Protocol
Som deltar i djurförsök har utförts i enlighet med protokoll nr 071140-000821-12 och 08052010 godkänts av heders kommissionen för djurförsöks och direktivet styrelsen vid Institutionen för medicin, Universidad de la República - Uruguay.
1. sublingual administrering av det terapeutiska medlet
- Bered lösningen innehållande det terapeutiska medlet som skall testas. Justera koncentrationen att administrera en maximal volym på 10 l per mus.
OBS: För renad flagellinet från Salmonella enterica serovar Typhimurium den optimala dosen för att framkalla skydd i mus infekterad med den första dödliga dosen av S. pneumoniae serotyp 1 E1586, som ger 100% dödlighet är 10 mikrogram / mus. Flagellin lösning skall upphettas till 65 ° C under 5 min för att säkerställa frisättning av monomererna. Mer information om flagellin rening se referens 26.- Vary effektiv koncentration av olika immunmodulerande medel beroende på dess molekylstorlek, renhet, mottaglighet för proteolys och användningen av mukoadhesiva medel. Justera optimala koncentrationen för varje förening som skall testas för att maximera dess effekter. Om tidigare studier med intranasal väg har genomförts för en särskild förening, använd en startdos 5 till 10 gånger högre för att testa dess effektivitet genom sublinguala vägen.
- Bedöva mössen genom injektion av en cocktail innehållande 110 mg / kg ketamin med 5,5 mg / kg Xylacine och låta djuren vila i 7-10 min.
- Bekräfta korrekt narkos genom att försiktigt trycka på trampdynan på ett av bakbenen; Om Tillräckligt bedövad djuret rör sig inte som svar på stimulans.
- Bred ett tunt lager av veterinär salva över ögonen på varje mus för att förhindra torrhet under narkos.
NOTERA: inhalatorisk anestetika såsom isofluoran kan också användas i stället Ketamin / Xylacine om ett system utrustaped med induktionskammare och noskoner finns. Använd induktionskammare för att söva djuren och administrera immunostimulant av sublinguala vägen. Omedelbart ansluta djuret till en noskon under åtminstone 15 min för att hålla den under anestesi för att undvika att svälja och tillåta absorption av den terapeutiska föreningen. - Pipet lösningen innehållande immunstimulerande eller fordonskontroll lösning; hjälp av tummen och pekfingret av den icke-dominanta handen ta musen och hålla den i vertikalt läge.
- Använda den dominerande handen platsen ett par slutna pincett under tungan och hålla den på plats med hjälp av de mellersta och ringfinger, öppna tången något för att lyfta tunga.
- Ta pipetten och administrera lösningen på golvet i munnen och dorsala sidan av tungan.
- Ta pincetten och låt musen vila i 3 till 5 minuter innan det sätts tillbaka in i buren. För att säkerställa att normotermi bibehålls i den sövda mice, anslut burarna till en bur värmesystem. Om ett sådant system inte finns, placera möss som tillhör samma behandlingsgruppen tillbaka till motsvarande buren en bredvid varandra över sängkläder och delvis täcka dem med rena mjukpappers ark för att hjälpa dem att hålla kroppstemperaturen.
- Samla vävnadsprover som helst punkt efter instillation av den immunmodulerande medel för att analysera förändringar i cellpopulationer som inducerats av behandling.
OBS: I denna särskilda protokoll administration av flagellin utfördes 2 h före utmaning. Bestäm optimala tiden mellan behandling och utmaning för varje särskilt terapeutiskt medel och patogenen som skall testas.
2 Beredning av bakteriesuspensionen och Intranasalt Challenge med Streptococcus pneumoniae
OBS: S. pneumoniae är en naturlig mänsklig patogen som kan orsaka livshotande sjukdomar som invasiv lunginflammation, sepsisoch meningit. Överföring kan ske vid inandning eller i kontakt med slemhinnan. Därför är alla prover som kan ha varit i kontakt med S. pneumoniae måste hanteras på ett lämpligt Biosecurity nivå II anläggning med hjälp av en klass II biosäkerhet skåp. Kontrollera standardrutinerna för din institution vid hanteringen av typ II patogener för skyddskläder, avfallshantering och extra skyddsåtgärder som kan tillkomma. Infekterade djur ska hållas i individuellt ventilerade burar i isolatorer utrustade med HEPA-filter. Anti pneumokocker och antibiotikabehandling finns tillgängliga. För mer information se referenserna 27 och 1.
- Tina en alikvot av en arbetande lager suspension av Streptococcus pneumoniae av kända bakteriella CFU antal framställd såsom beskrivs i 15.
- Centrifugera i 5 minuter vid 2500 xg och RT.
- Kasta bort supernatanten och tvätta den bakteriella pelleten genom att suspendera det i en ml sterile saltlösning. Använd filterspetsar när de förbereder bakteriella fjädring, utspädningar eller för djur utmaning.
- Centrifugera igen enligt beskrivningen i steg 2.2.
- Kasta bort supernatanten och suspendera pelleten i lämplig volym av steril koksaltlösning för att erhålla en suspension av 4x10 5 CFU / 50 ^. Denna dos motsvarar minimibakterie dos av S. pneumoniae serotyp 1 E1586 som orsakar 100% dödlighet i BALB / c-möss enligt tidigare studier 15.
OBS: Vid fastställande av en modell av pneumokockpneumoni i möss, den minsta bakterie dos som ger 100% dödlighet måste bestämmas för varje särskild kombination av bakteriestam, serotyp och mus-stam. - Homogeni bakteriesuspensionen genom virvelbildning eller pipettera upp och ned 5 gånger.
- Belastning 50 ul av bakteriesuspensionen med användning av en steril filterspetsen och ingjuta den totala volymen i näsborrarna hos en bedövad mus. Håll musen upright i 2 min och låt den vila i ryggläge för ytterligare 2 min. Applicera veterinär salva på ögonen och åter djuren till buren; se till att upprätthålla normotermi under anestesi.
OBS: I denna studie bakteriell utmaning utfördes i en volym på 50 l för att säkerställa leverans av minst 90% av den totala CFU i lungorna som tidigare fastställts i 15,28. För att minimera lidande av djurets mindre volymer (t ex 20 ^) kan användas. Dock måste effektiv leverans av bakterier i lungorna kontrolleras; detta kan göras genom att skörda lungorna 5 min efter utmaning och räkna CFU i lungorna "homogen genom plätering seriespäd på blod-agarplattor. - Bekräfta CFU nummer i bakteriesuspensionen användes för infektion genom plätering seriella 10-faldiga spädningar på blodagarplattor. Inkubera O / N vid 37 ° C med 5% CO2 och räkna antalet mukoida kolonier presentera en grön gloria karakteristisk för alpha hemolytiska bakterier.
3 Tissue Insamling och Provberedning för flödescytometri (FACS) Analys
3,1) Tissue insamling
- Euthanize djuret genom halsdislokation eller med hjälp av en CO2-kammare; öppna brösthålan hela vägen upp till halsen och gör ett snitt längs frambenen för att exponera den ventrala sidan av halsen och submandibular område.
- Med de fina spets böjd pincett försiktigt dra upp spottkörtlarna och angränsande mjuk vävnad för att exponera ryggsidan av munnen golvet. Med hjälp av böjda tunn spets pincett, ta mandibular och tillbehör Mandibulära lymfkörtlar genom att dra upp försiktigt och placera dem i ett rör innehållande komplett RPMI (cRPMI, för 500 ml- 10% fetalt bovint serum, 5 ml av en lösning innehållande 10.000 U / ml Penicillin och 10 mg / ml streptomycin-lösning och 5 ml L-glutamin 200 mM) eller nukleinsyra konserveringslösningen enligt den nedströms förfarande som kommer attutföras senare.
- För att öppna brösthålan göra ett snitt i membranet; med hjälp av ett par av råtta-tandad tång klämma xyphoid brosk av bröstbenet och försiktigt skära revbenen på båda ryggsidorna med början från de falska revbenen hela vägen upp tills de når den punkt där de sanna revbenen möter manubrium av bröstbenet.
- Genom att hålla xyphoid brosk av bröstbenet med pincett, dra upp försiktigt för att exponera organ brösthålan.
- Ta revbenen helt genom att skära de första revbenen och nyckelbenet. Tymus kommer att visas som en vit struktur av två lober placerade i anteroventral partiet av thorax nära basen av hjärtat.
- Ta en av loberna genom att spänna fast den med en pincett och använda en sax för att ta bort ligamenten mellan dess sämre ansikte och hjärtsäcken. Fortsätt att ta bort den andra loben.
- Identifiera bukhålan och öppna den genom att skära längs symmetriaxeln för muscular vägg för att exponera organen. Med en pincett skär den bakre hålvenen och bröstkorg aorta; avlägsna överskottet av blod med en absorberande vävnad.
- För att analysera de inhemska och infiltrerande cellpopulationer i alveolerna utför bronkoalveolär lavage (BAL). Skär musklerna i ventrala delen av halsen för att exponera luftstrupen och matstrupen; att skilja dem göra snitt på laterala och dorsala sidan av strukturerna.
- Lyft upp luftstrupen med pincett och gör ett litet snitt med en skalpell för att införa en tunn spets överföringspipetten fylld med 1 ml PBS utan Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA. Ingjuta och aspirera den totala volymen på minst tre gånger; aspirera och överför cellsuspensionen till ett sterilt 1,5 ml rör och placera den på is.
- För att analysera cellpopulationer som finns i lungparenkym, först BEGJUTA lungorna genom att injicera 5 ml PBS utan Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA i höger kammarei hjärtat.
OBS: Detta kommer att eliminera de flesta av de röda blodkroppar och immunceller som finns i lungorna "blodkärl. Om perfusion utfördes korrekt, kommer lungorna färg skiftar från rosa till vitt. - Isolera hjärtat från lungorna genom att spänna fast den från basen av vänster kammare och fint skär blodkärl med en sax för att ta bort den helt. Ta perfuserade lungorna och placera dem i cRPMI eller nukleinsyra konserveringslösning beroende på nedströms analys som skall utföras.
- För analys av cellpopulationer i munslemhinnan, isolera huvudet av djuret och ta bort spottkörtlarna och angränsande mjukdelar om det inte har gjorts i steg 3.2.1.
- Gör ett snitt på var sida av munnen tills de når käken gemensamma och separera sämre käken tillsammans med tungan och golvet i munnen, med hjälp av pinnar fixa det på dissekering ombord. Dra upp tungan; med användning av en skalpell göra ett snitt där base av tungan möter golvet i munnen tills de når den tredje molarer att exponera munslemhinnan.
- Ta ut tungan helt; ta en 0,5 mm biopsistans och placera den bredvid de nedre framtänderna. Klipp från tandkötts insättning av sublinguala vävnaden och tryck försiktigt tills golvet i munnen har skurits ut helt.
- Upprepa en gång till nu placera biopsistans nära den tredje molarer att slutföra borttagning av sublinguala vävnaden. Placera den på en ren rör innehållande cRPMI eller nukleinsyra konserveringsmedel.
3.2) Provberedning för FACS-analys.
- Överför lungorna vävnad som isolerats från varje mus i en 24-brunnar och finhacka dem med en ren sax tills få små bitar av vävnad på ca 2 mm. Lägg 1 ml per brunn av matsmältning medium innehållande 30 mg av typ II kollagenas, 50 | ig DNas-I i 1 ml RPMI utan FBS. Pipettera upp och ner fem gånger och inkubera vid37 ° C och 5% CO2 under 40 min.
- För analys av cellpopulationer i den sublinguala vävnaden, ersätta matsmältningen mediet i 3.2.1 med en som innehåller 2 enheter Dispase, 30 mg typ II kollagenas, 50 mikrogram DNAse-I i 1 ml RPMI. Inkubera vävnaden uppsamlas från en mus i 500 pl av matsmältning mediet för 20 min vid 37 ° C på en orbital skakanordning vid 50 rpm.
- Efter inkubation pipett upp och ned upp till 10 gånger eller 30 sek tills det mesta av vävnaden är störd. Filtrera cellsuspensionen om en 40 | im sterilt cellfilter och tvätta med 5 ml PBS kompletterad med 5 mM EDTA.
OBS: Fullständig nedbrytning av den extracellulära matrisen och fibrös vävnad kommer inte att uppnås. Men längre inkubationstider i närvaro av kollagenas och / eller dispas eller aggressivt rivning, rekommenderas inte kommer att leda till ökad celldöd och förstörelse av extracellulära proteiner som påverkar det totala resultatet av FACS-analys. - Centrifugera vid 400 x g, 5 min, 4 ° C.
- För analys av cellpopulationer i BAL, centrifugera cellerna vid 400 xg, 5 min, vid 4 ° C och fortsätt till steg 3.2.4.
- För analys av cellpopulationer i lymfkörtlarna, placera en 70 ìm cell sil på en steril petriskål och sätta lymfkörtlarna tillsammans med 1 ml cRPMI i silen. Ta ut steget i en 2 ml steril spruta och använda den som en mortelstöt för att krossa lymfkörtlarna mot silens nät. Skölj cellfilter med 1 ml färskt cRPMI och överföra celler från petriskålen till ett sterilt rör.
- Ta en representativ del av varje prov och fläcka den med trypanblått för att fastställa livskraftiga cellantal.
- Resuspendera cellerna i FACS-EDTA: PBS-5 mM EDTA-1% bovint serumalbumin för att kompensera en suspension av 2x10 7 celler / ml och tillsätt 50 pl i en cytometer rör.
- Förbered en 2X antikroppsblandning som innehåller caopriate kombinationer av antikroppar mot markörer yta och fluorokromer enligt tillgängliga FACS instrumentet. Tillsätt 50 ìl av 2X antikroppsblandningen i varje rör innehåller cellsuspensionen.
OBSERVERA: Titrera varje fluorokrom-märkta antikroppen för att bestämma den optimala mängd som skall användas, för ett detaljerat protokoll se referens 29. - Inkubera 30 minuter på is i mörker.
- Tvätta en gång med 3 ml FACS-EDTA och spinna ned cellerna genom centrifugering vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C, återsuspendera cellerna i 200 | il av samma buffert och analysera i en flödescytometer.
OBS: Om hantering av ett stort antal prover kan färgningsprotokollet för FACS-analys som beskrivits ovan utföras i U-bottnade 96-brunnars plattor i stället för cytometer rör. Men om man använder 96-brunnars plattor tvättsteg måste utföras genom att tillsätta upp till 200 | il FACS-EDTA och upprepa det fyra gånger spinna ned cellerna vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C mellan varje washing steg. - Vid denna punkt, fixa prov för analys i flödescytometern senare (upp till 72h efter fixering).
- För att fixera cellerna efter märkning med FACS-antikropparna tvätta cellerna i PBS no Ca 2 + / Mg2 +, 1 mM EDTA utan FBS. Suspendera cellerna i 50 | il av samma buffert och tillsätt 50 | il av en nyberedd 4% paraformaldehydlösning i hyperton (2X) PBS utan Ca 2 + / Mg2 +.
- Inkubera under 20 min vid RT och tvätta 3 gånger i FACS-EDTA.
- Resuspendera cellerna i 200 | il av FACS-EDTA och förvara vid 4 ° C och skyddas från ljus under upp till 72 timmar.
OBS: FSC-SSC kan påverkas av fixering. Om fastställande av proverna kontrollera kompatibiliteten för fluorescerande antikroppar med tillverkaren eftersom tandem färgämnen kan brytas ned i närvaro av fästmedel. Om proverna kom från smittade djur fixering rekommenderas att se till att inga livsdugliga patogener kommer att vara närvarande när analysjunger proverna i FACS maskinen eftersom microaerosols kan genereras under förvärv av provet.
4 Total RNA-extraktion, cDNA syntes och Real Time PCR.
4.1) RNA-extraktion och cDNA-syntes.
- Homogenisera vävnad i nukleinsyran konserveringslösningen av val genom mekanisk sönderdelning (t ex med användning av en rotor-stator-homogenisator, höghastighets skakning vävnads ruptor och pärlor, etc). Centrifugera vid 12.600 xg under 15 min och 4 ° C för att avlägsna vävnadsrester. Överför supernatanten till ett rent rör.
- Extrahera RNA med metoden enligt val i enlighet med tillverkarens instruktioner.
OBS: RNA är mycket känslig för nedbrytning, om den inte ska användas direkt efter isolering, gör alikvoter och lagra dem i RNas fritt rör vid -80 ° C. Undvik upprepad frysning och upptining. Rören måste hanteras med handskar hela tiden. Efter upptining proven enlways hålla dem på is. - Mät absorbansen hos nukleinsyror vid 260 nm och beräkna koncentrationen i ng / | il.
- Förbered DNAs-Jag blandar genom tillsats av (1 prov): 7.6 l av ultrarent vatten, 1 l av 10X DNAse-I-buffert, 0,4 | il DNas-I (förstärkningsgrad) lager 1 U / l, och add 8.4 l av DNAse-Jag blandar till varje prov som innehåller 1 mikrogram totalt RNA.
- Använd RNA vid en koncentration av 1 ug / ul och genomfört retrotranskription reaktion (RT-PCR) genom att tillsätta 1 | il av det totala RNA som mall. Om proven är alltför utspädd, och koncentrationen är lägre än förväntat, lägga större volymer av totalt RNA i stället för vatten. Överskrid inte 20% av den slutliga reaktionsvolymen när du lägger RNA speciellt om RNA-extraktion protokollet val inblandade fenolkloroform blandning eftersom fenol spår kan påverka avkastningen av RT-PCR.
- Inkubera 15 min vid RT, följt av 10 min vid 4 ° C eller ice. (Överskrid inte inkubationstiden !!)
- Lägg ett pl av EDTA 25 mM (molekylärbiologi kvalitet) till varje rör och inkubera vid 65 ° C under 10 minuter för att inaktivera DNAs-I.
- Förbered retrotranskription (RT) mix så här (för 1 reaktion): 1 l slumpmässig hexamer primers lager 0,2 mg / ml, 1 pl dNTP lager 10 mM, 4 pl 5X M-MLV-RT buffert, 2 pl DTT 0,1 M, 1 l RNAse OUT lager 40 U / l och 1 l M-MLV retrotranscriptase lager 200 U / ul.
- Lägg 10 pl av RT-PCR-blandning till 10 | il DNAse-I reaktionsrör.
- Utför PCR-reaktionen i en termisk cykler enligt följande program:
1X cykel: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C - Späd cDNA 1: 5 genom att tillsätta 80 | il av ultrarent vatten. Förvara vid -20 ° C.
4.2) Real time PCR (qPCR).
- Förbered qPCR reaktionsblandningen enligt följande (för 1 reaktion): 5 l Master Mix innehåller Taq DNA Polymerase, SYBR Green färgämne, PCR-buffert, dNTP mix och MgCl2 (se 4.2.2 nedan); 0,9 ^ il av en 10 | iM stamlösning av den framåtriktade primern, 0,9 | il av en 10 | iM stamlösning av den omvända primern, 1,2 ul ultrarent vatten, och 2 | il av cDNA-mall tidigare utspädd såsom indikeras i steg 4.1.10.
OBS: Reagens koncentration och cykel protokoll som används i detta avsnitt optimerades skall genomföras särskilt med de reagenser och instrument som beskrivs i "Tabell över Material och reagens", andra varumärken kan användas men reaktionsvolymer, kan reagenskoncentration och cykling protokoll variera. Kontrollera dina tillverkarens instruktioner innan RT-qPCR. - Sätt upp qPCR instrumentet enligt följande:
1X cykel: 15 min, 95 ° C
40X cykler: 15 sek, 95 ° C, följt av 1 min, 60 ° C (vid denna tidpunkt förvärva fluorescens).
OBS: För relativ kvantifiering av mRNA enligt Ct metod 30 a reference gen måste väljas för normalisering av Ct-värdena. Referens-gen val bör testas under specifika analysförhållanden som dess uttryck kan variera, Actb, GAPDH eller 18S är några av de gener brukar väljas som referenser. - Ställ upp tröskelvärde och analysera data.
Representative Results
Sublingual immunterapi kan med framgång användas för att modulera lungorna immunsvar. Vi visade att en enda dos av flagellin, den TLR5 och NLRC4 agonist, kan inducera signifikant uppreglering av mRNA som kodar för kemokiner CXCL1, CCL20 och cytokinet IL-6, jämfört med saltlösningsbehandlade kontroller. Vik induktion av mRNA-nivåer nådde en topp på 8 h efter slitsen och återgår till grundnivåerna efter 20 h (fig 1). Men när SLIT utfördes 2 h före intranasal infektion med S. Pneumoniae, nivåer Cxcl1 och IL6 mRNA förblev signifikant uppregleras ens 24 timmar efter SLIT jämfört med icke-behandlade djur (Figur 2).
Analys av cellpopulationer i BAL och lungvävnad vid FACS visade att djur som behandlats med Flic av sublinguala vägen hade ökat antal neutrofiler i luftvägarna men inte i lungorna vävnad (Figur 3).
figur 4, SLIT med flagellin främjat skydd och ökad överlevnad mot akut pneumokockpneumoni.
Figur 1. Kinetik i lungorna "transkriptions profil efter sublingual immunterapi med flagellin. Åtta till 10 veckor gamla BALB / c-möss (n = 4) behandlades med 10 ug av flagellin eller saltlösning med sublinguala vägen under narkos. Lungorna uppsamlades vid olika tidpunkter och placerades i nukleinsyra konserveringsmedel. Total RNA-extraktion utfördes och cDNA syntetiserades. mRNA-nivåer utvärderades genom realtids-PCR med användning av specifika primers som anges i Table 1 Relativ kvantifiering utfördes enligt ΔCt-metoden använder Actb mRNA-nivåer för normalisering. Resultaten visas som-faldig ökning jämfört med saltlösningsbehandlade gruppen som median ± SEM. Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader (p <0,05), beräknat enligt Mann-Whitney-testet. Resultaten är representativa för två oberoende experiment.
Figur 2. Lungor 'transkriptionsprofilen under pneumokockpneumoni efter sublingual immunterapi med flagellin. Åtta till tio veckor gamla BALB / c-möss (n = 4 för kontrollgruppen och n = 7 för behandlad grupp) behandlades med 10 ^ g av flagellin eller saltlösning genom sublinguala vägen under bedövning. 2 h senare mössen genom intranasal väg med den minimala letala dosen (MLD) orsakar 100% dödlighet av ett kliniskt isolat av S. pneumoniae serotyp 1 E1585, motsvarande 4x10 5 CFU / 50 ^. Lungorna uppsamlades 24 h efter utmaning och lagras i nukleinsyra konserveringsmedel tills RNA-extraktion och cDNA-syntes utfördes. Realtids PCR utfördes (Se primer lista i tabell 1) och relativ kvantifiering utfördes enligt ΔCt-metoden med användning Actb mRNA-nivåer för normalisering. Resultaten visas som-faldig ökning jämfört med saltlösningsbehandlade gruppen som median ± SEM. Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader (p <0,05), beräknat enligt Mann-Whitney-testet.
Figur 3 Analys av polymorfonukleär neutrofiler (PMN) rekrytering i lungorna vävnad och luftvägar efter SLIT. Åtta till10 veckor gamla BALB / c-möss (n = 4) behandlades med 10 ^ g av flagellin eller saltlösning genom sublinguala vägen under anestesi. 2 h senare mössen genom intranasal väg med MLD S. pneumoniae serotyp 1 E1585. 24 timmar efter utmaning, var BAL utföras och lungor behandlades för FACS-analys. PMN identifierades som Ly6G hög / CD11b hög / CD11c negativa celler och bygger på FCS-SSC-profil. Resultaten uttrycks som procentandel av PMN med avseende på totala cellantalet i BAL eller lungorna. Staplar representerar medianen ± SEM. Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader (p <0,05), beräknat enligt ett-sätt Mann-Whitney-testet.
Figur 4 SLIT med flagellin skyddar möss mot akut pneumokockpneumoni. S. pneumoniae serotyp 1 E1585. Överlevnad utvärderades dagligen. Kaplan-Meier kurvor jämfördes enligt Log-rank (Mantel-Cox) test. Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader (p <0,05) .Results är representativa för två oberoende experiment.
| Namn | Sekvens 5'-3 ' | PCR Produkt längd (bp) |
| MB-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| MB-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| Mil-6_F | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| Mil-6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
Tabell 1 Primer förteckning som föreskrivs för realtids-PCR-analys. Specifika primersekvenser används för qPCR analys. Framåt och bakåt primers för mus actb, Cccl20, Cxcl1, IL6, TNFa och Cxcl1 presenteras som 5'-3 'sekvenser och förväntade produktlängden anges i baspar (bp).
Discussion
Sublingual administrering av terapeutiska medel har visat sig som ett användbart medel för att modulera immunsvar i luftvägarna. Den huvudsakliga fördelen med slits för behandling av respiratoriska villkor är att den inte involverar direkt leverans av föreningar till lungorna eller näsborrar, är säkrare än behandlingar baserade på intranasal administration 31.
Sublingual immunterapi kan användas för att modulera immunsvaret på olika sätt, antingen för induktion av regulatoriska svar som kan lindra symptomen vid allergisk inflammation och astma 32 eller för att framkalla övergående aktivering av medfödda immunmekanismer för behandling av akuta lunginfektioner som visas.
Modellen mus presenteras i denna video är en bekväm metod för screening av olika föreningar som terapeutiska medel för slitsen.
Denna djurmodell ger ett användbart sätt att bedöma effektenav SLIT i lungorna "immunsvar och i andra organ (t ex., dränerande lymfkörtlar eller distala slemhinnor) som inte kan efterliknas med hjälp av in vitro-modeller. Även om det finns flera papper som beskriver resultat som erhållits med hjälp av sublingual immunterapi, har detaljerade metoder för förfarandena i sublingual administrering inte gjorts tillgängliga än. Dessutom kan modellen användas för utvärdering av sublingual vacciner som syftar till att ge systemiska och lokala skydd i luftvägarna.
Såsom visas i den bifogade videon är sublingual administrering av föreningarna ett enkelt förfarande som lätt kan utföras utan behov av omfattande träning. Vanligtvis kommer en person kunnig inom djurhantering kräver 1 timme att utföra SLIT i en grupp av 10 möss som använder injicerbara bedövningsmedel som beskrivs i detta protokoll. Om pneumokocker utmaning utförs också, kommer 90 extra minuter att krävas för att förberedabakteriesuspensionen och utför intranasal utmaning av djuren.
De FACS-protokoll som presenteras här kan du lätt karakterisering av effekterna av SLIT på lokal administrerings, dränerande lymfkörtlar samt deras effekter på lungorna "celldynamik.
Separat analys av bronkoalveolär innehåll och lungparenkym är viktigt att skilja luftvägarna immun hemvist och infiltrerande celltyper från de som kvarstår i vävnaden. Analys av BAL innehållet, studiet av alveolära makrofager omsättning samt dynamiken i cellerna rekrytering i de alveolära utrymmena som induceras av olika behandlingar, till exempel., PMN, eosinofiler, monocyter. BAL kan också användas för att bedöma närvaron av utsöndrade cytokiner och kemokiner genom enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) eller detektering av utsöndrade IgA-antikroppar som framkallas efter sublingual vaccinering. Undersökning av lungorna "vävnadkommer att möjliggöra karakterisering av andra celltyper, klassiskt dendritiska celler, T-celler och B-celler.
Beredning av BAL-prover och lymfkörtlar för FACS-analys är enkel. Efter provtagning, är normalt 60 minuter krävs för att slutföra färgningsprotokollet för 10-20 prover. Däremot kommer isolering av celler från lungorna eller sublinguala vävnaden kräver mer tid eftersom nedbrytning av den extracellulära matrisen är nödvändig. Absorption av det terapeutiska medlet levereras av sublinguala vägen kan åtgärdas genom spårning av fluorescerande eller radioaktivt märkta molekyler med hjälp av in vivo bildsystem.
Sublingual immunterapi är en attraktiv metod för att effektivt inducera immunsvar i luftvägarna liksom systemiskt som kan användas för att behandla eller förhindra lungsjukdomar. Klarläggande av de mekanismer som bestämmer aktivering vs tolerans av immunsvaret i luftvägarna efter SLIT is avgörande för att möjliggöra rationell design av nya behandlingsstrategier som kan användas separat eller i kombination med tillgängliga behandlingar mot olika luftvägsbesvär.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
- Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
- Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
- Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
- Ramirez, J. A., Anzueto, A. R.
- Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
- Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
- Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
- Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
- Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
- Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
- Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
- Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
- Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
- Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
- Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
- Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
- Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
- Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
- Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
- Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
- Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
- Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
- Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999 (2009).
- Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
- Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
- Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
- Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
- Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
- Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1 (2001).
- Kubista, M., et al.
- Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
- Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).
