3 Análise de polimorfonucleares neutrófilos (PMN) de recrutamento em tecido e vias aéreas nos pulmões após SLIT. Oito a10 semanas de idade BALB / c (n = 4) foram tratados com 10 ug de flagelina ou soro fisiológico por via sublingual, sob anestesia. 2 horas mais tarde, os ratinhos foram desafiados por via intranasal com o MLD de S. pneumoniae sorotipo 1 E1585. 24 horas após o desafio, a BAL foi realizada e os pulmões foram processados por análise de FACS. PMN foram identificadas como células CD11b Ly6G alto / alto / CD11c negativos e com base no perfil FCS-SSC. Os resultados são expressos como percentagem de PMN em relação dos números de células totais na LBA ou pulmões. As barras representam a média ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05), calculados de acordo com one-way teste de Mann-Whitney.
Figura 4. SLIT com flagelina protege ratinhos contra a pneumonia pneumocócica aguda. S. pneumoniae sorotipo 1 E1585. A sobrevida foi avaliada em uma base diária. Curvas de Kaplan-Meier foram comparadas segundo teste log-rank (Mantel-Cox). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p <0,05) .Results são representativos de dois experimentos independentes.
| Nome | Sequência de 5'-3 ' | PCR comprimento do produto (pb) |
| MB-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| MB-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| mIL-6_F | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| mIL-6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
Tabela 1 lista Primer usado para tempo real, análise de PCR. Seqüências de primers específicos utilizados para a análise de qPCR. Adiante e iniciadores para rato ACTB reversa, Cccl20, CXCL1, IL6, TNF e CXCL1 são apresentados como as sequências 5'-3 'e o comprimento do produto esperado é indicado em pares de bases (pb).
Discussion
A administração sublingual de agentes terapêuticos tem sido provado como um meio útil para modular a resposta imunitária no tracto respiratório. A principal vantagem de ITSL para o tratamento de doenças respiratórias é de que não envolve a entrega directa de compostos para os pulmões ou nariz, sendo mais seguro do que os tratamentos baseados em administração intranasal 31.
Imunoterapia sublingual pode ser utilizado para modular a resposta imunitária de diferentes maneiras, quer para a indução de respostas de regulação que pode melhorar os sintomas da inflamação alérgica e asma 32 ou para induzir a activação transiente de mecanismos da imunidade inata para o tratamento de infecções pulmonares agudas, como mostrado aqui.
O modelo de rato apresentadas nesta vídeo é um método conveniente para o rastreio de compostos, como agentes terapêuticos para a ITSL.
Este modelo animal oferece um meio útil para determinar o impactode corte na resposta imune dos pulmões, bem como noutros órgãos (por exemplo,. nódulos linfáticos drenantes ou mucosas distais) que não podem ser imitados pela utilização de modelos in vitro. Apesar de existirem vários trabalhos que descrevem os resultados obtidos com a imunoterapia sublingual, métodos de aplicação dos procedimentos de administração sublingual não foram disponibilizados ainda. Além disso, o modelo pode ser utilizado para a avaliação de vacinas sublinguais destinadas a conferir protecção sistémica, bem como local no trato respiratório.
Como mostrado no vídeo acompanhante, administração sublingual de compostos é um processo simples que pode ser facilmente realizada sem a necessidade de formação extensiva. Tipicamente, uma pessoa competente na manipulação dos animais requer 1 hora para efectuar a ITSL num grupo de 10 ratinhos usando anestésicos injectáveis, tal como descrito no presente protocolo. Se desafio pneumocócica é realizada, bem como, 90 minutos adicionais serão necessários para preparara suspensão bacteriana e executar intranasal desafio dos animais.
Os protocolos FACS aqui apresentados permitem a caracterização conveniente de impacto da SLIT no site local de administração, os linfonodos de drenagem, bem como seus efeitos sobre a dinâmica das células dos pulmões.
A análise separada do parênquima pulmonar e conteúdo broncoalveolar é importante para discriminar residente imune as vias aéreas e se infiltrar tipos de células a partir de aqueles que permanecem dentro do tecido. A análise do conteúdo BAL permite o estudo da rotatividade dos macrófagos alveolares bem como a dinâmica do recrutamento de células para os espaços alveolares induzidas por diferentes tratamentos, por exemplo,. PMN, eosinófilos, monócitos. BAL também pode ser usado para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas secretadas por Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ou de detecção de anticorpos IgA segregados induzidos após a vacinação sublingual. Estudo de tecido dos pulmõesvai permitir a caracterização de outros tipos de células, as células dendríticas, classicamente, células T e células B.
Preparação de amostras de BAL e nódulos linfáticos para análise FACS é simples. Após a coleta da amostra, normalmente 60 minutos são necessários para completar o protocolo de coloração por 10-20 amostras. Em contraste, o isolamento de células a partir de tecido dos pulmões ou sublingual estarão requerem mais tempo que é necessária a digestão da matriz extracelular. Absorção do agente terapêutico entregues por via sublingual pode ser abordada por rastreamento de moléculas fluorescente ou marcadas radioactivamente usando em sistemas de imagem vivo.
Imunoterapia sublingual é um método atraente para induzir eficazmente respostas imunes no tracto respiratório, bem como sistemicamente que pode ser usado para tratar ou prevenir doenças respiratórias. A elucidação dos mecanismos que determinam a activação vs tolerância da resposta imunitária no tracto respiratório após a ITSL ié essencial para permitir que o desenho racional de novas estratégias terapêuticas que podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com tratamentos disponíveis contra diferentes condições respiratórias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
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