En metod för att kvantifiera orofacial storleken och formen av Xenopus laevis embryon har utvecklats. I detta protokoll är traditionella storleksmätningar i kombination med geometriska Morfometri att möjliggöra mer avancerade analyser av orofacial utveckling och defekter.
Xenopus har blivit ett viktigt verktyg för att dissekera de mekanismer som styr kraniofaciala utveckling och defekter. En metod för att kvantifiera orofacial utveckling kommer att möjliggöra mer noggrann analys av orofaciala fenotyper vid upphävande med ämnen som är genetiskt eller molekylärt kan manipulera genuttryck eller proteinfunktion. Med hjälp av två dimensionella bilder av embryonala huvuden, är traditionella storleksmått-såsom orofacial bredd, höjd och områdes mäts. Dessutom är en rundhet mått på den embryonala mynningsöppningen används för att beskriva formen på munnen. Geometriska Morfometri av dessa två dimensionella bilder utförs också för att tillhandahålla en mer sofistikerad vy över förändringar i formen av den orofaciala området. Sevärdheter delas särskilda punkter i orofaciala regionen och koordinater skapas. En princip komponentanalys används för att minska landmärke koordinaterna till huvudkomponenterna som sedan diskriminerar behandlingengrupper. Dessa resultat visas som en punktdiagram där individer med liknande orofaciala former kluster tillsammans. Det är också användbart för att utföra ett urskiljningsfunktionen analys, som statistiskt jämför positionerna för de landmärken mellan två behandlingsgrupper. Denna analys visas på en omvandling nätet där förändringar i landmärke ställning betraktas som vektorer. Ett rutnät ovanpå dessa vektorer så att ett varpmönster visas för att visa var betydande landmärke ställning har förändrats. Formförändringar i analysen urskiljningsfunktionen baseras på ett statistiskt mått, och kan därför utvärderas genom att ett p-värde. Denna analys är enkel och tillgänglig, som endast kräver en stereoskop och freeware programvara, och därmed kommer att bli en värdefull forskning och undervisning resurs.
Bland de vanligaste och förödande typer av humana fosterskador är de som berör munnen och ansiktet, till exempel orofaciala klyftor 1. Barn med missbildade orofaciala strukturer genomgår flera operationer under hela sin livstid och kämpar med ansikts vanställdhet, tal, hörsel och ätproblem. Därför underlättar ny forskning i cranio- och orofacial utveckling är avgörande för att förebygga och behandla dessa typer av fosterskador hos människor. Xenopus laevis har vuxit fram som ett nytt verktyg för att dissekera de mekanismer som styr kraniofaciala utveckling (några exempel är 2,3,4 -11). Därför skulle en kvantitativ metod för att analysera storlek och formförändringar under utvecklingen av huvudet och ansiktet av denna art är mycket kraftfull 3.
Här presenterar vi en sådan metod; kombinerar traditionella storleksmätningar med geometriska Morfometri anpassas från en Xenopus studie 12 </sup> och en uppsjö av studier som analyserar människans ansikts formulär 13-15. Målet med detta protokoll är att göra det möjligt för forskare att kvantifiera ansikts storlek och former för att skilja mellan olika orofaciala fenotyper under normal och onormal utveckling. Denna analys kommer att möjliggöra en bättre differentiering mellan subtila kraniofaciala defekter såsom sådana som härrör från synergistiska effekter av gener och / eller miljömässiga faktorer. Dessutom kan denna kvantifiering metoden också avslöjar även svag förbättring eller räddning av en orofacial defekt. Det gör därför en användbar guide i att analysera potentiella läkemedel.
Kombinationen av ansikts mätningar och geometriska Morfometri som vi presenterar här möjliggör en mer omfattande statistisk analys av både storlek och form på orofaciala regionen än dagens protokoll som till stor del använder bara det ena eller det andra 15-18. Vidare presenterar vi ett enkelt sätt att bedöma både den mediala och laterala planansiktet utan att det krävs avancerad tredimensionell avbildningsutrustning som används i löpande undersökningar 13,19.
Vi visar detta protokoll om Xenopus laevis embryon som behandlats med en retinsyrareceptor hämmare som inducerar onormal orofaciala utveckling och en median gomspalt 2,3. Kvantifiering av dimensionerna och formen av det orofaciala området i dessa embryon har avslöjat förändringar i ansiktet som är analogt till människor med liknande palatinala klyftor och musmodeller 20,21. Dock kan detta protokoll användas för att bedöma effekterna av andra föreningar på orofacial utveckling såsom naturämnen, herbicider, eller proteiner såsom tillväxtfaktorer. Vidare, orofaciala storlek och formförändringar till följd av störning av genuttryck via förlust eller vinst på funktions experiment (med antisens morpholinos eller Crispers / Talens) kan också kvantifieras med hjälp av detta protokoll. Slutligen har vi utvecklat denna metod specifically att bedöma Xenopus morfologi; dock är det lätt modifieras för analys av alla ryggradsdjur. Andra tillämpningar kan också innefatta användning av detta protokoll för att jämföra närbesläktade arter för evolutionära och ekologiska studier. Medan det exempel vi ger här använder detta protokoll för att beskriva analys av den orofaciala området, kunde den lätt modifieras för analys av andra regioner, organ eller strukturer.
Denna orofacial kvantifiering protokoll kommer att bli en värdefull resurs för forskarsamhället, samt ett utmärkt pedagogiskt hjälpmedel för studenter som en videodemonstration.
Xenopus laevis har blivit ett användbart verktyg för att dissekera de utvecklings- mekanismerna bakom orofacial utveckling; Det finns dock för närvarande inga protokoll som beskriver storlek och formförändringar i denna region i grodor. Den metod som beskrivs här kommer att bidra avsevärt till området för orofacial utveckling genom att tillåta mer rigorös kvantifiering av orofaciala fenotyper i Xenopus och andra ryggradsdjur.
Den första, mest kritiska aspekten …
The authors have nothing to disclose.
Uppstarts pengar till A. Dickinson från VCU stött detta arbete.
Författarna vill erkänna Dan Nacu för hans konstnärliga talang i att skapa den schematiska illustrationen.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
150 mm X 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
Incubators | Ectotherm | set to 15C or 20C | |
Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber, 100 mm each |
Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co, | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
BMS-453 | Tocris | 3409 | |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
100% Ethanol | VWR | 89125-170 |