Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة

Published: November 8, 2014 doi: 10.3791/52063
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

الزرد هو كائن حي تجريبي ممتاز لدراسة العمليات التنموية الفقاريات والأمراض التي تصيب البشر النموذج. هنا، نحن تصف بروتوكول بشأن كيفية تنفيذ اليدوية شاشة الكيميائية عالية الإنتاجية في الأجنة الزرد مع ككل جبل التهجين الموضعي (WISH) في القراءة خارج.

Abstract

أصبحت الزرد نموذج كائن يستخدم على نطاق واسع للتحقيق في الآليات التي تقوم عليها البيولوجيا التطورية ودراسة علم الأمراض الأمراض التي تصيب البشر بسبب درجة كبيرة من المحافظة الجيني مع البشر. علم الوراثة الكيميائية يتطلب اجراء اختبارات مفادها أن الجزيئات الصغيرة لديها على عملية بيولوجية، وأصبحت وسيلة شعبية الأبحاث المترجمة للتعرف على المركبات العلاجية. الزرد جذابة خصيصا لاستخدامها في علم الوراثة الكيميائية بسبب قدرتها على إنتاج براثن كبيرة من أجنة شفافة، والتي يتم إخصابها خارجيا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون بسهولة الأجنة الزرد المخدرات يعامل بإضافة بسيطة من مركب إلى وسائل الإعلام الجنين. باستخدام كله يشن الموقع التهجين (WISH) في، التعبير مرنا يمكن تصور واضح داخل الأجنة الزرد. معا، وذلك باستخدام علم الوراثة الكيميائية وWISH، يصبح الزرد سياق الحي كله قوي فيها لتحديد الخلوية والفسيولوجيةآثار جزيئات صغيرة. وقد تم إحراز تقدم في التقنيات المبتكرة التي تستخدم إجراءات الفرز القائم على الجهاز، ولكن للعديد من المختبرات مثل هذه الخيارات لا يمكن الوصول إليها أو لا تزال باهظة التكاليف. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح كيفية تنفيذ شاشة عالية الإنتاجية اليدوية الكيميائية الوراثية التي تتطلب موارد الأساسية، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق فريق فردي أو صغير واحد في فترة زمنية فعالة. وبالتالي، يوفر هذا البروتوكول استراتيجية مجدية والتي يمكن تنفيذها من قبل مجموعات بحثية لأداء الوراثة الكيميائية في الزرد، والتي يمكن أن تكون مفيدة لاكتساب الأفكار الأساسية في العمليات التنموية، وآليات المرض، والتعرف على مركبات جديدة ومسارات الإشارات التي لها تطبيقات ذات الصلة طبيا .

Introduction

تحديد العقاقير العلاجية فعالة لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان هو نهاية اللعبة بالنسبة لكثير من الباحثين الطبية الحيوية. في حين أن تحديد وتوصيف وكلاء الدوائية المحتملة للتطبيقات السريرية له قيمة واضحة للرعاية الصحية، إلا انه لا يزال يشكل تحديا كبيرا. في نهاية المطاف، وتطوير العديد من المركبات العلاجية تأتي من معرفة كيفية أنواع معينة من الخلايا إما تتطور أو وظيفة. الزرد، دانيو rerio، هو مكتملة العظام المياه العذبة من عائلة شبوطيات التي أصبحت كائن النموذج السائد في البيولوجيا التطورية 1. الزرد وراثيا الفقاريات الانقياد التي هي سهلة للحفاظ على والتلاعب للدراسات العلمية 2،3. الجنين الزرد شفافة، المخصبة خارجيا، ويمكن أن تنتج من قبل مئات من زوج واحد التزاوج الكبار في أسبوع واحد فقط 2،3. وعلاوة على ذلك، حصة أجهزة الجسم الرئيسية الزرد وتمتلك د كبيرegree التشابه الجيني مع الثدييات، بما في ذلك البشر 4. لافت للنظر، و 70٪ من الجينات البشرية لها orthologue الزرد 4. ونتيجة لهذا التشابه، كانت الزرد نظام التجريبية ذات أهمية كبيرة لدراسة آليات تطوير الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء، و قد استخدمت لتلخيص العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان 5-7. هذه الأسباب وغيرها، جعلت الزرد مرشحا مثاليا لمواصلة التحقيقات الوراثية ونتج عنه زيادة مطردة التقدير لفائدة الزرد في أبحاث الطب الحيوي 6،7.

على مدى العقود القليلة الماضية، وقد وضعت وفرة من الأدوات الوراثية في الزرد. الجينوم الزرد غير قابلة للالطفرات وtransgenesis 3. حتى الآن، تم تنفيذ عدد كبير من الأمام وعكس الدراسات الجينية، مما يؤدي إلى توليد أكثر من 9،000 المسوخ 3. وعلاوة على ذلك، العديد من خطوط المعدلة وراثيا لها أن تكونخلق أون، والتي مكنت من وضع العلامات وعزل أنواع معينة من الخلايا 3. فقد كانت هناك جهود كبيرة الجارية لتركيز وتوزيع هذه الموارد للمجتمع البحوث، والتي يمكن الوصول إليها عن المختبرات بتكلفة منخفضة نوعا ما من خلال المركز الدولي للاسماك الزرد الموارد (ZIRC) 8. وعلاوة على ذلك، مستودع واسعة من المعلومات البيولوجية والأدوات الجزيئية، بدءا من أنماط التعبير الجيني لmorpholino متواليات والبروتوكولات، وقد تم شرحها بشكل تدريجي على شبكة المعلومات الزرد (ZFIN) 9-11. وقد بذلت هذه البنية التحتية البحثية الزرد ممكن من خلال دعم NIH كبير والدعوة لهذا النموذج الحيواني 8. استمر هذا المخبأ من المسوخ الزرد، خطوط المعدلة وراثيا، والمعلومات ذات الصلة لتكون ذات قيمة استثنائية للمجتمع الأبحاث البيولوجية ككل. ومع ذلك، في حين الزرد الآن نموذج كائن راسخة والبارز، فإنها لا تمثلrgely غير مستغل لدراسة البيولوجيا التطورية والأمراض من خلال استخدام شاشات الوراثية الكيميائية.

علم الوراثة الكيميائية هي استخدام الجزيئات الصغيرة، مثل المخدرات أو غيرها من المركبات، أن تؤثر عملية بيولوجية ضمن نظام المعيشة 12. يمكن تطبيق علم الوراثة الكيميائية لفهم الآليات الجزيئية وظيفة الجين، مثل التعرف على العوامل التي الإنقاذ أو تفاقم خلل جيني معين 12. وعلاوة على ذلك، وعلم الوراثة الكيميائية تمثل سبيلا رئيسيا واحدا لإجراء البحوث متعدية 12. بينما كانت شاشات الوراثية التقليدية إلى الأمام في النماذج الحيوانية قوية جدا في ربط جينات معينة للأمراض، فهي تفتقر إلى البعد الزماني، مما يجعل من الصعب أو من المستحيل أحيانا لمراقبة الظواهر التي قد تنشأ بعد مرحلة التطور الجنيني المبكر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التكرار الجيني يجعل النتائج لوحظ من علم الوراثة إلى الأمام يصعب تفسيرها. بدلا من ذلك، وشاشات جينية الكيميائيةالسماح للسيطرة الزمنية الدقيقة وتوفير وقت واحد نقطة انطلاق قيمة لاكتشاف المخدرات 12،13.

علم الوراثة الكيميائية يمكن أن يؤديها في استخدام أنظمة الأنابيب (مثل خطوط الخلايا والبروتينات) أو باستخدام نظام في الجسم الحي، مثل الحي كله. يمكن استخدام النظام في المختبر لعلم الوراثة الكيميائية يكون مفيدا لأنه أبسط من نظام الحي كله، وأسهل للعمل مع على نطاق واسع، أقل تكلفة، وأقل استهلاكا للوقت. ونتيجة لذلك، في المختبر أنظمة تسمح لكلا الإنتاجية العالية الفرز (HTS) وفحص عالية المحتوى (HCS). هناك عدد من المزايا لاستخدام نظام في المختبر التي يجب أخذها في الاعتبار عند الاقتراب الوراثة الكيميائية، ولكن أيضا قيود كبيرة. أحد أوجه القصور الرئيسية لاستخدام خط الخلية هو أن جزيئات صغيرة يمكن أن يكون فعال وغير سامة في خط خلية معينة، ولكن عندما تصبح سامة أدخلت في الحي كله. وبالتالي، فإن جوهرالقضية هي أن في المختبر أنظمة لا تعبر عن السياق العام للكائن الحي، وبالتالي ليست قادرة على تقليد بدقة ما يحدث في الحي كله دائما. في حين أن الاختبار المركب في الكائنات كلها يمكن الالتفاف على هذه القضايا، واستخدام الثدييات نماذج الحي كله يطرح عددا من القيود المادية والأخلاقية. على سبيل المثال، فحص المخدرات في الماوس وأعاقت وجستيا من الفضاء والنفقات اللازمة لاختبار حجم العينة المناسب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من الصعب الأسئلة التنموية للدراسة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن تطور الثدييات في الرحم. أخيرا، في حين أن إجراء البحوث الطبية الحيوية له قيمة اجتماعية كبيرة، ومع ذلك هناك احتياجات كبيرة لحماية الرفق بالحيوان عن طريق الحد من دراسات مكثفة وتخفيف الألم والمعاناة من الحيوانات المستخدمة في الأبحاث. الزرد توفر بديلا صالحا للعمل مع الفقاريات العليا مثل الثدييات، وعلاوة على ذلك، العديد من المواضيع يمكن دراستها باستخدام علم الوراثة الكيميائية فيالمراحل الجنينية واليرقات عند معالجة العصبية غائب أو المنطوق عند مستوى منخفض 12،13.

حتى الآن، تم إجراء عدد لا يحصى من شاشات الوراثية الكيميائية باستخدام الأجنة الزرد على وجه الخصوص، وتسليم المجمع يمكن تحقيق ذلك عن طريق غمر الأجنة في وسائل الإعلام التي تحتوي على المخدرات من اهتمام 12-15. وعلاوة على ذلك، كانت هناك العديد من التطورات العلمية والتكنولوجية لجعل شاشات الوراثية الكيميائية ممكن ويمكن التحكم 16-20. وكان بيترسون وزملاؤه أول من استخدم الزرد في شاشة الوراثية الكيميائية في عام 2000، وفيما بعد في عام 2004 حددت مجمع أن قمعت طفرة تضيق الأبهر في الزرد 21،22. ومنذ ذلك الحين نفذت شاشات الكيميائية لدراسة عدة أنسجة نامية (مثل القلب والدم والأوعية) 23-25، الوظائف الفسيولوجية (على سبيل المثال، أساس العصبية للسلوك) 26، 27،28 تجديد الكبار، وامراض النماذج الإلكترونية (مثل ضمور العضلات والسرطان) 29،30. من بين هذه الشاشات الكيميائية الزرد، اتخذت اكتشاف البروستاجلاندين التي تنظم الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى التجارب السريرية على البشر، مما يدل على القدرة على الانتقال من "دبابات إلى السرير" 23،31-33 (NIH، Trials.gov السريرية، NCT00890500. NCT01627314). وفي الآونة الأخيرة، ظهرت علاجات واعدة المرشح لأجهزة معقدة مثل الكلى وعلاجها علم الأمراض الخلوي الذي في مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) 34 و قصور كلوي حاد 27،35، على الرغم من أن هذه لديها حتى الآن للانتقال إلى التجارب السريرية. تظهر هذه الشاشات الوراثية الكيميائية على نطاق واسع فائدة اختبار المركبات الصغيرة في الزرد النامية والقدرة على تطبيق علم الوراثة الكيميائية لاستجواب وظيفة الأنسجة الكبار. وعلاوة على ذلك، هناك قائمة متزايدة من مجموعات الأدوية المتاحة تجاريا التي تكون متاحة للدراسات الأكاديمية 19.

ove_content "> وفي السنوات القليلة الماضية، كانت هناك تطورات بارزة في مجال تكنولوجيا الفحص الجيني الكيميائية، بما في ذلك استخدام النظم الآلية الروبوتات الاستغناء عن المخدرات والتعامل معها، جنبا إلى جنب مع أنظمة التصوير الآلي 36-38. هذه النظم تسمح بإمكانية اختبار عدة آلاف من المركبات على حد سواء لتحقيق HTS وHCS 36-38. وللأسف، فإن التعهد شاشات الوراثية الكيميائية مع هذه المؤسسات الروبوتية مبتكرة تتطلب عادة موارد كبيرة. هذه الأنواع من الموارد تشكل عائقا كبيرا للعديد من المؤسسات التي تفتقر إلى رؤوس الأموال للحصول على وتشغيل وصيانة هذه الأجهزة. ورغم تأسيس البنية التحتية للمعالجة الآلية للمكتبات الكيميائية، بما في ذلك نقل الأجنة إلى المحتشدة لوحات، لا تزال باهظة بالنسبة لكثير من المختبرات والتصوير الآلي وتحليل التكاليف عموما أكثر يمكن الوصول إليها 12. تمكن الآلي فحص الصورة الكمي من الفلورسنت إعادة المعدلة وراثياالحمالين ويسهل تحليل المظهري محدد 12،15.

على الرغم من أن النظم الآلية تمثل التقدم التكنولوجي مفيدة، أسئلة كثيرة يمكن معالجتها من خلال شاشات اليدوي أكثر تركيزا، مثل الاستعلام من عدة آلاف من المركبات النشطة بيولوجيا في العملية التنموية مع كامل جبل الموقع التهجين (WISH) قراءات في 39. وعلاوة على ذلك، في حين أن عددا متزايدا من مختبرات والتذرع شاشات الكيميائية الزرد للتحقيق في مسألة بحثية، وعدد قليل التشبع (إن وجدت) وصلت الجهود والعديد من المواضيع حتى الآن لم يتم اختراقها باستخدام علم الوراثة الكيميائية. يمكن تنفيذها باستخدام شاشات الكيميائية الزرد مستعمرة صغيرة تتألف من عدد قليل فقط من النوع البري أو الدبابات المعدلة وراثيا. لذا، ينبغي أن يكون هذا الشكل من الاستجواب الجيني يمكن بلوغه من قبل معظم المجموعات البحثية الزرد المهتمة في توسيع / ​​تنويع في هذه الساحة. المكتبات الكيميائية متفاوتة الحجم يمكن شراؤها من الموزع التجاري و / أو عمودlaborators. لهذه الأسباب، يمكن أن الوراثة الكيميائية يكون مجديا اقتصاديا حتى في المناخات القاسية التمويل. ومع ذلك، هناك عقبات في بداية شاشة الوراثة الكيميائية، مثل كيفية تخطيط الجوانب اللوجستية للشاشة: على سبيل المثال، فإن عدد الموظفين اللازمين لشاشة ناجحة، وتخصيص وقت مخصص والتفكيك معا بروتوكول المادي لعينات العملية يدويا هذا العدد من بضع مئات إلى عدة آلاف. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول الإنتاجية العالية اليدوي لأداء الوراثة الكيميائية في الجنين الزرد مع WISH بمثابة قراءة المغادرة. يتضمن هذا الأسلوب العلاج من تعاطي المخدرات من الأجنة الزرد، تليها الكشف riboprobe النصوص مرنا. باستخدام هذا البروتوكول، فريق صغير أو حتى فرد واحد يمكن فحص وتحليل معقول مكتبة الكيميائية متواضعة حوالي 600 مركبات في غضون 9 أسابيع.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات العمل مع الزرد موضح هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة نوتردام. ويرد دليل على تصميم هذه الشاشة البحث عن جزيء صغير يدوي في الزرد (الشكل 1). وتقدم لمحة عامة عن منهجيات المبينة في هذا البروتوكول باعتباره الرسم البياني (الشكل 2). يرجى الرجوع إلى نظام سبيل المثال وضع العلامات (الشكل 3) للتخطيط لخطوات معالجة الجنين وصفها في أجزاء 4-10. للانطلاق الأجنة، يرجى الرجوع إلى الزرد انطلاق سلسلة 40، وإعداد riboprobes العقاقير المستخدمة في أجزاء WISH 9-10، راجع طرق نشر مؤخرا 41.

1. إعداد الزرد التزاوج الغرف

  1. وضع الزرد البالغين من الذكور والإناث البالغين الزرد في غرفة التزاوج، وفصلها عن غرفة مقسم O / N.
    ملاحظة: التزاوج الجماعية، فإن مثل هذاليالي تلك التي تستخدم مجموعات 2-3 و2-3 الإناث الذكور يمكن أن تولد المزيد من أجنة مقارنة التزاوج تقرن واحدة، ويمكن أن يؤديها مع غرف التزاوج بحجم مناسب.
  2. كرر الخطوة 1.1 مثل ما مجموعه 25 زوجا من الزرد وانشاء عن كل 96 لوحة جيدا من الجزيئات الصغيرة التي سيتم اختبارها.

2. جمع الأجنة الزرد

  1. في اليوم التالي، وإزالة الفاصل الذي يفصل بين كل زوج الأسماك وبعد 1 ساعة، وجمع الأجنة الزرد باستخدام مصفاة دقيقة، شبكة ووضعها في طبق بتري تحتوي E3 المتوسطة الجنين (انظر قائمة المواد وصفة).
    ملاحظة: جمع الأجنة بعد 1 ساعة يضمن أن الأجنة في المراحل التنموية المشابهة.
  2. استخدام ماصة نقل البلاستيكية لإزالة الأنقاض (مثل المواد الغذائية والنفايات الصلبة). المقبل، واستخدام stereomicroscope لمراقبة كل مخلب الأجنة وإزالة أي بويضة غير مخصبة.
  3. صب سائل الإعلام الجنين E3 واستبدالها مع E3 جديدة، ثم وضع كل ديش الأجنة في 28.5 درجة مئوية الحاضنة. بعد 2 ساعة مراقبة كل مخلب من أجنة باستخدام stereomicroscope وإزالة أي بويضة غير مخصبة.
    ملاحظة: يمكن للبويضة غير مخصبة تسميم الأجنة الأخرى، وسوف تبدو في مرحلة خلية واحدة أو مبهمة.
  4. مواصلة رصد التقدم التنموي للأجنة باستخدام stereomicroscope حتى تصل إلى 40٪ اكتفار. مراقبة على شكل كرة من الجنين الذي يتطلع إلى أن تتكون من طبقتين منفصلتين في 40٪ اكتفار المرحلة 40.

3. الكيميائية التخفيف التحضير

  1. إزالة لوحة مكتبة كيميائية من التخزين في -80 درجة مئوية، وتغطي بورق الألومنيوم وذوبان الجليد في ذلك RT.
    ملاحظة: سوف مكتبات مختلفة ذوبان الجليد بمعدلات مختلفة اعتمادا في المقام الأول على المذيبات المستخدمة. عادة، مكتبة الكيميائية المجمدة في -80 درجة مئوية سيتم إذابة تماما في حوالي 3 ساعة على RT. لوحة متجر الذوبان (ق) في مكان آمن مع المواد الخطرة وضع العلامات المناسبة. ارتداءنظارات ppropriate، معطف المختبر، ومجموعتين من القفازات عند التعامل مع المواد الكيميائية.
  2. استخدام متعدد القنوات ماصة 8 قنوات لإضافة 99 ميكرولتر من E3 إلى أعمدة 2-12 من 96 لوحة جيدا.
    ملاحظة: من تجربتنا، وبدأت مجموعة مناسبة المخدرات بين 10 ميكرومتر - 50 ميكرومتر، وأيضا كما هو موضح في البروتوكولات الحالية 39. نحن هنا يبرهن على وجود علاج 10 ميكرومتر في حالة استخدام مكتبة كيميائية لوحة الأسهم 1 ملم.
  3. استخدام متعدد القنوات ماصة 8 قنوات لإضافة 1 ميكرولتر من كل مجمع إلى ما يخصه مع E3.
  4. استخدام P10 لماصة 1 ميكرولتر من DMSO (أو المذيب المناسب) في العمود التحكم (هنا، العمود 12).
  5. تغطية لوحة التخفيف الكيميائية مع رقائق الألومنيوم، ورقائق الألومنيوم ستحمي أي المركبات الحساسة للضوء في المكتبة، والعودة لوحة رصيد المكتبة الكيميائية إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين.

4. Arraying الزرد الأجنة

  1. اختيار طبق بتريتحتوي على أجنة الزرد في مرحلة اكتفار 40٪. باستخدام ماصة نقل، وضع بعناية ما يقرب من 10 أجنة داخل كل بئر من (1.1 مل) العميقة 96 لوحة جيدا. الاستغناء الأجنة في أعمدة 2-12 من 96 لوحة جيدا عميقة.
    ملاحظة: يجب اختيار الباحث timepoint من إدمان المخدرات الذي هو أفضل مصممة خصيصا لهذه العملية التنموية كانوا يرغبون في استجواب. استخدام نقل الماصة البلاستيكية يمكن تقليل الضرر الجنين. منذ العلاج من تعاطي المخدرات قبل 40٪ اكتفار يمكن أن يؤدي إلى زيادة الفتك الجنين، وتطوير الأجنة لمدة أطول قبل التعرض للمخدرات، وخصوصا عندما يتم فحص العمليات التنموية لاحقة. يمكن وضع أكثر من 15-20 الأجنة في كل بئر تؤدي إلى تأخر في النمو بسبب الازدحام ويجب تجنبها. من المهم أن نلاحظ أن عمق 96 لوحة جيدا تحتوي على أجنة مختلفة من لوحة جيدا تخفيف الكيماوية 96.
  2. استخدام ماصة نقل الزجاج لإزالة الزائد E3 من كل بئر، وطرد الزائد في E3حاوية النفايات السائلة.
    ملاحظة: هذه العملية عادة ما يستغرق 30 دقيقة إلى 1 ساعة حسب سرعة الباحث، وبالتالي فإن الأجنة ما بين 50٪ و 60٪ اكتفار قبل الانتهاء، والتي هي المرحلة التنموية المستهدفة لإضافة التخفيف الكيميائية الموصوفة هنا. ويمكن إمالة لوحة بزاوية 45 درجة التسبب الأجنة ليسقط على قاع البئر بحيث غيض من ماصة يمكن الضغط على قاع البئر لاستخلاص قبالة الزائد E3.

5. إضافة العلاجات الكيميائية

  1. استخدام متعدد القنوات ماصة 8 قنوات لنقل 100 التخفيفات الكيميائية ميكرولتر من الآبار كل منها في عمق 96 لوحة جيدا تحتوي على أجنة الزرد المحتشدة.
    ملاحظة: تأكد من أن المكان جيدا الأصلي للمجمع مباريات مع موقع جيد في المقابلة عمق 96 لوحة جيدا (على سبيل المثال، هو pipetted الموقع B1 جيدا في لوحة تخفيف المادة الكيميائية إلى الموقع B1 جيدا في عمق96 لوحة جيدا).
  2. الرطب منشفة ورقية ووضعها في وعاء الحساسة للضوء كبيرة بما يكفي لعقد 96 لوحة جيدا.
    ملاحظة: سوف منشفة ورقية مبللة تساعد على منع تبخر التخفيف الكيميائية.
  3. المقبل، واستخدام حصيرة الختم لختم اللوحة بئر عميقة 96، وضعه في وعاء الحساسة للضوء، واحتضان ذلك في 28.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: اسمحوا الأجنة الزرد تتطور حتى صباح اليوم التالي. بدلا من ذلك، والسماح للأجنة تنمو حتى المرحلة التنموية المناسبة للعملية التي يجري تحليلها.

6. إزالة المواد الكيميائية

  1. استخدام متعدد القنوات ماصة 8 قنوات لإضافة 300 ميكرولتر من E3 إلى كل صف من الآبار المخدرات المعالجة. رسم الخروج وتجاهل التخفيف / الكيميائية E3 من كل صف من الآبار. غسل الأجنة 3 مرات مع 300 ميكرولتر من E3.
    ملاحظة: التخلص من النفايات في حاوية المخدرات المسمى تستخدم إلا لهذا الغرض. لسهولة يغسل، واستخدام حوض زجاجي مملوء E3 واسعة بما يكفي لاستخدام MULTichannel ماصة.

7. Pronase وتحديد الأجنة الزرد

  1. نقل الأجنة الزرد باستخدام ماصة نقل البلاستيكية إلى أربعة 24 لوحات جيدا، ثم إزالة أي أجنة ميتة. تسمية 24 لوحات جيدا بحيث تتوافق مع المواقع جيدا الدواء الأصلي. وضع ماصة أمام خلفية مظلمة بعد كل عملية تحويل الآبار لتصور الأجنة في ماصة ومنع الجنين جيدا كروس.
  2. استخدام ماصة نقل البلاستيكية ليسحب E3 بحيث يتم مغمورة أجنة بالكاد في السائل.
  3. استخدام ماصة الزجاج لإضافة 2 قطرات من الأسهم pronase (50 ملغ / مل) إلى كل بئر. السماح لاحتضان الأجنة في pronase لمدة 5 دقائق ثم تستنهض الهمم الآبار لتتسبب في المشيمه لكسر بعيدا. بدلا من ذلك، pronase الأجنة قبل أن تكون في مرحلة التطوير المنشود للتحليل.
  4. استخدام ماصة نقل البلاستيكية لغسل الأجنة مرتين مع E3.
  5. بمجرد أن الأجنة في مرحلة المرجوة من التحليل، شركاترسم letely خارج وتجاهل E3 المتبقية.
  6. استخدام ماصة نقل البلاستيكية لإضافة جديدة 4٪ PFA / PBS إلى كل بئر. احتضان الأجنة في 4 درجات CO / N لإصلاح. استخدام إذابة حديثا PFA لإصلاح الأجنة في البداية.
    ملاحظة: انتقل إلى أداء شاشة الفحص اهتمامك. بالتفصيل هنا في أقسام 8-10 هو إجراء لمعالجة لوحات الشاشة مع WISH. يمكن أن تكون بديلا طرق بديلة على النحو المرغوب فيه، ثم الشروع في القسم 11 وتقييم النتائج.

8. الأجنة Permeabilization

  1. استخدام ماصة نقل البلاستيكية لرسم قبالة PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني من أجنة وأجنة غسل مرتين مع 1X (الفوسفات مخزنة المالحة مع توين) PBST. نقل الأجنة إلى 48 لوحات جيدا، ثم رسم قبالة 1X PBST من الأجنة. تسمية 48 لوحات جيدا لتتناسب مع المواقع بشكل جيد الأصلية للالعميقة 96 لوحة جيدا.
  2. يغسل بإضافة الميثانول بنسبة 100٪ على الآبار باستخدام ماصة نقل البلاستيك ثم رسم تشغيله وإضافة 100٪ methanoل مرة أخرى إلى الأجنة.
  3. وضع الأجنة في -20 درجة مئوية، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل. بدلا من ذلك، والحفاظ على الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ عند -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
  4. إزالة الميثانول بنسبة 100٪ وغسل الأجنة مع 50٪ MeOH / 1X PBST، ثم 30٪ MeOH / 1X PBST، وأخيرا مرتين مع 1X PBST.
    ملاحظة: أجنة مضى عليها أكثر من 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ويمكن في هذه المرحلة تبييض لإزالة التصبغات 39.
  5. إضافة 15 ميكرولتر من بروتين إذابة K الأسهم (10 ملغ / مل) إلى 50 مل من 1X PBST لإعداد بروتين K (5 ميكروغرام / مل) محلول العمل.
  6. إزالة 1X PBST من الأجنة وإضافة محلول يعمل بروتين كاف. إزالة K بروتين بعد 4 دقائق.
    ملاحظة: المجرب يجب أن تعمل بسرعة خلال هذه الخطوة لمنع تدهور الجنين. تركيز بروتين كاف ويحتاج إلى فترة الحضانة أن تختلف تبعا لعمر الجنين يعالجون 41. المعلمات الموصوفة هنا تتعلق الأجنةالتي هي 24 HPF.
  7. غسل الأجنة مع 1X PBST، ثم يضاف الثلج الباردة PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني. السماح للأجنة احتضان في 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT.

9. التهجين وإزالة مسبار

  1. باستخدام ماصة نقل الزجاج إزالة 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني ويغسل الأجنة مرتين مع 1X PBST. استبدال 1X PBST مع 500 ميكرولتر من HYB + واحتضان الأجنة لمدة 4 ساعة عند 70 درجة مئوية.
    ملاحظة: قبل التهجين يمكن أن يؤديها لعدد قليل من 2 ساعة، ولكن 4 ساعة مثالية. أيضا، قد تكون مختلفة التهجين وغسل درجات حرارة مثالية للتحقيقات معينة، مثل 65 درجة مئوية، ولكن يجب أن يتم اختبارها على أساس فردي.
  2. توليد riboprobes المسمى digoxygenin المقابلة لهذا الجين (ق) من الفائدة 41.
  3. إضافة 16 ميكروغرام من riboprobe إلى 16 مل من HYB +. قبل تدفئة riboprobe / HYB + الحل عند 70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل استخدام. إذا باستخدام مجسات متعددة، إضافة 16 ميكروغرام لكل التحقيق لنفس Hحجم YB + (16 مل).
  4. باستخدام ماصة نقل الزجاج، وإزالة HYB + واستخدام P1000 لإضافة على 200 ميكرولتر من riboprobe / HYB + الخليط. عكس riboprobe / HYB + الكوكتيل فقط قبل استخدامها وماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة قبل إضافة الخليط إلى كل بئر. استخدام حاجز نصائح ماصة لإضافة riboprobe / HYB + الحل، وهذا يمنع بخار خليط من دخول ماصة.
  5. احتضان الأجنة في riboprobe / HYB + كوكتيل في 70 ° CO / N. استخدام الفيلم لاصقة لتغطية الآبار لوحة لO / N التحقيق الحضانة وجميع من يغسل الساخنة التالية.
  6. إعداد 50٪ الفورماميد / 2X SSCT، 2X SSCT، و0.2x SSCT وقبل الحارة عند 70 درجة CO / N.
  7. باستخدام P1000، إزالة riboprobe / HYB + وتخزين الخليط في -20 درجة مئوية. اختياريا، إعادة استخدام riboprobe / HYB + خليط تصل إلى ثلاثة أضعاف. قبل كل إعادة استخدامها، إضافة في 3 ميكروغرام من riboprobe إلى ribopr الأصليOBE / HYB + الخليط.
  8. باستخدام ماصة نقل الزجاج، وغسل الأجنة مرتين مع 50٪ الفورماميد / 2X SSCT لمدة 30 دقيقة عند 70 درجة مئوية. غسل الأجنة مرة واحدة مع 2X SSCT لمدة 15 دقيقة في 70 درجة مئوية. غسل الأجنة مرتين مع 0.2x SSCT لمدة 30 دقيقة عند 70 درجة مئوية. إزالة SSCT 0.2x وغسل الأجنة مع MABT مرتين في RT.

10. مكافحة digoxygenin الأجسام المضادة الحضانة والكشف

  1. استخدام ماصة نقل الزجاج لإزالة MABT من كل بئر. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، إضافة إلى حل كتلة جديدة كل بئر. السماح للأجنة احتضان في كتلة لمدة 4 ساعة على RT. إضافة 8 ميكرولتر من الأجسام المضادة المعادية للdigoxygenin إلى 40 مل من محلول كتلة (5000 تخفيف أضعاف).
  2. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، استبدال الحل مع كتلة الحل الضد / كتلة. إضافة ما يكفي من حل الضد / كتلة لتغطية كامل الأجنة.
  3. تغطية 48 لوحة جيدا بورق الألمنيوم، بحيث لا يمكن للضوء أن تخترق حتى الأجنة. المؤتمر الوطني العراقيubate الأجنة O / N عند 4 درجات مئوية. باستخدام ماصة الزجاج، وإزالة الأجسام المضادة / كتلة الحل وغسل الأجنة 10 مرات مع MABT لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما.
    ملاحظة: يغسل MABT لا يمكن أن يؤديها بشكل مستمر، وسوف يستغرق الباحث 5-10 دقيقة لإزالة MABT من كل لوحة والاستغناء MABT العذبة في الآبار.
  4. توليد أنبوبين من 40 مل (80 مل الكل) من العازلة قبل تلطيخ. إضافة 180 ميكرولتر من NBT (50 ملغ / مل) و 140 ميكرولتر من BCIP (50 ملغ / مل) إلى واحد من الأنابيب المعدة من قبل عازلة تلطيخ لخلق الحل تلطيخ.
    ملاحظة: هذا الحل تلطيخ تولد الركيزة اللون الأرجواني.
  5. استبدال MABT مع العازلة قبل تلطيخ والسماح للأجنة في احتضان RT لمدة 5 دقائق.
  6. استبدال المخزن المؤقت قبل تلطيخ مع الحل تلطيخ وترك في RT. مراقبة رد فعل اللونية كل 15 دقيقة باستخدام stereomicroscope.
    ملاحظة: يمكن أن ردود الفعل تلطيخ تستغرق من بضع دقائق إلى عدة ساعات اعتمادا على التحقيق.
  7. ممثلالدانتيل الحل تلطيخ مع 1X PBST بعد رد فعل تلطيخ كاملة ثم يغسل الأجنة مرتين مع 1X PBST لمدة 5 دقائق.
  8. إزالة 1X PBST وإضافة 4٪ PFA / برنامج تلفزيوني لإصلاح الأجنة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، نفذ رغبة مزدوجة للكشف عن riboprobes المسمى مع الأجسام المضادة المضادة للفلوريسئين. إن أداء مزدوج في الموقع، مضيفا تخطي 4٪ PFA / PBS (الخطوة 10.9) بعد 1X PBST غسل (الخطوة 10.8) وغسل الأجنة مرتين لمدة 15 دقيقة مع 0.1 M الجلسرين، مرتين لمدة 15 دقيقة مع يغسل MABT، ثم احتضان الأجنة لمدة 30 دقيقة في كتلة. ثم تضيف على الضد الصحيح O / N وتنفيذ خطوات 10،3-10،9 باستخدام الحل تلطيخ الصحيح. للكشف عن riboprobe المسمى fluoroscein، وإعداد حل تلطيخ مع BCIP وINT لمراقبة ركيزة الحمراء (يرجى الرجوع إلى الخطوة 10.1).

11. وسجل شاشة الكيميائية لوحات الأجنة

  1. أداء التهديف البصرية من النتائج باستخدام stereomicroscope لتقييم sampl الجنينوفاق في فحص النمط الظاهري.
  2. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، ونقل الأجنة من لوحات جيدا 48 إلى 12 لوحات جيدة عن التصور الأمثل. تسمية 12 لوحات جيدا بحيث تتوافق مع المواقع بشكل جيد من الأصلي العميق 96 لوحة جيدا. عند اكتمال عملية النقل، عرض تحت stereomicroscope.
    ملاحظة: يمكن اختيار الأجنة التمثيلية من 12 لوحات جيدة وتصويرها على الشرائح الزجاجية تحت غطاء زلة 41.

Representative Results

النهج اليدوي الموصوفة هنا يسمح للباحث واحد بكفاءة وبنجاح إجراء إنتاجية عالية شاشة الوراثة الكيميائية جزيء صغير باستخدام نموذج الجنين الزرد (الشكل 1). باستخدام هذه الطريقة، فمن العملي لشخص واحد لأداء شاشة الوراثة الكيميائية، بحيث على مدار 9 أسابيع شخص واحد (ملتزمة أسبوع العمل 40 ساعة) يمكن إجراء مسح لل~ 600 مركبات (الشكل 1) . وبالتالي، لا يمكن للوقت مقاعد البدلاء لشخص واحد تجاوز الحاجة إلى معدات مطالبين ذات الموارد المرتفعة، مثل النظم الآلية. المفاضلة هي أن الشاشة يدوية تتطلب عدة أسابيع من الجهد المتفاني. في المقابل، يمكن استخدام النظم الآلية ضغط الوقت تشارك في 1-2 أسابيع من الوقت الروبوتية، ويمكن أن يترتب على الحد الأدنى نسبيا جهد الباحث عموما. طريقة واحدة لزيادة كفاءة و / أو نطاق الشاشة الدليل هو حشد 2-3 الباحثين في المجموع، والتي من شأنها أن تمكن من فحص ممركبات خام، متفاوتة تركيز مركب، و / أو غربلة على مدى فترة زمنية أقصر.

ويوضح الخطوات الأولية المشاركة في بروتوكول لإكمال الشاشة الوراثة الكيميائية في الأجنة الزرد مع قراءات WISH بمثابة مخطط (الشكل 2). ويمكن تقسيم المهام التجريبية إلى نوعين من أسابيع العمل: (1) التعرض للمواد الكيميائية ووضع البطاقات التعريفية الجنين، و (2) تحليل والتصوير. في أسبوع العمل التعرض للمواد الكيميائية، وهذه الخطوات تشمل اقامة البالغين الزرد (يوم 1)، وجمع الجنين والأجنة arraying والعلاج من تعاطي المخدرات (يوم 2)، وإعداد الأجنة لفي الموقع التهجين (يوم 3)، والتهجين في الموقع (اليوم 4 -6). في الأسبوع التحليل / التصوير، والباحث يحلل التعبير مرنا ليسجل الأجنة ويضرب صورة (يوم 11/07).

جزء هام من أداء الشاشة الوراثة الكيميائية هو تسمية باستمرار وبدقة جيدا المواقع. كما الشاشة الوراثة الكيميائية صrocess مفصلة هنا ينطوي على نقل مجموعات من الأجنة من بئر في لوحة واحدة لبئر في لوحة مختلفة عدة مرات، والحاجة لوصفها دقيقا وواضحا أمر بالغ الأهمية، حتى أنه عندما سجل ضربة كيماوية يمكن أن يكون خطيا وسهولة ارجاعه لهويتها داخل المكتبة الكيميائية (الشكل 3). طريقة سهلة لضمان ذلك هي تسمية لوحات في مثل هذه الطريقة أنه في أي وقت ومكان جيد لمجموعة من الأجنة تعامل من قبل مجمع مباريات مباشرة المكتبة وحة المخدرات المكان جيدا الكيميائي للمركب يستخدم لعلاج هذه الأجنة (الشكل 3). هنا، يستخدم نظام مزدوج من الألوان الترميز والعلامات العددية لتنظيم العينات التي تمت إضافتها إلى لوحات الشاشة باستخدام علامات دائمة (الشكل 3).

في حين أن تحليل نتائج شاشة عالية الإنتاجية، وهناك حاجة ماسة لتطوير طريقة لتنظيم بشكل صحيح، تعليم، وتحليل جزيء صغير محتملالزيارات. لذا، يجب أن يكون شاشة الوراثة الكيميائية نظام الدرجات دقيق وواضح التي تم تصميمها بعناية والتقيد التام بها. وينبغي لهذا النظام بسهولة وبشكل كامل تنقل ديناميكية هامة للمجمع وتوفر وسيلة مختصرة لعرض نتائج الشاشة النهائية. طريقة واحدة لبناء مثل هذا النظام هو أن الأجنة درجة الاستفادة من النظام الطبقي، وهذا ما يفسر شدة المورفولوجية العامة وثقة ضرب. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقترن فئات الطبقة مع (+) أو (-) لوصف أي تأثير توسعية أو التخفيض على المنطقة (ق) من الفائدة. هنا، تعرض الأجنة الزرد إلى مركبات فردية من مكتبة النشطة بيولوجيا (انزو الكيماويات) من 50٪ إلى 24 اكتفار HPF، ثم يعاير من قبل WISH باستخدام مزيج من ثلاثة riboprobes للكشف عن قطاعات كليون (الشكل 4A). باعتبارها نظام الدرجات سبيل المثال، بئر يحتوي على مجموعة من الأجنة التي لديها convolu القريبة الموسع بشكل كبيرتيد أنبوب صغير (PCT) من سليفة الكلوة، الكلى الجنينية الزرد، من شأنه أن يتسبب في مركب يستخدم لعلاج بشكل جيد يتم تصنيفها على أنها (الدرجة الأولى)، وهو في هذه الحالة من شأنه أن يمثل الطبقة المرتبطة عيب أشد وأعلى مستوى الثقة في النمط الظاهري لاحظ الشكل (4B). عندئذ المشروح المجمع مع (PCT) و (+)، ويجري تدوين كامل (الدرجة الأولى - PCT +) (الشكل 4B). هذا مفهوم التصنيف يوفر وسيلة بسيطة وسريعة لوصف مجموعة نفيسة من المعلومات المتعلقة جزيء صغير من اهتمام، بما في ذلك من شدة تأثير المركبات على الكائن الحي، المنطقة التي يتأثر المخدرات والطريقة التي كانت المنطقة تتأثر (الشكل 4B).

الشكل 1
الشكل 1. & #160؛ دليل الزرد استراتيجية شاشة الجنين الكيميائية ويمكن للباحث يختبر عمليا في 96 لوحة جيدا للمواد الكيميائية على الأجنة الزرد وتنفيذ معالجة WISH لاحق خلال أسبوع واحد. أداء أسبوعين من الاختبارات الكيميائية (1 أسبوع (يوم 06/01) و2 أسبوع (يوم 12/7)) يمكن إرفاقها مع الأسبوع الثالث مخصص لأخذ عينات التحليل. ما يقرب من 96 لوحات تستحق عينات من الشاشة ويمكن تصويرها وسجل 3 أسبوع (يوم 13-17). هذا السيناريو يصل إلى ما يقرب من 200 فحص المركبات في فترة زمنية 3 أسابيع، ما يعادل مكتبة صغيرة من حوالي 600 فحص المركبات بشكل كامل من قبل 9 أسابيع. يمكن تعديل هذه الاستراتيجية اليدوية اعتمادا على الموارد المتاحة. على سبيل المثال، يمكن أن تقلل من ثلاثة باحثين من الوقت لاستكمال شاشة حوالي 600 مركبات إلى 3 أسابيع مقارنة مع 9 أسابيع سيستغرق مع أحد الباحثين. استراتيجيات الفحص يمكن تكييفها عن طريق تعيين الباحثين لجوانب محددة من الشاشة، مثل علاج المخدراتمنة والموقع التهجين أو توجيه الباحثين في إجراء عملية الفرز بشكل مستقل بالكامل على أجزاء منفصلة من مكتبة الكيميائية.

الرقم 2
الشكل 2. مخطط انسيابي: انهيار سير العمل الشاشة 6 أيام ويمكن تقسيم عملية الفرز الكيميائية بتحفظ وصولا إلى 6 أيام. يوم 1 ويتكون من إنشاء أزواج التزاوج الزرد (= /> 25) لتزويد أجنة لكل 96 لوحة جيدا ليتم عرضه. يوم 2 يشمل جمع الأجنة من غرف التزاوج وarraying لهم في عمق 96 لوحة جيدا، تليها العلاج من تعاطي المخدرات. في يوم 3 أجنة مستعدة لWISH، بما في ذلك dechorionation، تثبيت الأنسجة والأجنة الجفاف. أخيرا، يتم تنفيذ WISH على الأجنة خلال 4-6 يوم. يرجى ملاحظة أن إجراءات بديلة تلطيخ على عينات ثابتة يمكن أن يكون بسهولة Substituted لWISH.

الرقم 3
الرقم 3. لوحة توسيم نقل التخطيطي. والمحتشدة الأجنة الزرد والمخدرات يعامل في 96 لوحة جيدا ثم انتقلت إلى 24 لوحة جيدا لإزالة الأنقاض والتعرض pronase. ثم يتم نقل الأجنة إلى 48 لوحات جيدة لإعداد الجنين، WISH، وتثبيت الأنسجة. بعد ذلك، يتم نقل الأجنة إلى 12 لوحات جيدة للتسجيل والتصوير، والتخزين. ويتم إنجاز arraying الدقيق للأجنة من خلال استخدام نظام الترميز اللوني الذي يمكن للباحث لتتبع المواد الكيميائية المنشأ لكل عينة اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4 الرقم 4. مثال نظام الدرجات: تجزئة فحص الكلى تمكن تجربة WISH الباحث إلى وصمة عار أنواع معينة من الخلايا استنادا إلى هوية تحقيقات التي تم تحديدها، والسماح للتقييم التغيرات في الظواهر الجنين وفقا للتغيرات في موقع مرنا النسخ و/ أو المستويات. على سبيل المثال، ثلاثة قطاعات من الكلى الجنينية الزرد، وسليفة الكلوة، وقد وصفت باستخدام شاشة ميكس 1. شاشة ميكس 1 هو مزيج من تحقيقات تتكون من wt1b، الذي يموضع تحديدا في podocytes (P)، slc20a1a الذي يصادف القريبة الملتوية نبيب (PCT)، وslc12a1 التي تصف البعيدة في وقت مبكر (DE) شريحة 47. و(+) بجانب رمز تسمية المنطقة يستخدم لتعليم التوسع أو التحول الإيجابي في تلك المنطقة، في حين أن - يستخدم رمزا لإملاء التقليل من منطقة (). هنا، طب الطوارئbryos المخدرات تعامل مع رابطة الدول المستقلة 13-RA لها الداني الملتوية أنبوب صغير الموسع وخسارة كاملة من الجزء القاصي المبكر مع أي تأثير واضح على podocytes. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يمكن الوراثة الكيميائية في الزرد أن يكون لها تأثير حاسم على تطور اكتشاف المخدرات. يوفر هذا البروتوكول طريقة الإنتاجية العالية اليدوي لأداء الوراثة الكيميائية في الأجنة الزرد مع رغبة للقراءة خارج، مما يتيح لفريق فردي أو صغير فعال لإجراء شاشة جزيء صغير. هذه الطريقة الحد الأدنى من الموارد يمتد جدوى الوراثة الكيميائية إلى العديد من المجموعات البحثية. على وجه التحديد، توفر هذه الاستراتيجية الشاشة بديلا مهما لاستخدام الأجهزة الروبوتية، وهذه الأنظمة لا يمكن الوصول إليها عبر إدارات البحوث على نطاق واسع. تتيح هذه الشاشة اليدوية فرد واحد لاختبار واحد 96 لوحة جيدا من المركبات مع قراءات WISH في أسبوع العمل 6 أيام. منذ الزرد على بياض، مع الأجنة النامية خارج الأم والأجنة هي كبيرة بما يكفي لرؤية بالعين المجردة (بين 1-3 ملم)، فهي قابلة للمعالجة اليدوية مع أدوات بسيطة ويمكن للباحث في عينات مجموعةلوحات متعددة جيدا من دون استخدام المجهر. وعلاوة على ذلك، منذ الزرد تتطور بسرعة، ويمكن التعرض جزيء صغير يكون فعالا مع علاج واحد من مركب، بدلا من الجرعات المتكررة، مما يقلل مزيد من المعالجة اليدوية. الأجنة الزرد وتربيتها بسهولة لأن صفار البيض يوفر لهم مصدرا للتغذية يصل إلى 5-6 أيام بعد الإخصاب، مما يلغي مضاعفات تغذية اليرقات. بالإضافة إلى ذلك، فإن غالبية أجهزة اليرقات تطورت وأصبحت وظيفية خلال هذه الفترة، والتي توفر الفرصة لدراسة مجموعة واسعة من الأسئلة البحثية. إضافة بسيطة من الجزيئات الصغيرة إلى وسائل الإعلام الجنين الحضانة غير الغازية ويسمح للباحث (ق) لتحديد للجرعة الدواء، وقت بالإضافة إلى ذلك، ومدته توفير رقابة مشددة على العديد من المتغيرات والسماح لعمليات تنموية محددة، وبالتالي التعرض لل من مصلحة ليتم الاستعلام عنها. كما هو موضح هنا، لا يمكن تحقيق إنتاجية البحثية الهامة في timefr قصيرةAME باستخدام هذه المنهجية شاشة اليدوية. في تجربتنا، وهناك ارتفاع العائد على الجهود المستثمرة، والتي يمكن بفعل باستخدام مكتبة الكيميائية النشطة بيولوجيا معروفا لتحليل عملية من الفائدة، مثل تجزئة كليون خلال تطوير الكلوية (الشكل 4؛ Poureetezadi وWingert، غير منشورة).

الشاشة الكيميائية يدوية الموصوفة هنا هي متعددة للغاية لأنه ينطوي على فحص على عينات الزرد الثابتة. على سبيل المثال، يمكن مراجعة هذه الاستراتيجية لاختبار عدة لوحات المركبات في أسبوع واحد ومن ثم ليسجل الأجنة في الأسبوع التالي. فحوصات على عينات الزرد بديلة ثابتة، مثل المناعية أو غيرها من تلطيخ الأنسجة الاستعدادات، ويمكن أيضا أن تكون بديلا للWISH قراءة المغادرة. استراتيجيات تجريبية لأداء المقايسات الخلوية في الزرد قابلة للتكيف بسبب وضوح بصري والشفافية من مراحل النمو المبكرة. وعلاوة على ذلك، يمكن للباحثين تمنع تصبغ في وقت لاحق ستاغيس استخدام المواد الكيميائية أو تجنب المضاعفات التنمية الصباغ تماما من خلال استخدام خطوط الجينية الصباغ أقل مثل كاسبر أو الزرد الكبير 13. فمن الممكن لإدارة الجزيئات الصغيرة يدويا، معالجة وصمة عار (ق) من الفائدة، ويسجل أجنة باستخدام stereomicroscope بسيط يدويا. ومع ذلك، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن تحليل الصور آليا يمكن أن يؤديها، وربما في الواقع هناك حاجة لتحليل النمط الظاهري عالية الدقة. على سبيل المثال، قد يكون من الأفضل لشريك نظام تحليل الصور آليا مع الفحص المباشر، مثل مراسل المعدلة وراثيا، وهذا يبسط المعالجة اليدوية من العينات، تقيس الاختلافات لا يمكن تمييزها بسهولة بالعين المجردة، ويزيل الباحث التحيز 15. لحسن الحظ، بعض أنظمة التصوير الآلي على حد سواء واقتصادية من حيث تكاليف برنامج 15 سهل الاستعمال. استخدام وقدرات الأنظمة الآلية الأخرى تطورت ويمكن بسرعةأن تستخدم لتوجيه الكائنات الحية، وإدارة العلاج بالعقاقير، وحتى للانتقال الكائنات 12،15. وقد بشرت هذه النظم الآلية في العصر التكنولوجي الجديد من الأبحاث وقدمت حلولا مبتكرة لمعالجة كميات كبيرة من مواد الاختبار، وبالتالي أداء HTS والنهج HCS في الكائنات كلها 12،15. في حين أن مثل هذه الآلات هي أدوات مفيدة بلا شك، بل هي أيضا مكلفة جدا وبعيدا عن متناول العديد من مختبرات الأبحاث الأساسية. دون الوصول إلى هذه القدرات الآلي قد يبدو أن شاشات الكيميائية ليست ممكنة. ومع ذلك، يوضح هذا البروتوكول دليلا لكيفية إجراء شاشة اليدوية التي يمكن استخدامها لإكمال الشاشة الوراثة الكيميائية بطريقة عملية على مدى فترة معقولة من الزمن.

السلبيات لكلا الفرز اليدوي والكيميائية علم الوراثة بشكل عام موجودة، ويجب أن يوضع في الاعتبار عند النظر في الشاشة الكيميائية. على وجه الخصوص، الأسلوب هو موضح هنا يتطلب درجة معتدلةمن البراعة الجسدية. هذا القلق هو تقلص أو ينفي تماما من خلال التكرار، والبراعة سوف تتحسن مع الممارسة. بالإضافة إلى ذلك، هناك مجالا الحد الأدنى للخطأ جسيما، كما أن هناك 10٪ فقط الأجنة جيدا للتحليل. يمكن للجزيئات صغيرة تختلف في انتفاذ من النمط الظاهري التي يسببها، وذلك على التهديف نظام معقول لتحديد المركبات ذات الاهتمام يجب الالتزام بها. فمن الأهمية بمكان أن الباحثين باستخدام هذا البروتوكول تضع معايير صارمة مناسبة لما سوف تنظر ضرب. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن طبيعة هذا النوع من الشاشة من المرجح أن تسفر عن جزء معين من ايجابيات كاذبة، والتي يمكن أن يرسم من خلال مزيد من العمل الكيميائي المتابعة. وعلاوة على ذلك، فمن الأهمية بمكان لتنظيم الأجنة بدقة وجمع براثن للفحص بعد فترة وجيزة من الإخصاب، والتنمية غير متزامن يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات في تقييم دقيق لأثر العلاج بالعقاقير. وعلاوة على ذلك، في ما يخص الفحص الكيميائي، بحكماستراتيجية perimental، هناك مجموعة من القيود. الذوبان مركب وسمية جزيئات الناقل (على سبيل المثال، سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)) ويمكن أيضا تقديم قضية وذلك قد تكون باهظة في اختبار العديد من الجزيئات. يمكن المشيماء أيضا بمثابة حاجز التعرض المخدرات. أخيرا، على الرغم من الزرد هي نموذج قوي ومتعدية لعلم الوراثة الكيميائية، ينبغي دائما توخي الحذر في تحديد ما إذا كانت استراتيجية بديلة شاشة الكيميائية، على سبيل المثال، باستخدام نظام في المختبر مثل خط خلية، يمكن أن تكون بديلا لاستعمال العموم الحيوانات. ومع ذلك، يعتبر العلاج الكيميائي في النظام الزرد كله أفضل من إجراء مقاربات مماثلة في الثدييات، حيث أنه يوفر ميزة جمع الآثار النظامية للمركبات، ويمكن تمكين الباحثين من فرز قائمة المركبات التي سيتم اختبارها في نموذج الثدييات.

حتى الآن، وقد وفرت شاشات الكيميائية الزرد قوية التجريبي أداة رس تحدد آليات تطوير والتأكد كلاء الدوائية مرشح لاستخدامها في الطب، مثل تحديد الجزيئات قادرة على منع أمراض الأمراض. على سبيل المثال، دراسة أجراها بيرنز وزملاؤه بتطوير الفحص الدقيقة جيدا الآلي لمعدل ضربات القلب باستخدام الأجنة الزرد المعدلة وراثيا التي أعربت عن GFP في عضلة القلب 42. استخدموا هذا الخط المعدلة وراثيا لتحليل معدل ضربات القلب في التنمية وكيف تأثر ذلك على العلاج من تعاطي المخدرات 42. دراسة أخرى، عن طريق اختبار الكثافة السكانية من الخلايا الجذعية المكونة للدم في الجنين الزرد، حدد البروستاغلاندين E2 أن ينظم مكانة شهادة الثانوية العامة 23. تم التحقق من صحة هذه النتيجة في الماوس، ونفذت في وقت لاحق لإجراء تجارب سريرية في زرع الحبل السري الإنسان 23،31-33 (NIH، Trials.gov السريرية، NCT00890500، NCT01627314). ، وقد ثبت من خلال العديد من الدراسات التي أجريت مؤخرا الوراثة الكيميائية أن تكون مفيدة في دراسة أمراض الكلى باستخدام الزرد 43. يتم حفظها للغاية هيكل كليون بين الكلى الزرد الجنينية والكبار الكلى الثدييات 44-50. العديد من الدراسات فحص الكلى الجنينية الزرد تبين بوضوح إمكاناتها الكامنة متعدية عندما يقترن الوراثة الكيميائية. وأجريت شاشة الوراثة الكيميائية على اثنين من المسوخ الزرد التي تم تعيينها إلى pkd2 الجينات وift172، والتي من المعروف أن اللاعبين الرئيسيين في مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) 34. أسفرت الشاشة في تحديد deacetylase هيستون عموم (HDAC) المانع trichostatin ألف (TSA) كما جزيء صغير يمكن أن تبطل العيوب الشكلية ينظر عادة في الأجنة متحولة. وهناك نهج مختلف اتخذتها دي GROH وزملاؤه لفحص المركبات التي inducإد ذمة في البرية من نوع الأجنة الزرد، التي من شأنها أن تشير إلى وجود اختلال في وظائف الكلى 35. بعد تحديد PTBA كما ضرب، لاحظوا أنه بالإضافة إلى التسبب في ذمة، وأيضا زيادة PTBA التعبير عن pax2a، علامة لالأسلاف الكلوي. الأهم من ذلك، ثم أظهرت مشتق من PTBA الأمثل لتقليل الوفيات في المئة من البالغين الزرد التي خضعت الناجم عن جنتاميسين تلف الكلى وعلاوة على ذلك، تسارع تعافي الفئران التي عانت من التلف الكلوي 27. أخذت معا، وهذه المساهمات من الزرد الوراثة الكيميائية تسليط الضوء على أنواع الاكتشافات التي يمكن إجراؤها باستخدام الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول.

في حين أبحاث الوراثة الكيميائية يحمل ميزة كبيرة، فإنه لا يخلو من بعض التحديات. فقط باستخدام نهج الوراثة الكيميائية يمكن جعلها معقدة لتحديد الجين أو الجينات المحددة التي يجري المتضررين من المجمع. حتى لو تم العثور على الهدف (ق)، والاشتراكيةيمكن أن تبقى الفجوة بين gnificant تحديد مركب وفهم آلية (ق) من العمل في أي جزيء صغير يتصرف. على سبيل المثال، يمكن أن يكون من الصعب تحديد الآلية التي جزيء صغير يتصرف لأنه مركب واحد قادر على وجود مجموعة من الآثار المختلفة داخل الكائن الحي. ومع ذلك، مع ظهور التكنولوجيا الحديثة وشاشات جينية المزيد الكيميائية التي يجري الانتهاء منها في الزرد، ومشكلة تحديد آلية آخذة في التقلص. طريقة واحدة للمساعدة في تحديد الآثار الجزيئية للمركبات التي تم تحديدها هو اختيار مكتبة المخدرات من bioactives المعروف للفحص، حيث يحتمل أن تكون آليات يمكن استنتاجها من البيانات المشروح سابقا. بالإضافة إلى ذلك، خوارزميات chemoinformatic، مثل بوابة ديسكفري، متاحة للاستخدام التي يمكن مقارنتها التشابه الهيكلية للمجمع مقابل قاعدة بيانات للمركبات مع آليات أرجع 14. طريقة أخرى لتوضيح آلية عمل مركب سيكون لتوليد ميكرoarray البيانات الشخصية بعد معالجتها ومن ثم الاستعلام هذا الملف في تجميع ملامح المخدرات ميكروأري، مثل الربط خريطة، والبحث عن مركبات محددة ميكانيكيا التي تثير تأثير مماثل 14. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الأسلوب لتحديد الطفرات الوراثية التي لها تأثير مماثل لمجمع الفائدة. إيجاد علاقة بين مركب والمسخ قد تشير إلى أن المجمع يعمل جزيئيا المنبع أو المصب من الجينات ذات الصلة، والتي يمكن أن يرسم من خلال معالجة المسوخ مع المجمع وmorpholinos. وثمة خيار آخر يكون مطياف الكتلة، والتي تستمر لتصبح أكثر الأمثل لالزرد. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحديد التغييرات البروتين محددة أو تعديلات ما بعد متعدية بعد العلاج من تعاطي المخدرات. أخيرا، جزيئات صغيرة أو حتى مكتبات بكاملها قادرة في بعض الأحيان من أن المعلمة لالمنسدلة من الشركاء ملزم. ومن الجدير بالذكر أيضا، أنه في حين أن آلية لكيفية وظائف جزيء صغير طS الاستيراد كبيرا، وهناك المخدرات وافقت عليها الهيئة للآليات التي لا تزال مجهولة.

على الرغم من الزرد يحمل العديد من أوجه التشابه مع كل من الثدييات وراثيا وفسيولوجيا، لا تزال هناك قضية عبور المخدرات 14. التحقيق في واحدة دراسة القدرة كروس من الزيارات من الشاشة لمثبطات دورة الخلية في الأجنة الزرد 50. أسفرت الشاشة في تحديد 14 الزيارات التي لم تكن معروفة سابقا لامتلاك النشاط دورة الخلية. للخروج من هذه المركبات 14، تم العثور على 6 لخلية نشاط دورة في كل تجارب زراعة الخلية البشرية والزرد، وعرضت 3 أن يكون المعطل مصل في تجارب زراعة الخلية (1)، كان نشطا فقط في الخلايا الزرد، و 4 لديه أي نشاط في أي الزرد أو تجارب زراعة الخلية البشرية، ولكن فقط في الكائن الحي كله الزرد. والجدير بالذكر أن المركبات التي لديها 4 النشاط إلا في الزرد تبين أن هناك اختلافات بين الزرد والثدييات التي قد prohiبت إمكانية متعدية لبعض المركبات. وهذا اعتبار هام لأن تضع في اعتبارها، ولكن هناك أمثلة من الجزيئات الصغيرة، مثل PGE 2 مما يزيد من قدرة HSCs إلى تدبر في المتلقين البشري وPTBA-المشتقات التي تعمل على تحسين معدل الشفاء الكلوي في الثدييات، وبالتالي توفير الدليل من مبدأ أن كروس ممكن 23،31-33.

بغض النظر عن هذه المزالق، وعلم الوراثة الكيميائية وهذا نهج الحد الأدنى من الموارد لديها الكثير لتقدمه للمجتمع البحث. علم الوراثة الكيميائية هي مفيدة بشكل خاص في الزرد، وسوف تستمر في لعب دور حاسم في مسار التحقيق الجزيئية واكتشاف المخدرات. وكانت شاشات الكيميائية على أساس أهداف جزيئية منفصلة تاريخيا تخضع لنسبة الفشل مرتفعة بسبب ما يعرف كوكبة من الامتزاز والتوزيع والتمثيل الغذائي، وإفراز، والسمية (ADMET) الخصائص 51. شاشات الكيميائية التي تستخدم الزرد لالتركيز على العملية، وليس هدفا منفصلة، ​​يمكن التحايل على العديد من المشاكل ADMET وتحديد المركبات التي تكون فعالة في سياق الكائن الحي بأكمله. مع مجموعة متزايدة من الموارد المتاحة للبحث الزرد، بما في ذلك سلالات متحولة الحالية والقدرة على استخدام الجينوم التحرير لخلق طفرات الجينات الوراثية وهادفة، هناك تقريبا عدد غير محدود من شاشات الوراثية الكيميائية المحتملة باستخدام الزرد. تم إقامته العديد من المكتبات الكيميائية، ومجموعات تمتد مع bioactives معروف، مركبات جديدة ومتنوعة هيكليا وبنيويا مماثلة. توفر هذه الكواشف ثروة من الفرص المثيرة للمجموعات الشاشة المتوفرة حاليا، ومن المرجح أن يزداد في السنوات القادمة. مع هذه الاحتمالات في متناول اليد، ويوفر هذا البروتوكول اليدوية والإنتاجية العالية بطريقة عملية وسهلة الاستخدام لزيادة قدرة المجموعات البحثية لإجراء شاشات الوراثية الكيميائية باستخدام الزرد.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال تمويل للمختبر أبحاث Wingert مما يلي: المعاهد الوطنية للصحة منح K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237. مسيرة الدايمات باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75. بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر بول كروجر T. الابن لتوفير التغذية المرتدة حاسم على المخطوطة. نشكر موظفي قسم العلوم البيولوجية على دعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاهية لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء من الباحثين و لدينامختبر الفصل على تعليقاتهم والمناقشات والأفكار حول هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 - 10 μl natural pipet tips USA Scientific 1111-3800
1x E3 Generate using 50x E3 and DI water.
1x PBST Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS.
10x PBS American Bioanalytical AB11072
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
20x SSC American Bioanalytical AB13156
24 well plate BD-Falcon 35-3226
4% PFA/1x PBS Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 °C.
48 well plate CytoOne CC7672-7548
50x E3 Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water.
96 deep well plate VWR 100-11-940
96 well plate sealing mat VWR 10011-946
anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Keep at -20 °C.
BCIP stock Sigma B8503 Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 °C.
block solution Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.)
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.)
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Consult the manufacturer procedure.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
embryo incubation dish Falcon 35-1005
epT.I.P.S 20-300 μl Eppendorf 22492284
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C.
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Keep at -20 °C.
filter sterilization unit Corning 430516 0.45 μm CA / 1 L volume
fine forceps Roboz RS-1050
flat-bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Formamide American Bioanalytical AB00600 Keep at -20 °C.
glass basin 90 x 50 Kimax Kimble 23000
glass pipette VWR 14673-010
glass vial Wheaton 225012
glycerol Sigma G7893
glycine Sigma G8898
glycogen Roche 10901393001
HYB+ Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 μl/μl heparin
INT stock Sigma I8377 Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 °C.
MAB Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2 L and autoclave.
MABT Generate 0.1% Tween-20 in MAB
MeOH Sigma 34860-4L
mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
multi 8-channel pipette 0.5 - 10 μl Eppendorf 3122000.019
multi 8-channel pipette 30 - 300 μl Eppendorf 3122000.051
nanodrop Thermo ND-2000c
NBT stock Sigma N6876 Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 °C.
paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
PCR-Film adhesive Eppendorf 30127.48
plate container (Pencil Box) Sterilite 1722
pre-staining buffer Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)
Pronase Roche 11459643001 Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 °C.
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 °C.
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
rubber bulb Fisherbrand Fisher Scientific 03-448-22
staining solution-purple N/A N/A Generate using 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.
staining solution-red Generate using 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.
stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
transfer pipet Samco 202, 204
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
waterbath Thermo 51221073 (Model # 2831)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
  2. Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  4. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  5. Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
  6. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
  7. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  8. Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
  9. Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
  10. Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
  11. Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
  12. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
  13. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
  14. Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3 (5), 454-460 (2010).
  15. Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
  16. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
  17. Peterson, R. T., Fishman, M. C. Designing zebrafish chemical screens. Methods Cell Biol. 105, 525-541 (2011).
  18. Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
  19. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  20. Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
  21. Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
  22. Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
  23. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  24. Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  25. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  26. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  27. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
  28. Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  29. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
  30. White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
  31. Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
  32. Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
  33. Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
  34. Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
  35. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
  36. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
  37. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
  38. Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
  39. Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
  42. Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
  43. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
  44. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
  45. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
  47. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
  48. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  49. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
  50. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  51. Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
  52. Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 93، الزرد، وعلم الوراثة الكيميائية، شاشة الكيميائية،
دليل جزيء صغير شاشة تقترب عالية الإنتاجية عن طريق الزرد الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., … More

Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063, doi:10.3791/52063 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter