हम Branchiostoma lanceolatum की unfertilized oocytes में यहां mRNA के इंजेक्शन के बाद फ्लोरोसेंट प्रोटीन के मजबूत और कुशल अभिव्यक्ति की रिपोर्ट। इस बेसल कोरडेट में microinjection तकनीक के विकास, इस उभरते हुए मॉडल प्रणाली में तकनीकी नवाचार दूरगामी vivo इमेजिंग और जीन विशिष्ट जोड़तोड़ में शामिल करने के लिए मार्ग प्रशस्त होगा।
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
विकास के दौरान, एक एकल कोशिका कोशिका विभाजन और आंदोलनों दोनों शामिल है कि एक बेहद जटिल प्रक्रिया में एक पूरे जीव को जन्म देता है। बेहतर सेल व्यवहार की गतिशीलता अंतर्निहित जैविक सिद्धांतों को समझने की, विकासात्मक जीव के प्रतिदीप्ति आधारित vivo इमेजिंग तकनीक में उपयोग करने के लिए शुरू कर दिया है। ऐसे कोशिका झिल्ली के रूप में कोशिकाओं के विशिष्ट डिब्बों, या तो, फ्लोरोसेंट रंगों के साथ उपचार द्वारा विशिष्टता की कमी से और ऊतक पैठ एक की बाधा एक दृष्टिकोण लेबल किया जा सकता है, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2 एन्कोडिंग बहिर्जात mRNAs का भ्रूण में विशिष्ट लागू होने से। विभिन्न तकनीकों ऐसे mRNAs रूप बहिर्जात यौगिकों के कुशल प्रसव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये शामिल हैं, लेकिन microinjection, इलेक्ट्रोपोरेशन, microparticles, lipofection और पारगमन 3,4 के साथ बमबारी, तक सीमित नहीं हैं। इन तरीकों के सभी एक में बहिर्जात यौगिकों को पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैभ्रूण के विकास, केवल microinjection के प्रत्येक कोशिका तीन में पूर्वनिर्धारित और सटीक मात्रा के आवेदन की अनुमति देता है। Microinjection तकनीक सभी प्रमुख विकासात्मक मॉडल प्रणाली के लिए वर्णित किया गया है 4 (जैसे, फल मक्खियों, निमेटोड कीड़े, zebrafish, मेंढ़क, चूहों) के रूप में अच्छी तरह से विकास तंत्र के विकास को समझने के उद्देश्य से तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया उन सहित कुछ वैकल्पिक मॉडल 4, के लिए के रूप में (उदाहरण के लिए, समुद्री एनीमोन, एनेलिड कीड़े, समुद्री अर्चिन, ascidian tunicates, cephalochordate amphioxus)।
एक साथ tunicates और कोरडेट संघ की स्थापना के रीढ़ के साथ, विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल मॉडल हैं जो Cephalochordates, Chordates के विकास और एक अकशेरुकी पूर्वज 5-8 से रीढ़ की विविधीकरण अध्ययन करने के लिए। cephalochordate वंश बहुत जल्दी कोरडेट विकास के दौरान भिन्नताएं; और तीन पीढ़ी में उप-विभाजित कर रहे हैं, जो वर्तमान cephalochordates, (चोकरchiostoma, Asymmetron और Epigonichthys), रीढ़ सदृश दोनों समग्र शारीरिक रचना और जीनोम वास्तुकला 5-8 के संदर्भ में। अब तक वर्णित किया गया है कि cephalochordates के बारे में 30 प्रजातियों में से पांच embryological और विकास अध्ययन 6,9 के लिए उपलब्ध हैं: Asymmetron lucayanum (Bahama lancelet), Branchiostoma floridae (फ्लोरिडा amphioxus), Branchiostoma lanceolatum (यूरोपीय amphioxus), Branchiostoma belcheri (चीनी amphioxus) और Branchiostoma japonicum (जापानी amphioxus)। इन प्रजातियों में से तीन की परिपक्व वयस्कों (बी lanceolatum, बी belcheri और बी japonicum) मांग पर प्रजनन के मौसम 10,11 के दौरान अंडे के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इसके अलावा, कम से कम बी के लिए lanceolatum, कुशल स्पॉन भी जिससे laborator के लिए इस विशेष cephalochordate प्रजातियों सुलभ बनाने, कृत्रिम समुद्र के पानी में 12 में प्रेरित किया जा सकता हैप्राकृतिक समुद्री जल के लिए पहुँच नहीं है कि एँ। बी में संयोजन, lanceolatum, ऐसे microinjection के रूप में एक कुशल वितरण पद्धति के साथ भ्रूण, के लिए एक सुविधाजनक और विश्वसनीय पहुँच के, अब तक 13-15, (बी floridae और बी belcheri दोनों में) amphioxus में विकसित केवल प्रसव तकनीक एक के विकास के लिए सक्षम हो जाएगा वंश tracing- और गतिशील सेल व्यवहार आधारित दृष्टिकोण सहित जोड़ तोड़ तकनीक के उपन्यास स्वीट।
MRNAs का कुशल microinjection के लिए एक प्रोटोकॉल बी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए lanceolatum भ्रूण इसलिए विकसित किया गया था। इसके अलावा, बी के रहते इमेजिंग के लिए एक बुनियादी टूलकिट प्रदान करने के लिए lanceolatum भ्रूण, वेक्टर सिस्टम झिल्ली जुड़े और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की परमाणु अभिव्यक्ति की अनुमति है कि विकसित किए गए। झिल्ली लक्ष्यीकरण के लिए, बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) mCherry और EGFP के मानव HRAS CAAX बॉक्स और परमाणु स्थानीयकरण के लिए गया था इनकार किया गया थाzebrafish हिस्टोन 2 बी (H2B) एक्सॉन (चित्रा 1, अनुपूरक फ़ाइल 1) के संलयन से प्राप्त की। इसके अलावा, प्रोटीन अनुवाद का अनुकूलन करने के लक्ष्य के साथ, निर्माणों की कोज़ाक दृश्यों और codons संशोधित किया गया है और बी में उपयोग करने के लिए अनुकूलित lanceolatum। साथ में ले ली, यहाँ प्रस्तुत इंजेक्शन विधि और अभिव्यक्ति वैक्टर विशेषकर नवीनतम vivo इमेजिंग तकनीक में प्रतिदीप्ति आधारित का उपयोग कर विश्लेषण करती है, cephalochordates के लिए नए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की पीढ़ी के लिए एक आधार के रूप में काम करेगा।
इस अनुच्छेद में, हम बी के इंजेक्शन के लिए, पहली बार के लिए, एक विस्तृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल पेश lanceolatum oocytes, जो, के बाद बी floridae 13,14 और बी belcheri 15, इस प्रकार एक ऐसी तकनीक वर्…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों पशुपालन के लिए "Animalerie सेंट्रेल डे Gif सुर वेट्टी" द्वारा समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम में यूरोपीय संघ FP6 अनुदान "Embryomics" द्वारा और ANR अनुदान "द्वारा, माइकल Schubert के लिए ANR (ANR-09-Blan-0262-02 और ANR-11-JSV2-002-01) से धन द्वारा समर्थित किया गया ANR- जीन फ़्राँस्वा निकोलस और नादिन Peyriéras करने के लिए 10-Blan-121,801 देव-प्रक्रिया "। जोआओ एमानुएल कार्वाल्हो एक एफसीटी डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा वित्त पोषण किया है (SFRH / बी / 86878/2012)।
यहाँ वर्णित वैक्टर के लिए अनुरोध लेखकों को सीधे संबोधित किया जा सकता है।
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Consumables | |||
35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
Reagents | |||
Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
Glycerol | SIGMA | G2025 | |
Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
Equipment | |||
Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
Injector | Picospritzer | model II or III | |
Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |