Protocol
우루과이 - 동물과 관련된 절차는 동물 실험에 대한 명예위원회와 의학의 학교, 대학교 드 라 리 퍼블 리카의 지침위원회의 승인을 071140-000821-12와 08,052,010 ° 프로토콜 N에 따라 수행 하였다.
치료제의 1 설하 관리
- 치료제를 함유하는 용액을 제조 테스트 할. 마우스 당 10 μL의 최대 볼륨을 administrate하기 위해 농도를 조정합니다.
참고 : 살모넬라 엔테의 혈청 형에서 정제 편모를 들어 S의 첫번째 치사량에 감염된 마우스에서 보호를 유도 할 수있는 최적의 복용량을 티피 뮤 리움 폐렴 구균 혈청 형 1 E1586은 100 % 사망 원인은 10 μg / 마우스이다. 편모 솔루션은 단량체의 방출을 보장하기 위해 5 분 동안 65 ° C로 가열해야합니다. 편모 정화에 대한 자세한 내용은 참조 26를 참조하십시오.- 바르그것의 분자 크기, 순도, 단백질 분해에 대한 감수성과 점막 부착 제의 사용에 따른 다른 면역 에이전트 Y 유효 농도. 각 화합물의 효과를 극대화하기 위해 테스트 할 최적의 농도를 조정합니다. 비내 경로에 의한 이전의 연구는 특정 화합물에 대해 실시 된 경우, 설하 경로에 의해 그것의 효능을 테스트하기 위해 초기 투여 량을 5 ~ 10 배 이상을 사용한다.
- 5.5 ㎎ / ㎏ Xylacine과 110 밀리그램 / kg 케타민을 포함하는 칵테일을 주입하여 쥐를 마취시키다과 동물이 7-10 분 동안 휴식 할 수 있습니다.
- 부드럽게 뒷다리의 발바닥 중 하나를 누름으로써 적절한 진통제 확인; 경우 제대로 동물이 자극에 대한 응답으로 이동하지 않습니다 마취.
- 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 각 마우스의 눈을 통해 수의사 연고의 얇은 층을 확산.
주 : 시스템이 장착하면 이소 플루오 란 등의 흡입 성 마취제가 대신 케타민 / Xylacine 사용할 수 있습니다유도 챔버와 코 콘 치우는 사용할 수 있습니다. 동물을 anaesthetise 및 설하 노선 별 면역 자극제를 administrate하는 유도 챔버를 사용합니다. 즉시 삼키는 피하고 치료 화합물의 흡수를 허용하는 마취를 유지하는 적어도 15 분 동안 노즈콘에 동물을 연결한다. - 면역 자극제 또는 차량 제어 용액을 포함하는 용액을 피펫; 엄지 손가락과 도미넌트가 아닌 손의 검지를 사용하여 마우스를 가지고 수직 위치에 고정.
- 약간 집게를 열고, 혀 아래에 지배적 인 손 놓고 닫힌 집게 한 쌍을 사용하여 중간 및 링 손가락을 사용하여 제자리에 고정하면 혀를 들어 올립니다.
- 피펫을 가지고 혀의 입과 지느러미 쪽의 바닥으로 솔루션을 관리 할 수 있습니다.
- 집게를 제거하고 케이지에 다시 착용하기 전에 3 분에서 5 분 정도의 마우스 나머지를 할 수 있습니다. 보장하기 위해 그 정상 체온은 마취 마이크에 유지전자, 케이지 히터 시스템에 케이지를 연결합니다. 이러한 시스템을 사용할 수없는 경우, 대신 마우스는 침대 위에 서로 옆에 대응 케이지 하나에 다시 동일 처리 군에 속하는 부분들이 체온을 유지하기 위해 클린 티슈 시트로 커버.
- 처리에 의해 유도 된 세포 집단의 변화를 분석하기 위해 면역 화제의 점안 후 어느 시점에서 조직 샘플을 수집한다.
참고 : 편모이 특정 프로토콜 관리에 도전하기 전에 2 시간을 실시 하였다. 치료 및 과제 각각의 특정 치료제 및 병원체 사이의 최적의 시간을 결정 테스트 할 수 있습니다.
폐렴 구균과 함께 2 세균 서스펜션의 준비 및 비강 도전
참고 : S. 폐렴 구균은 침습성 폐렴, 패혈증과 같은 생명을 위협하는 질병을 일으킬 수있는 자연적인 인간의 병원균이다뇌막염. 흡입 또는 점막과 접촉 할 때 변속기가 발생할 수 있습니다. 따라서, S. 접촉되었을 수도 있습니다 모든 샘플 폐렴은 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하여 적절한 생물학적 안전 레벨 II 시설에서 처리해야합니다. 보호 복, 폐기물 처리 및 적용 할 수있는 추가 보안 조치에 대한 유형 II 병원체의 취급에 관한 교육 기관의 표준 운영 절차를 확인합니다. 감염된 동물은 HEPA 필터가 장착 절연체에 개별적으로 환기 케이지에 보관해야합니다. 안티 폐렴 구균 백신과 항생제 치료를 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 참고 문헌 (27)와 1을 참조하십시오.
- 15에서 제조 알려진 세균 CFU 수의 폐렴 구균의 작업입니다 현탁액의 나누어지는 해동.
- 2500 XG 및 실온에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 상층 액을 버리고 성 1 ㎖에 현탁하여 세균 펠렛을 씻어erile 식염수. 세균 현탁액, 희석 또는 동물의 도전을 준비 할 때 필터 팁을 사용합니다.
- 다시 같은 단계 2.2에서 설명한 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 4 × 5 CFU / 50 μL의 현탁액을 얻기 위해 멸균 생리 식염수를 해당 볼륨에 펠렛을 재현 탁. 이 투여 량은 S. 최소 도즈 세균에 상당 폐렴 구균 혈청 형 이전의 연구 (15)에 따라 BALB / c 마우스에 100 % 사망 원인 1 E1586.
주 : 생쥐의 폐렴 구균 성 폐렴의 모델을 구축 할 때, 최소 용량은 세균 사망률 100 % 균주, 및 마우스 혈청 형 균주의 각 특정 조합에 대해 결정되어야 일으키는. - 텍싱 또는 아래로 5 회를 피펫 팅에 의해 세균 현탁액을 균질화.
- 로드 살균 필터 팁을 사용하여 세균 현탁액 50 μL 및 마취 마우스의 콧 구멍에 전체 볼륨을 주입. 마우스 upri을 잡고2 분 GHT하고이 더 많은 분 지느러미 위치 쉬십시오. 눈에 수의사 연고를 적용하고 케이지에 동물을 반환; 마취 동안 정상 체온을 유지해야합니다.
참고 : 본 연구에서 박테리아 도전 15,28 이전에 결정된 폐로 전체 CFU의 적어도 90 %의 전달을 보장하기 위해 50 ㎕의 부피에서 수행 하였다. 사용할 수있는 동물의 작은 양 (예를 들면, 20 μL)의 고통을 최소화. 그러나 폐에 세균을 효율적으로 전달 확인해야합니다; 이것은 공격 후 폐 5 분 수확과 혈액 한천 플레이트에 시리얼 희석 도금 폐 '균질 CFU를 계산하여 수행 할 수 있습니다. - 혈액 아가 플레이트 상에 직렬로 10 배 희석 도금에 의한 감염에 사용 된 세균 현탁액에 CFU의 수를 확인한다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 O / N을 품어과 알의 녹색 후광 특성을 제시 점액 식민지의 수를 계산PHA의 용혈성 세균.
3 조직 수집 및 유동 세포 계측법 (FACS) 분석을위한 시료 전처리
3.1) 조직 컬렉션
- 경추 탈구 또는 CO 2 챔버를 사용하여 동물을 안락사; 목까지 흉강 모든 길을 열어 목과 턱밑 영역의 복부 측면을 노출 앞 다리를 따라 절개를합니다.
- 미세 팁 곡선 집게로 조심스럽게 입 바닥의 등 쪽을 노출 침샘 인접 연부 조직을 잡아 당깁니다. 500 ml- 10 % 태아 소 혈청, 10,000 U / ㎖을 함유 한 용액 5 ㎖를 들어, 부드럽게 잡아 당겨 하악 및 액세서리 하악 림프절을 완전 RPMI (cRPMI를 포함하는 튜브에 배치 곡선 얇은 팁 집게를 사용하여 그 것 하류 절차에 따라 페니실린 및 10 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 용액 5 ㎖ L-글루타민 200 밀리미터) 또는 핵산 보존액나중에 수행 될 수있다.
- 흉강은 다이어프램의 절개를 열려면; 쥐 이빨 집게 한 쌍의 신중 흉골의 xyphoid 연골을 고정하고 사용하는 것은 진정한 갈비 흉골의 흉골 병을 만나는 지점에 도달 할 때까지 줄곧 거짓 갈비뼈에서 시작하여 양쪽 지느러미 측면에서 갈비뼈를 잘라.
- 집게로 흉골의 xyphoid 연골을 들고으로 흉강의 장기 노출 부드럽게 잡아 당깁니다.
- 완전히 첫째 갈비뼈와 쇄골을 절단하여 갈비뼈를 제거합니다. 흉선은 심장의베이스에 흉부 주변의 anteroventral 부분에있는 두 개의 엽 (叶)의 흰색 구조로 표시됩니다.
- 한 쌍의 집게로 클램핑함으로써 로브 중 하나를 수행하고 그것의 하부면과 심낭 사이 인대를 제거하기 위해 가위를 사용한다. 두 번째 엽을 제거하기 위해 진행합니다.
- 복강를 확인하고 m의 중간 축을 따라 절단하여 열uscular 벽 장기를 노출합니다. 포셉 한 쌍의 후방 대정맥과 대동맥을 잘라; 흡수 조직과 혈액의 과잉을 제거합니다.
- 폐포의 거주자 침투 세포 인구가 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 수행 분석합니다. 기도와 식도를 노출 목의 복부 부분에 근육을 잘라; 그들 구조의 측면과 등쪽 측면에 절개을 분리합니다.
- 집게로기도를 들어 올려 칼슘 / 마그네슘 2 + 플러스 1 mM의 EDTA없이 PBS 1 ㎖ 가득 얇은 팁 전송 피펫을 소개 메스 작은 절개를합니다. 방울 씩과 총 부피에게 세 번 이상 대기음; 흡은 멸균 1.5 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 얼음에 배치하고.
- 제 우심실로 칼슘 / 마그네슘 플러스 2 + 1 mM의 EDTA없이 PBS 5 ㎖를 주입하여 폐를 관류, 폐 실질에 존재하는 세포 집단을 분석하는마음의.
NOTE :이 폐 '혈관에 존재 적혈구 및 면역 세포의 대부분을 제거 할 것이다. 관류가 올바르게 수행 된 경우, 폐의 색은 흰색에 분홍색에서 이동합니다. - 좌심실의 기지에서 클램핑에 의해 폐에서 심장을 분리하고 섬세 완전히 제거하기 위해 가위로 혈관을 잘라. cRPMI 또는 다운 스트림 분석에 따라 핵산 보존액에서 그들을 관류 폐를 가지고 배치하는 수행합니다.
- 설하 점막 세포 집단의 분석을 위해, 동물의 머리를 분리하고, 단계 3.2.1의 수행하지 않은 경우 침샘 및 인접 연조직을 제거한다.
- 하악 관절에 도달 할 때까지 입의 양쪽에 절개를하고 핀이 해부 보드에 문제를 해결하여, 입의 혀 바닥과 함께 하부 턱을 분리합니다. 혀를 당겨; 메스를 사용하여 절개를 위치를 바혀의 자체는 설하 점막을 노출 세 번째 어금니에 도달 할 때까지 입의 바닥을 준수합니다.
- 완전히 혀를 제거; 0.5 mm 생검 펀치를 타고 아래 앞니 옆에 놓습니다. 부드럽게 입의 바닥까지 설하 조직과 언론의 치은 삽입에서 잘라내는 완전히 잘라왔다.
- 이제 혀 밑 조직의 제거를 완료 셋째 어금니에 가까운 생검 펀치를 배치 한 번 더 반복합니다. cRPMI 또는 핵산 방부제가 포함 된 깨끗한 튜브에 배치합니다.
FACS 분석을위한 3.2) 샘플 준비.
- 24 웰 플레이트에 각 마우스에서 분리 된 폐 '조직을 전송하고 약 2mm의 조직의 작은 조각을 획득 할 때까지 위의 깨끗한 쌍을 말하다. 유형 II 콜라게나의 30 ㎎, FBS가없는 RPMI 1 ㎖에 50 μg의 DNase-I를 포함하는 소화 매체의 잘 당 1 ML을 추가합니다. 최대 피펫 아래로 5 배 부화37 ° C와 5 %의 40 분에 대한 CO 2.
- 설하 조직의 세포 집단의 분석을 위해, 디스 파제의 2 단위, RPMI 1 ㎖에 30 mg의 유형 II 콜라게나, 50 μg의 DNase-I를 포함하는 하나 3.2.1 소화 매체를 대체합니다. 50 rpm에서 진탕 기에서 37 ° C에서 20 분 동안 소화 매체의 500 μL에 한 마우스에서 수집 된 조직을 품어.
- 배양, 피펫까지 후와 조직의 대부분이 중단 된 10 회 또는 30 초까지 때까지. 40 μm의 살균 셀 스트레이너 비록 세포 현탁액을 필터와 PBS의 5 ㎖를 5 mM의 EDTA를 첨가 씻어.
참고 : 세포 외 기질 (extracellular matrix)과 섬유 조직의 완전한 소화를 얻을 수 없습니다. 이 증가 된 세포의 죽음과 F의 전체 결과에 영향을 미치는 세포 외 단백질의 파괴의 원인이되므로 그러나, 콜라게나 제 및 / 또는 디스 파제 또는 공격적인 분쇄의 존재 이상 배양 시간은 사용하지 않는 것이 좋습니다ACS 분석. - 400 XG, 5 분, 4 ° C에서 원심 분리기.
- BAL의 세포 집단의 분석을 위해, 4 ° C에서 400 XG, 5 분에서 세포를 원심 분리 및 3.2.4 단계로 진행합니다.
- 림프절 세포 집단의 분석을 위해, 멸균 페트리 접시에 70 μm의 셀 스트레이너를 배치하고 스트레이너에 cRPMI의 1 ml의 림프 함께 노드했습니다. 2 ㎖의 멸균 주사기의 돌입을 꺼내 스트레이너의 메쉬에 대한 림프절 호감 갈리고로 사용합니다. 신선한 cRPMI 1 ㎖와 셀 스트레이너를 씻어 멸균 튜브에 페트리 접시에서 세포를 전송합니다.
- 각 샘플의 대표 나누어를 타고 생존 세포 수를 결정하는 트리 판 블루로 염색.
- ML 2 × 7 세포 /의 현탁액을하고 사이토 튜브에 50 μl를 추가 PBS-5 mM의 EDTA-1 % 소 혈청 Albumin- : FACS-EDTA의 세포를 재현 탁.
- APPR을 포함하는 2 배의 항체 믹스를 준비합니다가능한 FACS 악기에 따른 표면 마커 및 형광 시료에 대한 항체의 조합 opriate. 세포 현탁액을 포함하는 각 튜브에 2X 항체 믹스 50 μl를 추가합니다.
NOTE : 최적 량을 결정하기 위해 각각의 형광 색소 표지 된 항체를 적정 기준은 29 참조 상세한 프로토콜이 사용될 수있다. - 어둠 속에서 얼음에 30 분을 품어.
- FACS-EDTA의 3 ㎖로 한 번 세탁하고 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 세포를 스핀 다운, 같은 버퍼 200 μL의 세포를 재현 탁하고 흐름 사이토에서 분석 할 수 있습니다.
NOTE : 샘플의 큰 수를 처리하는 경우, 상술 한 FACS 분석을 위해 염색 프로토콜 대신 사이토 관의 U-바닥 96 - 웰 플레이트에서 수행 될 수있다. 그러나, 96 웰 플레이트의 세척 단계를 사용하는 경우 각 와시 사이에 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 세포를 아래로 회전이 4 번 FACS-EDTA의 최대 200 μl를 추가하고 반복하여 수행해야합니다NG 단계를 포함한다. - 이 시점에서 사이토 미터 이상 (정착 후의 72H까지) 흐름 분석을위한 샘플을 고정한다.
- 세포를 해결하려면, FACS-항체로 표지 한 후 PBS없이 칼슘 + / Mg를 2 +, FBS가없는 1 mM의 EDTA로 세포를 씻어. 더 칼슘 + / mg의 2 + 같은 버퍼의 50 μL에서 세포를 일시 중단하지 않고 고장 성 (2X) PBS에서 새로 제조 4 % 파라 포름 알데히드 용액 50 μl를 추가합니다.
- 실온에서 20 분 동안 품어 FACS-EDTA에 세 번 씻는다.
- 4 ° C에서 200 FACS-EDTA의 μL 및 저장소에있는 세포를 재현 탁 최대 72 시간 동안 빛으로부터 보호.
참고 : FSC-SSC는 고정에 의해 영향을받을 수있다. 탠덤 염료가 정착 에이전트의 존재 저하 될 수 있기 때문에 고정하는 경우 샘플은 제조 업체 형광 표지 항체의 호환성을 확인합니다. 샘플은 감염된 동물에서 유래하는 경우 고정이 높은 경우 analy 더 가능한 병원균이 존재할 수 없다는 것을 확인하는 것이 좋습니다microaerosols 샘플의 취득시에 발생 될 수 있기 때문에 FACS 시스템에 샘플을 노래.
(4) 총 RNA 추출, cDNA를 합성 및 실시간 PCR.
4.1) RNA 추출 및 cDNA 합성.
- 기계적 파괴에 의한 선택의 핵산 보존액에 조직을 균질화 (예를 들어, 회 전자 - 고정자 균질화기를 사용하여 조직 ruptor 비즈 등을 흔들면서 고속). 15 분, 4 °의 C에 대한 12,600 XG에 원심 분리기 조직 파편을 제거합니다. 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 선택의 방법으로 RNA를 추출합니다.
참고 :이 분주을하고 -80 ° C에서 RNAse가없는 튜브에 보관 바로 분리 후 사용하지 않을 경우 RNA가 분해에 매우 민감하다. 반복되는 동결 융해을 피하십시오. 튜브는 항상 장갑을 취급해야합니다. 샘플을 해동 후법이지 얼음에 보관하십시오. - 260 nm에서 핵산의 흡광도를 측정하고 μg / μL의 농도를 계산한다.
- DNase의이-I이 첨가하여 혼합 준비 (한 샘플에 대한) : 초순수의 7.6 μL, 10 배의 DNase-I 버퍼의 1 μL, 0.4의 DNase-I (증폭 등급) 재고 1 U / μL의 μL, 그리고 8.4 μl를 추가 DNase의는-I는 총 RNA 1 μg 포함 된 각각의 샘플에 섞는다.
- 1 μg / μl의 농도로 사용하여 RNA를 주형으로 전체 RNA 1 μl를 첨가하여 retrotranscription 반응 (RT-PCR)을 수행. 샘플이 너무 희석하고 농도가 예상보다 낮은 경우, 총 RNA 대신 물의 큰 볼륨을 추가. 페놀 흔적은 RT-PCR의 수율에 영향을 줄 수 있기 때문에 선택의 RNA 추출 프로토콜을 페놀 - 클로로포름 혼합물을 포함 특수 경우에 RNA를 추가 할 때 최종 반응 부피의 20 %를 초과하지 않는다.
- 4 ° C 또는 I에서 10 분 뒤에 RT에서 15 분을 품어CE. (배양 시간을 초과하지 마십시오!)
- 각 튜브에 EDTA 25 mM의 (분자 생물학 등급)의 1 μl를 추가하고 DNase를-I을 비활성화하기 위해 10 분 동안 65 ° C에서 배양한다.
- (한 반응)은 다음과 같이 retrotranscription (RT) 믹스를 준비 : 1 μL 랜덤 헥사 머 프라이머 재고 0.2 ㎎ / ㎖, 1 μL의 dNTPs를 재고 10 밀리미터, 4 ㎕의 5 배 M-MLV-RT 버퍼, 2 μL DTT 0.1 M, 1 μL RNAse가 OUT 재고 40 U / μL, 1 μL M-MLV 주식 200 U / μl를 retrotranscriptase.
- RT-PCR은 10 ㎕의 10 μL의 DNase-I 반응 관에 추가 혼합.
- 다음 프로그램에 따른 열 순환기에서 PCR 반응을 수행 :
1X주기 : 10 분, 25 ° C; 50 분, 37 ° C; 15 분, 70 ° C - 초순수 80 μL를 첨가하여 5 : 1의 cDNA를 희석. -20 ° C에서 보관하십시오.
4.2) 실시간 PCR (qPCR에).
- P의 Taq DNA를 함유하는 5 ㎕의 마스터 믹스 (반응 1)은 다음과 같이 qPCR의 반응 혼합물을 준비olymerase, SYBR 그린 염료, PCR 완충액의 dNTP 믹스 및 MgCl2를 (아래 4.2.2 참조); 단계 4.1.10에 나타낸 바와 같이, 순방향 프라이머 10 μM 원액 0.9 μL, 역방향 프라이머의 10 μM 원액, 1.2 μL의 초순수 0.9 μL, 및 cDNA를 템플릿 2 μL 이전 희석.
참고 :이 섹션에서 사용되는 시약 농도와 자전거 프로토콜은 "재료 및 시약의 표"에 설명 된 시약 및기구를 구체적으로 수행 할 수 있도록 최적화 된 다른 브랜드는 사용할 수 있지만 반응 볼륨, 시약 농도와 자전거 프로토콜이 다를 수 있습니다. RT-qPCR에를 수행하기 전에 제조업체의 지침을 확인하십시오. - 다음과 같이 qPCR에 악기를 설정합니다 :
1X주기 : 15 분, 95 ° C
40X주기 : 15 초, (이 점 획득 형광에서) 1 분, 60 ° C 다음 95 ° C.
참고 : mRNA의 상대 정량 용 코네티컷 방법 30 referenc에 따라전자 유전자는 코네티컷 값의 정상화를 선택해야합니다. 선택의 참조 유전자가 발현이 다를 수 있으므로 특정 분석 조건에서 테스트되어야한다 ACTB, GAPDH 또는 18S는 일반적으로 참조로 선택된 유전자의 일부입니다. - 임계 값을 설정하고 데이터를 분석한다.
Representative Results
설하 면역 성공적 폐 '면역 반응을 조절하는데 사용될 수있다. 우리는 편모, TLR5 및 NLRC4 작용제의 단일 투여 량은, 케모카인의 CXCL1, CCL20 및 염수 처리 된 대조군과 비교 사이토 카인 IL-6 mRNA의 코딩의 중요한 상향 조절을 유도 할 수 있음을 보여 주었다. mRNA 수준의 유도 SLIT 후 8 시간에서 정점을 접고 20 시간 (그림 1) 이후 기저 수준으로 돌아갑니다. 슬릿 S. 폐렴으로 2 시간 전에 비강 내 감염을 수행 할 때 그러나, Cxcl1 및 IL6의 mRNA 수준은 상당히 비 처리 된 동물 (그림 2)에 비해 SLIT 후에도 24 시간을 상향 조절 남아 있었다.
FACS에 의해 BAL의 세포 집단과 폐 조직의 분석은 설하 경로로 플릭으로 처리 동물이 폐 '조직 (그림 3)에서기도에 호중구의 수를 증가하지만 한 것으로 나타났습니다.
그림 4에 나타낸 바와 같이, 편모와 SLIT 보호를 추진 급성 폐렴 구균 폐렴에 생존을 증가했다.
편모와 설하 면역 요법 후 그림 폐 '전사 프로파일의 1 속도론. 8 ~ 10 주령 BALB / c 마우스는 (N = 4) 마취 설하 경로로 편모 또는 식염수를 10 μg 처리 하였다. 폐는 상이한 시점에서 수집하고, 핵산 방부제에 넣었다. 전체 RNA 추출을 수행하고, cDNA를 합성 하였다. mRNA 수준은 Tabl에 나열된 특정 프라이머를 사용하여 실시간 PCR에 의해 평가 하였다예 1 상대 정량화 정상화 ACTB mRNA 수준을 사용 ΔCT 방법에 따라 수행 하였다. 결과는 SEM ± 중간으로 생리 식염수 투여군에 비해 배 증가로 표시됩니다. 별표는 맨 - 휘트니 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05)를 나타냅니다. 이 결과는 독립적 인 실험의 대표이다.
와 편모. 8 ~ 10 주령 BALB / c 마우스 (N = 4 대조군이고, n = 7 치료 그룹) 설하 면역 요법 후 폐렴 구균 성 폐렴 중 그림 2 폐 '전사 프로파일에 의해 편모 또는 식염수를 10 μg 처리 하였다 마취 설하 경로. 2 시간 후 마우스는 10의 원인이되는 최소 치사량 (MLD)와 비강 내 경로로 감염시켰다S.의 임상 분리의 0 % 사망률 4 × 5 CFU / 50 μL에 해당하는 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 폐는 공격 후 24 시간을 수집하고, RNA 추출 및 cDNA의 합성을 행 하였다까지 핵산 방부제에 저장 하였다. 실시간 PCR을 행했다 (표 1의 프라이머 목록 참조)과 상대적 정량화를위한 표준화 ACTB mRNA 수준을 사용 ΔCT 방법에 따라 수행 하였다. 결과는 SEM ± 중간으로 생리 식염수 투여군에 비해 배 증가로 표시됩니다. 별표는 맨 - 휘트니 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05)를 나타냅니다.
다형 핵 호중구의 그림 3과 분석 (PMN) SLIT 후 폐 '조직과기도의 모집. 여덟에10 주 BALB / c 마우스는 (N = 4) 마취하에 설하 경로에 의해 편모 또는 식염수를 10 μg으로 처리 하였다. 2 시간 후 마우스를 S.의 MLD와 비강 내 경로로 감염시켰다 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 공격 후 24 시간은, BAL을 수행하고 폐 FACS 분석을 위해 처리 하였다. PMN은 Ly6G 고 / CD11b를 고 /의 CD11c 음성 세포로 확인하고 FCS-SSC 프로필을 기반으로 하였다. 결과는 BAL 또는 폐에 총 세포 수의 대한 PMN의 백분율로 표시됩니다. 바 SEM ± 평균을 나타냅니다. 별표는 편도 만 - 휘트니 (Mann-Whitney) 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05)를 나타냅니다.
편모 그림 4 SLIT 급성 폐렴 구균 폐렴에 대한 쥐를 보호합니다. S.의 MLD와 비강 내 경로로 감염시켰다 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 생존은 매일 평가 하였다. 카플란 - 마이어 곡선은 로그인 랭크 (벽난로 - 콕스) 검사에 따라 비교 하였다. 별표는 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05) .Results는이 독립적 인 실험의 대표 나타냅니다.
| 이름 | 서열 5'-3 ' | PCR 제품 길이 (BP) |
| MB-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| MB-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| MIL-6_F | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| MIL-6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
실시간 PCR 분석을 위해 사용되는 표 1 프라이머리스트. qPCR의 분석에 사용되는 특정 프라이머 서열. 앞으로 및 마우스 ACTB에 대한 역방향 프라이머, Cccl20, Cxcl1, IL6, Tnfa 및 Cxcl1는 5'-3 '서열로 표시하고 제품의 기대 길이는 기본 쌍 (BP)에 표시됩니다.
Discussion
치료제의 설하 투여는 호흡 기관의 면역 반응을 조절하는 유용한 수단으로 입증되었습니다. 호흡 상태의 치료를위한 SLIT의 주요 장점은 비강 내 투여 (31)에 기초하여 치료보다 안전한 것으로, 폐 또는 콧 구멍으로 화합물의 직접 전달을 포함하지 않는다는 것이다.
설하 면역 요법이 어느 알러지 염증 및 천식 (32)의 증상을 개선하거나, 여기에 도시 된 바와 같이, 급성 폐 감염을 치료하기 위해 선천성 면역 메카니즘의 일시적 활성화를 유도하는 규제 반응의 유도를 위해, 다른 방법으로 면역 반응을 조절하는데 사용될 수있다.
이 비디오에 제시된 마우스 모델은 SLIT 치료제와 같은 다른 화합물의 스크리닝을위한 편리한 방법입니다.
이러한 동물 모델은 영향을 결정하는 유용한 수단을 구비폐 '면역 반응뿐만 아니라 다른 장기 (예., 림프절 또는 원위 점막 사이트 배수) 시험 관내 모델을 사용하여 모방 할 수있는 슬릿. 설하 면역 요법을 사용하여 얻은 결과를 설명하는 여러 논문이 있지만, 설하 투여 절차에 대한 자세한 방법은 아직 제공되지 않았습니다. 또한, 모델은 호흡기 조직에서뿐만 아니라 지역 보호를 부여하는 것을 목표 설하 백신의 평가를 위해 사용될 수있다.
첨부 된 영상에 도시 된 바와 같이, 화합물의 투여는 설하 쉽게 광범위한 훈련의 필요없이 수행 될 수있는 간단한 과정이다. 일반적으로 동물 처리에 능숙 사람은이 프로토콜의 설명에 따라 주 사용 마취제를 사용하여 10 쥐의 그룹에 슬릿을 수행하는 데 1 시간이 필요합니다. 폐렴 구균은 도전뿐만 수행되면, 추가로 90 분을 준비해야한다박테리아 서스펜션과 동물의 비강 도전을 수행합니다.
여기에 제시된 FACS 프로토콜은 폐 '세포 역학 림프절뿐만 아니라 효과를 배출, 관리의 로컬 사이트에서 SLIT의 영향을 편리하게 특성화 할 수 있습니다.
기관지 내용과 폐 실질의 별도의 분석은기도 면역 거주자 및 조직 내에서 남아있는 것과 종류의 세포 침투를 구별하는 것이 중요합니다. BAL 내용의 분석은 폐포 대 식세포 매출의 연구뿐만 아니라 다른 치료에 의해 유도 된 폐포 공간, 예를 들면., 백혈구, 호산구, 단핵구 세포에 모집의 역학을 할 수 있습니다. BAL은 효소 면역 분석법 (ELISA) 또는 설하 백신 후 유도 분비되는 IgA 항체의 검출에 의해 분비되는 사이토 카인 및 케모카인의 존재를 평가하는데 사용될 수있다. 폐 '조직의 연구다른 세포 유형, 고전 수상 세포, T 세포 및 B 세포의 특성화를 허용 할 것이다.
FACS 분석을위한 BAL 샘플 및 림프절의 준비는 간단합니다. 시료 채취 후, 일반적으로 60 분 ~ 20 샘플 염색 프로토콜을 완료하는 데 필요합니다. 세포 외 기질의 분해가 요구되기 때문에 반대로, 설하 또는 폐 조직으로부터 세포의 분리는 더 많은 시간을 필요로 할 것이다. 설하 경로에 의해 전달되는 치료제의 흡수는 생체 내 이미징 시스템에서 사용하는 형광 또는 방사성 표지 된 분자의 추적에 의해 해결 될 수있다.
설하 면역 효과적으로 면역 호흡기 반응뿐만 아니라 치료 또는 호흡 상태를 방지하기 위해 사용될 수있다 전신적을 유도하는 매력적인 방법이다. SLIT 나는 후 호흡기에서 면역 반응의 활성화를 허용 대 결정 메카니즘의 해명다른 조건으로부터 호흡 가능한 치료법으로 단독으로 또는 조합하여 사용될 수있는 새로운 치료 전략의 합리적인 설계를 허용하는 결정적이야.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
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