Abstract
Resistenza insetticida pone un grave problema per i programmi di controllo della malaria. Le zanzare si adattano a una vasta gamma di cambiamenti nell'ambiente rapidamente, rendendo il controllo della malaria un problema onnipresente nei paesi tropicali. L'emergere di popolazioni resistenti agli insetticidi garantisce l'esplorazione di nuovi percorsi di destinazione della droga e composti per il controllo del vettore zanzara. Farmaci epigenetici sono ben stabiliti nella ricerca sul cancro, tuttavia, non si sa molto circa i loro effetti sugli insetti. Questo studio fornisce un semplice protocollo per esaminare gli effetti tossicologici di 3 Deazaneplanocin A (DZNep), un farmaco epigenetico sperimentale per la terapia del cancro, sul vettore della malaria, Anopheles gambiae. Un aumento di concentrazione-dipendente della mortalità e riduzione delle dimensioni è stata osservata in zanzare immaturi esposti a DZNep, mentre il composto ha ridotto la fecondità delle zanzare adulte rispetto a controllare i trattamenti. Inoltre, c'è stata una diminuzione tossicodipendenti in S -adenosilomocisteina (SAH) attività di idrolasi in zanzare in seguito all'esposizione a DZNep rispetto per controllare i trattamenti. Questi protocolli forniscono il ricercatore con una semplice procedura, step-by-step per valutare più endpoint tossicologici per un farmaco sperimentale e, a sua volta, dimostrano un approccio multi-polo unico per esplorare gli effetti tossicologici di farmaci o composti di epigenetici idrosolubili interessi contro le zanzare vettore e altri insetti.
Introduction
La malaria è responsabile per il maggior numero di decessi insetti correlati al mondo. Si stima che circa 219 milioni di casi si verificano ogni anno in tutto il mondo, causando circa 660.000 morti, soprattutto in Africa 1. Nonostante gli sforzi concertati, la malaria programmi devono affrontare diverse sfide. Mentre insetticide trattati zanzariere e coperte componenti chiave forma irrorazione residue del programma, la resistenza agli insetticidi in popolazioni locali ostacolano questi sforzi 2. Il rapido aumento delle popolazioni di zanzare resistenti agli insetticidi è in gran parte attribuibile alla capacità delle zanzare di malaria di adattarsi rapidamente ai cambiamenti nel loro ambiente e sfruttare diverse nicchie 3,4,5. Per superare gli attuali meccanismi di resistenza agli insetticidi, l'esplorazione di nuovi obiettivi insetticida e composti di nuova generazione è garantito. Un protocollo semplice, step-by-step per determinare l'efficacia di insetticidi sperimentali sulle diverse fasi di vita della malaria mosquitoes avrebbero migliorare significativamente questi sforzi.
Studi farmacologici di effetti dei farmaci sulle linee cellulari e modelli animali hanno stabilito l'uso di farmaci epigenetici come un utile strumento per modulare la genetica e la fisiologia delle cellule e degli organismi. Metilazione del DNA e modificazione degli istoni sono due meccanismi epigenetici che influenzano l'espressione genica in organismi pluricellulari senza cambiare la sequenza del DNA sottostante 6. Modificazioni post traduzionali quali metilazione svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'integrità cellulare e l'espressione genica, e possono influenzare alcuni processi fondamentali 7,8,9. La ricerca in alcune specie di insetti hanno evidenziato l'importanza di epigenetica in processi che coinvolgono oogenesi e staminali manutenzione cella 10, così come compensazione del dosaggio 11. Tuttavia, sono ancora da esplorare questi aspetti in vettori di malattie. Utilizzo di un composto a modulare questo sistema in zanzare potrebbe fornirci inluoghi nel romanzo percorsi di destinazione insetticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) è un inibitore della metilazione dell'istone noto, che hanno un impatto su vari tipi di tumori sono stati studiati 12,13,14,15,16. DZNep è un farmaco stabile idrosolubile epigenetica che inibisce indirettamente istone lisina N -methyltransferase (EZH2), un componente del complesso Polycomb repressione 2 (PRC2) in cellule di mammifero. PRC2 svolge un ruolo importante nel regolare la crescita delle cellule staminali in organismi pluricellulari, e metilazione è un aspetto fondamentale della PRC2 mediato silenziamento genico. Nei topi immunocompromessi, cellule pre-trattati con DZNep hanno dimostrato di essere meno cancerogeno 17. Questo farmaco sta diventando utilizzato per lo studio di altre malattie, come la malattia del fegato grasso non-alcolica, in cui è implicato EZH2 18. DZNep è un consolidato S -adenosylhomocysteine (SAH) inibitore idrolasi 19, 20. L'inibizione dei risultati idrolasi SAH in unaccumulo di SAH e, a sua volta, porta alla inibizione dell'attività metiltransferasi limitando gruppi donatori di metile disponibili. SAH è un derivato aminoacido utilizzato da molti organismi, inclusi gli insetti, nelle loro vie metaboliche. Un recente studio ha dimostrato che DZNep in basse dosi possono influenzare diapausa e ritardare lo sviluppo negli insetti 21.
Qui, un protocollo robusto per studiare gli effetti di un composto solubile in acqua su diverse fasi di vita di zanzare si sviluppa. Le tre parti di questo protocollo sono le istruzioni per esaminare gli effetti di un composto idrosolubile sulle zanzare immaturi, adulti femmine si nutrono di sangue, e l'attività enzimatica di maschio adulto e zanzare femmina. Innanzitutto, DZNep viene sciolto in acqua per studiare lo sviluppo zanzara immaturo e sopravvivenza. Questa operazione viene eseguita in due concentrazioni di confrontare le differenze derivanti da aumento di 10 volte in esposizione al farmaco. Per esplorare l'effetto del farmaco sulla adulti zanzare femmina, DZNepsi aggiunge al sangue di pecora defibrillato e alimentato artificialmente il sangue alle femmine. Successivamente, il risultato del farmaco sulla fecondità viene esaminato. Infine, un saggio di attività enzimatica viene eseguita utilizzando 5,5'-dithiobis- (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) come indicatore per determinare l'effetto di DZNep sulla SAH idrolasi inibizione maschio adulto e zanzare femmina. Mentre questo protocollo è sviluppato con una zanzara malaria, Anopheles gambiae, può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei composti di interesse in qualsiasi specie di zanzara o altri insetti. Le tecniche descritti in questo protocollo non possono essere applicate in modo efficiente per un farmaco con limitata o nessuna solubilità in acqua o mezzi acquosi.
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Protocol
NOTA: Le tre parti del protocollo descrivono l'esposizione acquosa del farmaco DZNep alle zanzare larvali, un'esposizione a base di sangue di DZNep per femmine adulte di studiare l'effetto della fecondità, e SAH idrolasi inibizione da DZNep misurati utilizzando una semplice tecnica colorimetrica. Una rappresentazione schematica di questi test è mostrato in figura 1.
1. immaturi Mosquito sviluppo e la sopravvivenza saggi
NOTA: Questa sezione spiega l'uso di un farmaco solubile in acqua che colpisce lo sviluppo larve di zanzara e la sopravvivenza.
- Hatch A. uova gambiae a 28 ° C in acqua distillata (dH 2 O) e posteriore loro di 2 ° instar larve.
- Prendete un DNAse sei bene, RNAse gratuito piastra di coltura cellulare e versare 10 ml dH 2 O per ogni bene.
- Selezionare le larve di zanzara al 2 ° instar e aggiungere 15 larve per bene. Prima di aggiungere 2 ° instar larve alla piastra, pli ut su un tovagliolo di carta per 2-3 secondi per eliminare l'acqua in eccesso.
- Pozzi Label con nastri colorati di randomizzare esperimento. Etichetta 2 pozzetti per concentrazione di prova su ciascuna piastra (Figura 2).
- Preparare una cloridrato 1 DZNep mm (MW = 298,73) stock soluzione sciogliendo 0,3 mg DZNep in 1 ml di dH 2 O. Aggiungere soluzione madre di DZNep.HCl ai pozzi etichettati per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micron e 5,0 micron.
NOTA: La soluzione madre può essere conservato a 4 ° C per il breve termine (1 giorno a un mese) o -20 ° C per un lungo periodo (più di un mese).
NOTA: aggiunta della soluzione stock con concentrazioni suddetti non cambierà il volume di acqua nei pozzi significativamente. Tuttavia nel caso di concentrazioni molto più elevate, si consiglia di sciogliere il composto nel mezzo larvale per evitare qualsiasi diluizione inutili del composto. - Aggiungere la stessa quantità di cibo per pesci fiocco di ogni bene. Coprire la piastras e incubare a 28 ° C in un incubatore.
- Registrare la mortalità per le zanzare larve DZNep-trattati e non trattati, dopo un periodo di esposizione di 24 ore. Rimuovere e scartare qualsiasi larve morte. Ripetere questa registrazione ogni giorno fino a quando tutti muoiono larve o pupate ed emergere come gli adulti. Registrare le dimensioni delle larve ogni due giorni, ossia, il giorno 0, 2, 4, 6, 8, fino pupate.
- Analizzare lo sviluppo e mortalità larvale dati mediante un adeguato software di analisi statistica.
NOTA: Un grafico a barre può essere utilizzato per rappresentare i dati di mortalità in Microsoft Excel. Analisi multivariata della varianza (MANOVA) eseguita con un software come JMP o SPSS rivelerà se diverse dosi del farmaco determinano sopravvivenza significativamente differente di larve di zanzara.
2. Fecondità Assay somministrando Drug Attraverso alimentatore artificiale a Female zanzare
NOTA: Questa sezione descrive l'aggiunta del farmaco al sangue unnd alimentandola a zanzare femmina adulti utilizzando un sistema di alimentazione artificiale.
- Impostare gabbie zanzara adulta, con uguale numero di zanzare maschio e femmina per il controllo e la gabbia di prova. Fornire una soluzione di zucchero del 10% imbevuto di batuffoli di cotone per entrambe le gabbie fino le femmine sono pronte per l'alimentazione (3-5 giorni è ottimale per la Anopheles gambiae).
- 2 ore prima della somministrazione di sangue, rimuovere le palline di cotone per assicurare le femmine sono affamati.
- Assemblare due alimentatori sanguigni artificiali che consistono di un ampio imbuto rovesciato fondo di vetro (diametro = 50 mm, lunghezza = 70 mm) e una plastica circostante sigillato con colla industriale. Montare tubi di plastica (diametro = 7 mm) a due uscite alimentatori "(diametro 10 mm) tramite connettori per afflusso e il deflusso delle acque. Etichettare i due alimentatori come "controllo" e "5 micron DZNep."
- Utilizzando un elemento riscaldante disponibile in commercio, impostare il programma per l'alimentazione. In "Menu" andare su "Impostazioni"e selezionare "Valori di riferimento"; appariranno programmi precaricati. Selezionare "SP1" e impostare la temperatura per 37 ° C.
NOTA: La resistenza assicura che il sangue somministrata viene mantenuto ad una temperatura costante. Impostazioni del programma aggiuntive possono essere utilizzate per diverse specie di zanzare o di insetti. - Riempire un secchio con acqua e immergere l'elemento riscaldante in acqua.
- Tagliare un pezzo quadrato di Parafilm (50 mm x 50 mm) e si estendono per fare un film sottile membranosa. Coprire il fondo delle mangiatoie artificiali con il Parafilm. Tagliare un altro pezzo di Parafilm (50 mm x 10 mm), allungare e sigillare i bordi degli alimentatori.
- Assemblare il sistema, collegando gli alimentatori e resistenza dai tubi. Una volta completato, accendere il sistema e selezionare "SP1". Premere "Enter" per avviare il sistema.
NOTA: L'acqua avrà riscaldata a 37 ° C e mantenuta a tale temperatura. - Monitor the la temperatura dell'acqua con un termometro nel secchio d'acqua.
NOTA: I connettori e tubi aiutano a mantenere una costante circolazione di acqua attraverso il sistema in modo che la temperatura del sangue rimane a 37 ° C. - Riempire un vassoio fondo piatto con una soluzione di candeggina al 10% che verrà utilizzata per decontaminare eventuali sversamenti di sangue.
- Aggiungere 2 ml di sangue di pecora defibrillato in una provetta. Etichettare questo come "Control". Ripetere il processo per il tubo sperimentale etichettato come "5 micron DZNep" Add 6 ml di soluzione di riserva DZNep (vedi punto 1.5) al tubo sperimentale con l'etichetta "5 micron DZNep" mescolare delicatamente il sangue e droga invertendo più volte. Incubare il tubo 10 minuti a temperatura ambiente.
- Utilizzando una pipetta, aggiungere 2 ml di controllo e di sangue di prova per la parte superiore di alimentatori corrispondentemente etichettati. Gettare la pipetta nella soluzione di candeggina. Coprire la gabbia con un sacchetto scuro e respirare l'aria sulla gabbia periodicamente per incoraggiare females per l'alimentazione.
- Lasciate che le zanzare si nutrono per circa 30 min. Una volta che l'alimentazione è completata, spegnere la resistenza, prendere le mangiatoie fuori e striscia la Parafilm. Mettere a bagno l'alimentatore in soluzione di candeggina per circa 5 minuti e risciacquare bene con acqua deionizzata.
- Rimuovere gli alimentatori e mettere batuffoli di cotone con acqua e zucchero sulle gabbie per 48 ore. Inserire un piatto di uova contenente acqua e carta da filtro nelle gabbie durante la notte per facilitare la deposizione delle uova. Etichettare ogni piatto di uova con la rispettiva concentrazione di prova o di controllo.
- Rimuovere il piatto di uova giorno successivo ed esaminare il numero e la struttura di uova al microscopio stereo. Ottenere immagini utilizzando il software Q-colors5. Contare il numero di uova. Analizzare differenza nel numero di uova provenienti da test e di controllo gabbie.
NOTA: Un t-test non appaiati può essere utilizzato per determinare se il numero di uova sono significativamente differenti (p ≤0.05).
3. biochimica Assay di Mosquito Enzyme Inhibitionby Drug
NOTA: Questa sezione descrive un saggio di attività enzimatica utilizzando DTNB come indicatore per determinare l'effetto di DZNep su SAH idrolasi inibizione in maschio adulto e zanzare femmina.
- Preparare una soluzione 0,1 M Na 2 HPO 4 (sodio fosfato bibasico) aggiungendo 14,19 g di Na 2 HPO 4 a 1 L di dH 2 O. Quindi, preparare una soluzione 0,1 M NaH 2 PO 4 (sodio fosfato monobasico) aggiungendo 13,79 g di NaH 2 PO 4 a 1 L di dH 2 O.
- Titolare il M Na 2 HPO 4 soluzione 0.1 con la soluzione 4 0.1 M NaH 2 PO a pH 8,5.
NOTA: Questa sarà la soluzione madre di lavoro di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). - Preparare una soluzione di omogeneizzazione 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aggiungendo 0,3% Triton X-100.
NOTA: La soluzione di omogeneizzazione può essere conservato a 4 ° C. - Prepare una soluzione 1.6 mM SAH (MW = 384,4) sciogliendo 6,15 mg di SAH in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
- Preparare una soluzione 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) sciogliendo 6,3 mg di DTNB in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenere la soluzione DTNB fresco sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Preparare una DZNep.HCl 1 mM (MW = 298,73) soluzione sciogliendo 0,3 mg di DZNep in 1 ml dH 2 O. Successivamente, diluire la soluzione 1 mM DZNep in una serie di concentrazioni da 1,000 a 0,002 mM mM in dH 2 O.
- Per misurare la SAH idrolasi inibizione da DZNep, preparare un estratto enzimatico crudo di zanzare: Omogeneizzare 10 zanzare adulte non sangue-fed in 1 ml di ghiacciata 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenente 0,3% Triton X- 100, utilizzando un omogeneizzatore fibra di vetro. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Centrifugare l'omogeneizzato per 5 minuti a 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un ambiente pulito1,5 ml provetta. Utilizzare il surnatante come fonte dell'enzima per il saggio biochimico SAH.
- Per il trattamento vuota (cioè non DZNep, senza enzimi), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, e 100 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) per i singoli pozzetti di una 96 pozzetti, micropiastra fondo piatto.
- Per il controllo (cioè non DZNep), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, 50 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) e 50 microlitri enzima (SAH idrolasi ottenuto da estratto grezzo) all'individuo pozzi.
- Per i trattamenti DZNep, aggiungere 50 ml 1.6 SAH mm, 50 ml 1.6 DTNB mm, 50 microlitri di enzimi e 50 ml concentrazione DZNep selezionato singoli pozzi. Preparare 4 repliche per il trattamento e il controllo.
- Leggere la densità ottica (OD) dei campioni enzimatici SAH a 405 nm per 5 minuti a intervalli di 20 sec utilizzando un lettore di micropiastre a 96 pozzetti.
- Sottrarre la DO vuoto dal controllo di unnd trattamento OD ottenuto da ciascun pozzetto. Calcolare la percentuale rimanente attività di idrolasi SAH utilizzando la seguente equazione:% residuo attività = (Trattamento OD / controllo OD) x 100.
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Representative Results
La figura 1 è una rappresentazione schematica dei saggi; descrive le varie fasi della procedura descritta in questo articolo. Poiché il protocollo si basa su diversi cicli di vita zanzare, non vi è alcuna particolare sequenza da seguire per gli esperimenti qui descritti. L'utente può scegliere di effettuare uno o più test contemporaneamente, a seconda della disponibilità di esempio.
Figura 2 mostra la piastra impostato per lo sviluppo e la sopravvivenza delle zanzare saggi immaturi. Il numero di concentrazioni di prova e replicati può essere modificato a seconda delle esigenze dell'utente e disponibilità di droga. Per il saggio di zanzara immaturo, 1 soluzione madre mM di DZNep inserito in acqua contenente le zanzare per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micron e 5 micron insieme con una padella di controllo con pozzetti contenenti una popolazione libera dalla droga. L'esperimento ha dimostrato che più larve e pupe survived nei pozzetti di controllo che nei pozzetti DZNep trattati.
Figura 3 mostra l'effetto di DZNep sulla sopravvivenza complessiva delle zanzare malaria durante l'esperimento. I risultati dimostrano che il farmaco DZNep epigenetica sopprime la crescita e lo sviluppo e induce la mortalità delle zanzare immaturi. La maggior parte della zanzara esposto a 0,5 mM morto per giorno 10 dell'esperimento, mentre un gran numero di individui esposti a 5 pM morto per giorno 8. In contrasto, la mortalità delle zanzare nel trattamento di controllo (nessun farmaco) rimasta inalterato e diversi emerso come adulti il giorno 8 dell'esperimento. Una relazione inversa è stata osservata tra concentrazione di farmaco e le dimensioni del corpo della zanzara (Figura 4).
Figura 5 illustra l'effetto di DZNep sulla fecondità zanzara. Adulti zanzare femmine alimentate con sangue contenente DZNep mostrato una reductio significativon in numero di uova vitali. La figura 5A mostra uova provenienti da gabbia di controllo (nessun farmaco). La figura 5B mostra le uova provenienti da gabbia di prova. Un gran numero di uova provenienti da gabbia di prova erano di colore più scuro e mancava galleggianti (espansioni pieni d'aria di exochorion) se confrontato con uova provenienti da normali zanzare femmina sangue-fed (Figura 6). L'assenza di carri allegorici insieme con le uova di colore più scuro indica il potenziale ruolo dell'epigenetica in formazione exochorion.
Figura 7 dimostra l'effetto di DZNep sull'attività idrolasi SAH in maschio adulto e le zanzare della malaria femminili. Una diminuzione DZNep-dipendente in OD si osserva per ogni trattamento farmacologico rispetto al trattamento di controllo (nessun farmaco) che indica che DZNep inibisce l'attività idrolasi SAH.
Figura 1:. Rappresentazione schematica di test utilizzando un farmaco epigenetico su zanzare della malaria La parte sinistra dello schema mostra lo sviluppo e la sopravvivenza test con zanzare immaturi. La parte centrale mostra l'analisi fecondità via nutrono di sangue il farmaco per femmine adulte. La parte destra raffigura il saggio biochimico di inibizione enzimatica dal farmaco.
Figura 2: Piastra descrive lo sviluppo di zanzara immaturo e test sopravvivenza Label pozzetti di controllo segni di "C".. Label "0,5" mostra pozzi con 0,5 micron DZNep. Label "5" indica pozzi con 5 micron DZNep.
Figura 3: Effetto DZNep sulla sopravvivenza delle zanzare della malaria. mortalità concentrazione-dipendente è osservato con zanzare immaturi.
Figura 4:... Effetto di DZNep sullo sviluppo delle zanzare immaturi (A) Larva dal trattamento di controllo (size = 5 mm) (B), Larva trattati con 0,5 mM DZNep (size = 4 mm) (C), Larva trattato con 5 pM DZNep (size = 3 mm). Tutti larve sono stati misurati nello stesso giorno dell'esperimento.
Figura 5:. Effetto di DZNep sulla zanzara fecondità Piatto dell'uovo dal trattamento di controllo (nessun farmaco) zanzare contiene molto maggiore numero di uova (A) comparosso con il piatto di uova delle femmine trattati con 5 mM DZNep (B).
Figura 6: Effetto di DZNep sulla struttura uovo in zanzare malaria visto sotto un microscopio. (a) le uova dal trattamento di controllo (senza farmaco) zanzare visualizzare carri allegorici e gruppi rosetta. (b) le uova delle zanzare trattati con 5 micron DZNep mancano carri allegorici e gruppi rosetta-like.
Figura 7:. SAH idrolasi inibizione da DZNep in zanzare malaria DZNep provoca una diminuzione OD rispetto al trattamento di controllo (nessun farmaco).
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Discussion
Ci sono diversi passaggi vitali per l'efficace applicazione di questo protocollo. Per il saggio larvale, occorre prestare attenzione a etichettare e replicare ogni concentrazione correttamente. Randomizzazione campioni di prova e aggiungendo la quantità di farmaco designato a rispettivi pozzetti di test è una parte importante di questo set up sperimentale. Prima di aggiungere 2 ° instar larve di zanzara ad una micropiastra a 96 pozzetti, ogni larva può essere messo su un tovagliolo di carta per 2-3 secondi per eliminare l'acqua in eccesso. Per prevenire l'essiccamento, larve deve essere immediatamente trasferita ai pozzetti con un paio di pinze smussato. Ciò garantisce il volume d'acqua in ciascun pozzetto della micropiastra e la concentrazione di farmaco rimane come previsto. Quando si trasferiscono le larve per misurare la lunghezza del corpo, si raccomanda di mettere le larve in ghiaccio per pochi minuti al fine di mantenerli stazionaria. Momento dell'adeguamento di tale protocollo per una mescola diversa, occorre prestare attenzione per determinare la quantità di soluzione aggiunto ad ognibene. In tali casi, potrebbe essere preferibile sciogliere la quantità calcolata di composto in acqua direttamente prima di aggiungere le larve in ogni micropiastra.
Per i test di alimentazione del sangue, è di vitale importanza che le zanzare sono affamate opportunamente rimuovendo acqua e zucchero, almeno 2 ore prima dell'esperimento. In caso contrario, può causare alimentazione incompleta e poco effetto sulla produzione di uova femmina adulta. Miscelazione accurata e uniforme distribuzione del farmaco nel sangue è un passo importante e, come DZNep richiede alcuni minuti per sciogliere. Se il sangue di droga trattata è alimentato immediatamente, DZNep non ottiene equamente distribuita nel sistema zanzare. Si raccomanda vivamente che il sangue defibrillato è fresco (cioè meno di una settimana dalla data di estrazione) per ottenere risultati migliori.
Ci sono più passaggi critici per il successo di un saggio biochimico con un composto di interesse. Le concentrazioni di ogni soluzione di riserva utilizzati in questo proto col sono stati ottimizzati per DZNep. Per adattare il protocollo per un composto diverso, si consiglia di testare una serie di diversi pH, SAH, le concentrazioni DTNB e dimensioni del campione di insetti per determinare i risultati più affidabili. Preparazione dell'estratto enzimatico greggio è il passo più tempo in questa procedura. Durante la preparazione omogeneizzato si consiglia di utilizzare non più di 10 zanzare adulte, come lipidi presenti nel surnatante può ostacolare la lettura di assorbanza. Per evitare questo problema, lo strato superiore di lipidi nel surnatante (utilizzando una micropipetta singolo canale) può essere rimosso dopo passo 3.8. Surnatante deve essere trasferito in una provetta per microcentrifuga pulita. Fase 3.8 deve essere ripetuta per ignorare le restanti lipidi viscosi. Il restante surnatante chiaro deve essere raggruppato da tutti i tubi e miscelato delicatamente. Una pipetta multicanale può essere utilizzato per una maggiore efficienza aggiungere SAH nei pozzetti. DTNB viene usato come indicatore nel test, e dovrebbe essere preparato ultima e tenuta in ghiaccio.
nt "> Questo protocollo offre all'utente semplici passi per testare gli effetti di un composto in diverse fasi della vita di zanzare. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni all'utilizzo di questo protocollo. Questa tecnica dipende principalmente dalla solubilità in acqua di DZNep. Immaturo larve sono esposti al farmaco disciolto nei loro mezzi circostanti. Se il composto in fase di sperimentazione è insolubile in mezzi acquosi, si può rendere questo protocollo meno efficiente. Per testare la fecondità, abbiamo sottoposto le femmine adulte di droga disciolti nel sangue di pecora defibrillato. Questo non sarebbe possibile se un laboratorio alleva colonie di zanzare sul sangue di mammiferi direttamente (cioè, utilizza topi o cavie per l'alimentazione zanzare).La combinazione di diversi saggi descritti in questo articolo fornisce all'utente un nuovo modo di testare gli effetti di un composto solubile in acqua di insetti. DZNep è in gran parte aggiunta alle linee di cellule in vitro per la ricerca sul cancro; Tuttavia, questo protocollo permette user di esaminare eventuali effetti sulle diverse fasi di vita di un insetto in vivo. Inoltre, fornisce anche il ricercatore con le linee guida step-by-step per analisi tossicologiche. In letteratura, la conoscenza è limitata per quanto riguarda gli effetti dei farmaci epigenetici sugli insetti. Utilizzando DZNep come esempio, forniamo una procedura che può essere utilizzato come un passo prerequisito verso esplorare altri farmaci epigenetici o nuovi composti come potenziali agenti di controllo degli insetti. Sebbene questo protocollo è stato sviluppato per la zanzara malaria, può essere adattato per testare l'effetto di DZNep, o qualsiasi composto idrosolubile di interesse, in altre specie di zanzara o insetti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
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