Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En manuell Small Molecule Screen Nærmer Høy throughput Bruke Sebrafisk embryo

Published: November 8, 2014 doi: 10.3791/52063
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

Sebrafisk er en utmerket eksperimentell organisme for å studere virveldyr utviklingsprosesser og modell sykdom hos mennesker. Her beskriver vi en protokoll om hvordan du utfører en manuell høy gjennomstrømming kjemisk skjermen i sebrafisk embryo med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) read-out.

Abstract

Sebrafisk har blitt et mye brukt modellorganisme for å undersøke hvilke mekanismer som ligger til grunn utviklingsbiologi og å studere menneskelig sykdom patologi på grunn av sin betydelig grad av genetisk bevaring med mennesker. Kjemiske genetikk innebærer testing av effekten at små molekyler har på en biologisk prosess, og er blitt et populært translasjonsforskning metode for å identifisere terapeutiske forbindelser. Sebrafisk er spesielt attraktivt å bruke for kjemiske genetikk på grunn av deres evne til å produsere store klørne på gjennomsiktige embryo, som er eksternt befruktet. Videre kan sebrafisk embryoer være enkelt medikament behandlet ved den enkle tilsetning av en forbindelse til embryoet media. Ved hjelp av hel-mount in situ hybridisering (WISH), kan mRNA uttrykket være tydelig visualisert i sebrafisk embryoer. Sammen, ved hjelp av kjemiske genetikk og WISH, blir sebrafisk en potent hele organismen konteksten som å fastslå den cellulære og fysiologiskevirkningene av små molekyler. Innovative fremskritt har blitt gjort i teknologier som utnytter maskinbaserte screening prosedyrer, men for mange laboratorier slike alternativer ikke er tilgjengelige eller forbli kostnads ​​uoverkommelige. Protokollen er beskrevet her forklarer hvordan å utføre en manuell høy gjennomstrømming kjemisk genetisk skjerm som krever grunnleggende ressurser og kan oppnås ved et enkelt individ eller lite team på en effektiv periode. Dermed gir denne protokollen en mulig strategi som kan implementeres av forskergrupper til å utføre kjemiske genetikk i sebrafisk, noe som kan være nyttig for å få grunnleggende innsikt i utviklingsprosesser, sykdomsmekanismer, og for å identifisere nye forbindelser og signalveier som har medisinsk relevante programmer .

Introduction

Identifiseringen av effektive terapeutiske legemidler til behandling av humant sykdom er endgame for mange biomedisinske forskere. Mens identifisering og karakterisering av potensielle farmakologiske midler for kliniske formål har åpenbart verdi for helsetjenester, har det vært en betydelig utfordring. Til syvende og sist, til utvikling av mange terapeutiske forbindelser kommer fra kunnskap om hvordan spesifikke celletyper, enten utvikle eller funksjon. Sebrafisk, Danio rerio, er en ferskvanns teleost av Cyprinidae familien som har blitt en mainstream modellorganisme i utviklingsbiologi 1. Sebrafisk er genetisk medgjørlig virveldyr som er enkle å vedlikeholde og manipulere for vitenskapelige studier 2,3. Sebrafisk embryo er gjennomsiktig, eksternt befruktet, og kan produseres i hundrevis fra en enkelt voksen parring pair i bare en uke 2,3. Videre sebrafisk dele store organsystemer og har en stor degree av genetisk likhet med pattedyr, inkludert mennesker 4. Påfallende, 70% av menneskelige gener har en sebrafisk orthologue 4. På grunn av denne likheten, sebrafisk har vært en svært relevant eksperimentelt system for å studere mekanismene for vertebrate utvikling og fysiologi, og har vært anvendt for å rekapitulere en rekke humane sykdommer 5-7. Av disse grunner, blant andre, har gjort sebrafisk en ideell kandidat for fortsatt genetiske avhør og har resultert i en stadig økende forståelse for nytten av sebrafisk i biomedisinsk forskning 6,7.

I løpet av de siste tiårene, har en overflod av genetiske verktøy er utviklet i sebrafisk. Sebrafisk genom er mottagelig for mutagenese og transgenesis tre. Hittil har en mengde forover og bakover genetiske studier utført, fører til generering av over 9.000 mutanter tre. Videre, mange transgene linjer har væreno opprettet, som har aktivert merking og isolering av spesifikke celletyper 3. Det har vært betydelige pågående arbeidet med å sentralisere og distribuere disse ressursene til forskersamfunnet, som er tilgjengelige for laboratorier på en ganske lav pris gjennom Sebrafisk International Resource Center (Zirc) 8. Videre, et omfattende register av biologisk informasjon og molekylære verktøy, alt fra genutrykksmønster å morfolino sekvenser og protokoller, har blitt gradvis kommentert på Sebrafisk Information Network (ZFIN) 9-11. Disse sebrafisk forskningsinfrastrukturer har blitt gjort mulig gjennom betydelige NIH støtte og forsvar av denne dyremodell 8. Denne cache av sebrafisk mutanter, transgene linjer, og relevant informasjon fortsetter å være av eksepsjonell verdi for biologisk forskning samfunnet generelt. Men mens sebrafisk er nå et veletablert og pre-eminente modellorganisme, de representerer en largely uutnyttet reservoar for å studere utviklingsbiologi og sykdom gjennom bruk av kjemiske genetiske skjermer.

Kjemiske genetikk er bruken av små molekyler, slik som medikamenter eller andre forbindelser, for å påvirke en biologisk prosess i et levende system 12. Kjemiske genetikk kan iverksettes for å forstå de molekylære mekanismene for gen-funksjon, som for eksempel å identifisere stoffer som redning eller forverre en bestemt genetisk defekt 12. Videre kjemiske genetikk representerer en viktig vei å drive translasjonsforskning 12. Mens tradisjonelle termin genetiske skjermer i dyremodeller har vært enormt kraftig i å knytte spesifikke gener for sykdommer, de mangler en tidsdimensjonen, noe som gjør det vanskelig eller noen ganger umulig å observere fenotyper som ville oppstå etter tidlig embryogenesis. I tillegg kan genet redundans gjøre resultatene observert fra termin genetikk vanskelig å tolke. Alternativt, kjemiske genetiske skjermertillate for fine temp kontroll og samtidig gi et verdifullt utgangspunkt for drug discovery 12,13.

Kjemiske genetikk kan utføres ved hjelp av in vitro-systemer (f.eks, cellelinjer, proteiner) eller ved hjelp av en in vivo-system, slik som et hele organismen. Ved hjelp av et in vitro system for kjemiske genetikk kan være gunstig fordi det er enklere enn en hel organisme system, lettere å arbeide med i stor skala, mindre kostnadskrevende og mindre tidskrevende. Som et resultat av in vitro-systemer tillater både high-throughput screening (HTS) og høy-innhold screening (HCS). Det er en rekke fordeler ved å bruke en in vitro-system som bør tas i betraktning når man nærmer kjemiske genetikk, men også betydelige begrensninger. En hovedbegrensning ved anvendelse av en cellelinje, er at små molekyler kan være effektiv og ikke-toksisk i et bestemt cellelinje, men likevel bli giftig når det innføres i en hel organisme. Således hunkjønnav problemet er at in vitro-systemer ikke fange den brede rammen av en organisme, og derfor er ikke alltid i stand til å nøyaktig etterligne det som skjer i en hel organisme. Mens sammensatte testing i hele organismer kan omgå disse problemene, bruk av pattedyr hele organismen modeller utgjør en rekke fysiske og etiske begrensninger. For eksempel er medikamentscreening i mus logistisk hindret av plass og kostnader nødvendig for å teste en tilstrekkelig prøvestørrelse. I tillegg kan utviklings spørsmål være vanskelig å studere, på grunn av det faktum at pattedyr utvikles in utero. Til slutt, mens gjennomføringen av biomedisinsk forskning har enorm samfunnsmessig verdi, er det likevel betydelige behov for å beskytte dyrevelferden ved å begrense intense studier og lindre smerte og lidelse for dyr som brukes til forskning. Sebrafisk gi en levedyktig alternativ til å jobbe med høyere virveldyr som pattedyr, og dessuten kan mange emner studeres ved hjelp av kjemiske genetikk påde embryonale og larvestadiet når nevrologisk behandling er fraværende eller operativ på et lavt nivå 12,13.

Til dags dato, har en myriade av kjemiske genetiske skjermer blitt utført ved hjelp av sebrafisk embryo i særdeleshet, som sammensatte levering kan oppnås ved å dyppe embryoene i medier som inneholder stoffet av interesse 12-15. Videre har det vært en rekke vitenskapelige og teknologiske fremskritt for å gjøre kjemiske genetiske skjermer mulig og håndterlig 16-20. Peterson og kolleger var de første til å bruke sebrafisk i en kjemisk genetisk skjermen i 2000, og senere i 2004 identifisert et stoff som undertrykt en aortic coarctation mutasjon i sebrafisk 21,22. Kjemiske skjermer har siden blitt iverksatt for å studere flere utviklings vev (f.eks, hjerte, blod, båt) 23-25, fysiologiske funksjoner (f.eks nevrologiske grunnlaget for atferd) 26, voksen regenerering 27,28, og diseas e modeller (f.eks, muskeldystrofi og kreft) 29,30. Blant disse sebrafisk kjemiske skjermene, har oppdagelsen av at prostaglandiner regulere blodkreft stamceller blitt tatt til kliniske studier i mennesker, demonstrere makt til å flytte fra "tank til bedside" 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Mer nylig har lovende kandidat terapeutika fremkom for kompliserte organer som nyrer, som avhjelpe cellulær patologi i polycystisk nyresykdom (PKD) 34 og akutte nyreskade 27,35, selv om disse har ennå å bevege seg til kliniske forsøk. Disse kjemiske genetiske skjermer bredt demonstrere nytten av å teste små forbindelser i utviklingssebrafisk, og evnen til å anvende kjemiske genetikk å avhøre voksen vev funksjon. Videre er det en voksende liste av kommersielt tilgjengelige farmakologi samlinger som er tilgjengelige for akademiske studier 19.

ove_content "> I de siste årene har det vært fremtredende fremskritt innen kjemisk genetisk screening teknologi, herunder bruk av automatiserte systemer av roboter for narkotika dosering og håndtering, sammen med automatiserte bildesystemer 36-38. Slike systemer åpner for muligheten for teste mange tusen av forbindelser for å oppnå både HTS og HCS 36-38. Dessverre foretaket av kjemiske genetiske skjermer med disse innovative robot bedrifter vanligvis krever betydelige ressurser. Disse typer ressurser er et betydelig hinder for mange institusjoner som mangler kapital til å erverve , drive og vedlikeholde en slik instrumentering. Mens etablering av infrastruktur for robot håndtering av kjemiske biblioteker, inkludert overføring av embryoene kledd plater, forblir kostnadene uoverkommelige for mange laboratorier, automatisert bildebehandling og analyse er generelt mer tilgjengelig 12. Automatisert bilde screening muliggjør kvantifisering fluorescerende transgen redørvoktere og forenkler bestemt fenotypeanalyser 12,15.

Selv om automatiserte systemer representerer nyttige teknologiske fremskritt, kan mange spørsmål løses ved mer fokusert manuelle skjermbildene, som spørsmålet om flere tusen biologisk aktive forbindelser på en utviklingsprosess med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) avlesning 39. Videre, mens stadig flere laboratorier har påberopt sebrafisk kjemiske skjermer for å undersøke en problemstilling, få (om noen) innsats har nådd et metningspunkt og mange emner er ennå ikke brutt ved hjelp av kjemiske genetikk. Kjemiske skjermer kan utføres ved hjelp av en liten sebrafisk koloni bestående av bare noen få villtype eller transgene tanker. Derfor bør denne form for genetisk avhør være oppnåelige av de fleste sebrafisk forskningsgrupper som er interessert i å utvide / diversifisere inn i denne arenaen. Kjemiske biblioteker av varierende størrelse kan være anskaffet fra en kommersiell distributør og / eller collaborators. For disse grunner, kan kjemiske genetikk være økonomisk gjennomførbart, selv i tøffe finansierings klima. Men det finnes hindringer for å begynner en kjemisk genetikk skjermen, for eksempel hvordan du planlegger logistiske aspekter av skjermen: f.eks, antall personell som trengs for en vellykket skjerm, tildeling av dedikerte tid og sette sammen en fysisk protokoll til manuelt prosessprøver det tallet fra hundre til flere tusen. Her, vi detalj en manuell høy gjennomstrømming protokollen til å utføre kjemiske genetikk i sebrafisk embryo med WISH som en skrive-out. Denne metoden innebærer medikamentell behandling av sebrafisk embryo, etterfulgt av riboprobe påvisning av mRNA transkripter. Ved hjelp av denne protokollen, et lite team eller en person med rimelighet kan sile og analysere en beskjeden kjemisk bibliotek ca 600 forbindelser i span av 9 uker.

Protocol

Prosedyrene for å arbeide med sebrafisk som er beskrevet her ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Notre Dame. En guide til forskningsdesign for denne håndboken lite molekyl skjermen i sebrafisk er gitt (figur 1). En oversikt over de metoder som er beskrevet i denne protokollen er gitt som et flytskjema (figur 2). Vennligst referer til eksempelet merkingssystem (figur 3) for å planlegge embryo prosesstrinnene som er beskrevet i del 4-10. For iscenesettelsen av embryoer, henvises det til sebrafisk staging-serien 40, og for utarbeidelse av WISH antisens riboprober brukes i deler 9-10, se nylig publiserte metoder 41.

1. Utarbeidelse av sebrafisk Mating Chambers

  1. Plasser en voksen mann sebrafisk og en voksen kvinne sebrafisk i en parring kammer, atskilt av kammerdeler O / N.
    MERK: Masseparringer, sliks de som bruker grupper på 2-3 hunner og 2-3 hanner kan generere flere embryoer i forhold til enkelt sammenkoblede parringer, og kan utføres med riktig størrelse parring kamre.
  2. Gjenta trinn 1.1, slik at totalt 25 par av sebrafisk er satt opp for hver 96 brønn plate av små molekyler som vil bli testet.

2. Innsamling av Sebrafisk embryo

  1. Den neste dagen, fjerne skillet som skiller hver fisk par, og etter 1 time, samle sebrafisk embryo ved hjelp av en finmasket sil og legg dem i en petriskål som inneholder E3 embryo medium (se materialliste for oppskrift).
    MERK: Samle embryoer etter 1 hr sikrer at embryoer er på tilsvarende utviklingsstadier.
  2. Bruk en plast transfer pipette for å fjerne rusk (f.eks mat og fast avfall). Deretter bruker du en stereo å observere hver clutch av embryoer og fjern eventuelle ubefruktede egg.
  3. Dekanter E3 embryo media og erstatte med fersk E3, og deretter plassere hver dish av befruktede egg i en 28.5 ° C inkubator. Etter 2 timers observere hver clutch av embryoer ved hjelp av en stereomikroskop og fjern eventuelle ubefruktede egg.
    MERK: ubefruktede egg kan forgifte andre embryoer og vil synes å være på celle stadiet eller ugjennomsiktig.
  4. Fortsett å overvåke utviklings fremdriften av embryoene ved hjelp av en stereo til de når 40% epiboly. Observer sfæren form av embryoet som ser ut til å være sammensatt av to separate lag på 40% epiboly 40 trinn.

3. Kjemisk Fortynning Forberedelse

  1. Fjern den kjemiske biblioteket plate fra lagring ved -80 ° C, dekke den med aluminiumsfolie, og tine den på RT.
    MERK: Ulike bibliotekene vil tine på ulike priser avhengig primært på løsemiddel som brukes. Typisk vil en kjemisk bibliotek frosset ved -80 ° C, tines helt i ca. 3 timer ved romtemperatur. Butikken tining plate (r) på et trygt sted med passende Hazmat merking. Bruk enppropriate eyewear, laboratoriefrakk, og to sett med hansker ved håndtering av kjemikalier.
  2. Bruke en 8-kanal multikanal pipette for å legge til 99 ul av E3 i kolonner 2-12 i en 96-brønners plate.
    MERK: Fra vår erfaring, er en passende begynnelsen av narkotika varierer fra 10 mm - 50 mikrometer, og også som beskrevet i gjeldende protokoller 39. Her viser vi et 10 mm behandling hvis du bruker en 1 mm kjemisk bibliotek lager plate.
  3. Bruke en 8-kanal multikanal pipette for å legge til en pl av hver forbindelse til sin respektive godt med E3.
  4. Bruk en P10 på å pipettere en ul DMSO (eller det passende oppløsningsmiddel) inn i kontrollkolonnen (her, kolonne 12).
  5. Dekk den kjemiske fortynning plate med aluminiumsfolie, som aluminiumsfolie vil beskytte eventuelle lys-sensitive forbindelser i biblioteket, og returnere lager kjemiske biblioteket platen til -80 ° C for lagring.

4. Oppstillingssebrafisk embryo

  1. Velg en petriskålinneholder sebrafisk embryo på 40% epiboly scenen. Ved hjelp av en overførings pipette, plasser forsiktig omtrent 10 embryoer inne i hver brønn av en (1,1 ml) dyp 96 brønn plate. Dispensere embryoer i kolonner 2-12 av den dype plate med 96 brønner.
    MERK: Forskeren bør velge endepunktet i stoffet tillegg som er best tilpasset den utviklingsprosess de ønsker å avhøre. Anvendelse av et plastoverførings pipette kan minimere skade fosteret. Siden medikamentell behandling før 40% epiboly kan føre til økt embryoletalitet, utvikle embryoene for lengre før legemiddeleksponering, spesielt når senere utviklingsprosesser blir undersøkt. Å plassere mer enn 15-20 embryoer i hver brønn kan føre til forsinket utvikling på grunn av trenging og bør unngås. Det er viktig å merke seg at den dype 96-brønners plate inneholdende embryoene er forskjellig fra den kjemiske fortynning 96-brønners plate.
  2. Bruk et glass transfer pipette for å fjerne overflødig E3 fra hver brønn, og utvise overflødig E3 innen flytende avfallsbeholder.
    NB: Denne prosessen tar vanligvis 30 minutter til 1 time, avhengig av forskeren hastighet, slik at embryoene er mellom 50% og 60% epiboly ved fullføring, som er målet utviklingsstadiet for tilsetningen av kjemikaliet fortynning beskrevet her. Platen kan være skråstilt i 45 ° vinkel for å føre embryoene til å falle til bunnen av brønnen, slik at spissen av pipetten kan presses mot bunnen av brønnen for å trekke av overskudd av E3.

5. Tilsetting av kjemiske behandlinger

  1. Bruke en 8-kanal multikanal pipette for å overføre 100 ul kjemiske fortynninger til de respektive brønner i den dype 96-brønners plate inneholdende grupperte sebrafisk embryoer.
    MERK: Kontroller at den opprinnelige brønnen plasseringen av sammensatte samsvarer med brønnplassering i den tilsvarende dyp 96 brønners plate (f.eks, er B1 brønnplassering i den kjemiske fortynning plate pipetteres til B1 brønnlokasjon i dypetPlate med 96 brønner).
  2. Fukt et papirhåndkle og legg den i en lys-sensitive beholder stort nok til å holde en 96-brønners plate.
    MERK: Den våte tørkepapir vil bidra til å hindre fordamping av kjemiske fortynning.
  3. Deretter bruker du en forsegling matte å forsegle den dype 96 brønners plate, legg den inn i lyset sensitive container, og inkuber det ved 28,5 ° C.
    MERK: La de sebrafisk embryo utvikler før neste morgen. Alternativt la embryoene utvikle seg til den aktuelle utviklingsstadiet for prosessen som analyseres.

6. Fjerning av kjemikalier

  1. Bruke en 8-kanal multikanal pipette for å legge til 300 ul E3 til hver rad av de legemiddelbehandlede brønner. Tegn av og kast E3 / kjemisk fortynning fra hver rad av brønner. Vask embryoene 3 ganger med 300 ul av E3.
    MERK: Kast narkotika-avfall i en merket beholder bare brukes til dette formålet. For enkel vask, bruk en glass-bassenget fylt med E3 bred nok til å bruke multichannel pipette.

7. Pronase og Fikse Sebrafisk embryo

  1. Overfør sebrafisk embryo ved hjelp av en plast overføringspipetten inn i fire 24 brønners plater, og deretter fjerne eventuelle døde embryoer. Label 24 brønners plater slik at de samsvarer med de opprinnelige stoffet brønnlokasjoner. Plasser pipetten foran en mørk bakgrunn etter overføring til hver brønn for å visualisere embryoer i pipetten og for å hindre embryo godt crossover.
  2. Bruk en plastoverførings pipette for å trekke ut E3, slik at embryoene blir knapt neddykket i væske.
  3. Bruke et glass-pipette for å legge til to dråper av pronase lager (50 mg / ml) til hver brønn. La embryo inkuberes i pronase i 5 minutter og deretter omrøre brønnene for å forårsake at chorion å bryte fra hverandre. Alternativt Pronase embryoene før de er på det ønskede utviklingsstadiet for analyse.
  4. Bruk en plast overføringspipetten å vaske embryoene to ganger med E3.
  5. Når embryoene er ved det ønskede stadium av analyse, kompletely trekke av og kast den resterende E3.
  6. Bruk en plastoverførings pipette for å legge frisk 4% PFA / PBS til hver brønn. Inkuber embryoene ved 4 ° CO / N å fikse. Bruk ferske tint PFA å først fikse embryoer.
    MERK: Fortsett å utføre skjermen analysen av interesse. Detaljert her i §§ 8-10 er en prosedyre for å behandle silplatene med WISH. Alternative metoder kan erstattes som ønsket, og deretter gå videre til § 11 og evaluere resultatene.

8. Embryo Permeabilization

  1. Bruk en plastoverførings pipette for å tegne-banen og 4% PFA / PBS fra embryoene og vask to ganger med embryoene 1x (fosfat-bufret saltvann med Tween) PBST. Overfør embryoene i 48 brønners plater, deretter trekke av 1x PBST fra embryoer. Label 48 brønners plater for å matche de opprinnelige brønnlokasjoner fra dypet plate med 96 brønner.
  2. Vask ved å legge 100% metanol til brønnene ved hjelp av en plast overføringspipetten deretter trekke den av og tilsett 100% metanoll igjen til embryoer.
  3. Plasser embryoene ved -20 ° C, og inkuberes i minst 20 min. Alternativt holde embryoene i 100% metanol ved -20 ° C for langtidslagring.
  4. Fjern 100% metanol og vaske embryoene med 50% MeOH / 1x PBST, deretter 30% MeOH / 1x PBST, og til slutt to ganger med PBST 1x.
    MERK: Embryoet eldre enn 24 timer etter befruktning (HPF) kan blekes på dette punktet for å fjerne pigmentering 39.
  5. Tilsett 15 ul opptint proteinase K lager (10 mg / ml) til 50 ml PBST 1x å fremstille en proteinase K (5 ug / ml) arbeidsløsning.
  6. Fjern 1x PBST fra embryoer og tilsett proteinase K arbeidsløsning. Ta av proteinase K etter 4 min.
    MERK: eksperimentator bør arbeide raskt under dette trinnet for å hindre embryo degradering. Proteinase K konsentrasjon og inkuberingsperiode trenger å bli variert avhengig av alderen av embryoene som blir behandlet 41. De parametre som er beskrevet her angår embryoersom er 24 HPF.
  7. Vask embryoene med 1x PBST, deretter legge iskald 4% PFA / PBS. La embryoene inkuberes i 4% PFA / PBS i 20 min ved RT.

9. Hybridisering og Probe Removal

  1. Ved hjelp av en glass overføringspipetten fjerne 4% PFA / PBS og vaske embryoene to ganger med 1x PBST. Sett på 1x PBST med 500 mL av HYB + og inkuber embryoer for 4 timer ved 70 ° C.
    MERK: Pre-hybridisering kan utføres for så få som to timer, men 4 timer er ideelt. Dessuten kan forskjellige hybridisering og vasketemperaturer være ideelt for enkelte sonder, for eksempel 65 ° C, men bør testes på individuell basis.
  2. Generer digoxygenin-merkede riboprober som tilsvarer genet (er) av interesse 41.
  3. Legg 16 mikrogram av riboprobe til 16 ml HYB +. Pre-varme riboprobe / HYB + løsning ved 70 ° C i minst 20 min før bruk. Hvis du bruker flere sonder, legger 16 mikrogram av hver sonde til samme HYB + volum (16 ml).
  4. Ved hjelp av en glass transfer pipette, fjern HYB + og bruke en P1000 å legge på 200 mL av riboprobe / HYB + blanding. Snu riboprobe / HYB + cocktail like før bruk og pipetter opp og ned en gang før du legger blandingen i hver brønn. Bruk barriere pipettespisser for å legge til riboprobe / HYB + løsning, forhindrer denne blandingen dampen kommer inn i pipetten.
  5. Inkuber embryoene i riboprobe / HYB + cocktail ved 70 ° CO / N. Bruke et klebefilm for å dekke platebrønner for O / N-probe inkubering og alle de følgende varme vask.
  6. Forbered 50% formamide / 2x SSCT, 2x SSCT, og 0,2x SSCT og pre-varm ved 70 ° CO / N.
  7. Ved hjelp av en P1000, fjern riboprobe / HYB + og lagre blandingen ved -20 ° C. Eventuelt re-bruker riboprobe / HYB + blanding opp til tre ganger. Før hver gjenbruk, legg i 3 mikrogram av riboprobe til den opprinnelige riboprObe / HYB + blanding.
  8. Ved hjelp av en glassoverførings pipette, vaskes to ganger med embryoer 50% formamid / 2 x SSCT i 30 minutter ved 70 ° C. Vask en gang med embryoene 2x SSCT i 15 min ved 70 ° C. Vask embryoene to ganger med 0,2 x SSCT i 30 minutter ved 70 ° C. Fjern 0,2x SSCT og vaske embryoene med MABT to ganger på RT.

10. Anti-digoxygenin Antistoff Inkubasjon og Detection

  1. Bruk en glassoverførings pipette for å fjerne MABT fra hver brønn. Bruk en plast transfer pipette, tilsett frisk blokk løsning til hver brønn. La embryoene inkuberes i blokk i 4 timer ved RT. Legg 8 ul av anti-digoxygenin antistoff til 40 ml av blokk-løsning (5000-gangers fortynning).
  2. Bruk en plast transfer pipette, erstatte blokkløsning med antistoffet / blokk løsning. Legg nok antistoff / blokk løsning for å fullstendig dekke embryoer.
  3. Dekk til 48 brønners plate med aluminiumsfolie, slik at ikke lys kan trenge gjennom til embryoer. IncUbate embryoene O / N ved 4 ° C. Ved hjelp av en glass pipette, fjern antistoff / blokk løsningen og vask embryoene 10 ganger med MABT for 5-10 min hver.
    MERK: MABT vasker kan utføres kontinuerlig, som det vil ta forskeren 5-10 min å fjerne MABT fra hver tallerken og dispensere frisk MABT i brønnene.
  4. Generere to rør av 40 ml (80 ml totalt) av pre-farging buffer. Legg 180 ul NBT (50 mg / ml) og 140 ul av BCIP (50 mg / ml) til en av de fremstilte rør av pre-farging buffer for å skape den fargeløsning.
    MERK: Denne fargeløsning vil generere en lilla farget underlag.
  5. Sett på MABT med pre-farging buffer og la embryoene inkuberes ved RT i 5 min.
  6. Sett på pre-flekker buffer med fargeløsning og la på RT. Overvåk kolo reaksjon hvert 15 min ved hjelp av en stereomikroskop.
    MERK: Farging reaksjoner kan ta fra noen minutter til mange timer avhengig av sonden.
  7. Repsnøre fargingsoppløsning med 1x PBST etter fargingsreaksjonen er fullført, og deretter vaske embryoene to ganger med PBST 1x i 5 min.
  8. Fjern 1x PBST og tilsett 4% PFA / PBS å fikse embryoer.
    MERK: Du kan også utføre en dobbel WISH å oppdage riboprober merket med en anti-fluorescein antistoff. Hvis du utfører en dobbel in situ, hopper legge 4% PFA / PBS (trinn 10.9) etter 1x PBST vask (trinn 10.8) og vaske embryoene to ganger i 15 min med 0,1 M glyserol, to ganger i 15 min med MABT vasker, og deretter ruge embryoer for 30 min i blokken. Deretter legge på det riktige antistoff O / N og utføre trinn 10.03 til 10.09 med riktig fargeløsning. Å oppdage fluoroscein-merket riboprobe, utarbeide en fargeløsning med BCIP og INT å observere en rød substrat (se trinn 10.1).

11. scoring Kjemisk Screen embryo Plates

  1. Utfør visuell scoring av resultatene ved hjelp av en stereomikroskop for å evaluere embryo samples i fenotype analysen.
  2. Bruk en plast transfer pipette, overføre embryoene fra 48 brønners plater til 12 brønners plater for optimal visualisering. Etiketten de 12 brønners platene slik at de samsvarer med brønn steder fra den opprinnelige dyp 96 brønn plate. Når overføringen er fullført, se under stereomikroskop.
    MERK: Representative embryoer kan velges fra 12-brønners plater og avbildes på objektglass under et dekkglass 41.

Representative Results

Den manuelle tilnærmingen beskrevet her åpner for en enkelt forsker å effektivt og vellykket gjennomføre en høy gjennomstrømming små molekyl kjemiske genetikk skjermen bruker sebrafisk embryo modellen (figur 1). Ved hjelp av denne metoden, er det praktisk for en enkelt person å utføre en kjemisk genetikk skjermen, slik at i løpet av 9 uker én person (forpliktet til en 40 timers arbeidsuke) kan gjennomføre en undersøkelse av ~ 600 forbindelser (figur 1) . Således kan benken tidspunktet for en person å omgå behovet for høy ressurskrevende utstyr, som automatiserte systemer. Avveiningen er at en manuell skjermen krever flere uker med dedikert innsats. I motsetning til dette, kan bruk av automatiserte systemer komprimere den tiden som er involvert i 1-2 uker med robot tid, og kan innebære forholdsvis minimal innsats generelle forsker. En måte å øke effektiviteten og / eller omfanget av en manuell skjermen er å verve 2-3 forskere totalt, noe som ville muliggjøre screening av more forbindelser, varierende konsentrasjon av forbindelsen, og / eller sikting over en kortere tidsperiode.

De primære trinnene involvert i protokollen for å fullføre en kjemisk genetikk skjermen i sebrafisk embryo med et ønske avlesning er illustrert som et flytdiagram (figur 2). De eksperimentelle oppgaver kan deles inn i to typer arbeids uker: (1) kjemisk eksponering og embryo merking, og (2) for analyse og avbildning. I kjemisk eksponering arbeidsuke, inkluderer disse trinnene sette opp sebrafisk voksne (Dag 1), embryo samling, oppstillingsanordninger embryoer og medikamentell behandling (Dag 2), forbereder embryoer for in situ hybridisering (dag 3), og in situ hybridisering (Dag 4 -6). I analysen / bildebehandling uke, analyserer forskeren mRNA uttrykket å score embryoer og bilde treff (dag 7-11).

En viktig del av å utføre en kjemisk genetikk skjermen er å konsekvent og nøyaktig merke godt steder. Som kjemiske genetikk skjermen process detaljert her innebærer overføring sett av embryoer fra en brønn i en plate til en brønn i en annen plate flere ganger, er behovet for presis og sikker merking av største betydning, slik at når en kjemisk treff blir mottok det kan være lineært, og kan enkelt spores tilbake til sin identitet i den kjemiske bibliotek (figur 3). En enkel måte å sikre dette på er å merke at platene på en slik måte at til enhver tid brønnen plassering for et sett av embryoer behandlet med en forbindelse som samsvarer med den kjemiske bibliotek medikamentplate brønnlokasjon av forbindelsen brukes til å behandle disse direkte embryoer (figur 3). Her er et dual system av fargekoding og numeriske etiketter benyttes til å organisere prøvene, som ble lagt til silplatene bruker permanente markører (figur 3).

Mens å analysere resultatene fra en high-throughput-skjermen, er det et kritisk behov for å utvikle en fremgangsmåte for å organisere fullstendig, kommentere, og analysere potensial lite molekylhits. Derfor må en kjemisk genetikk skjermen har en grundig og tydelig karaktersystem som er nøye utformet og strengt overholdt. Et slikt system bør lett og fullstendig formidle de viktige dynamikken i en forbindelse og gi en kortfattet måte å presentere resultatene av den ferdige skjerm. En måte å konstruere et slikt system er å gradere embryoer som anvender en klasse systemet, noe som ville forklare generelle morfologiske alvorlighetsgrad og tillit av en hit. Videre kan de klassekategorier være kombinert med et (+) eller (-) for å beskrive enten en ekspansiv eller reduserende effekt på område (r) av interesse. Her ble sebrafisk embryo utsatt for enkelte forbindelser fra et bioaktivt bibliotek (Enzo Chemicals) fra 50% epiboly til 24 HPF, og deretter analysert ved WISH hjelp av en cocktail av tre riboprober å oppdage nephron segmenter (Figur 4A). Som et eksempel karaktersystem, en brønn som inneholder en gruppe av embryoer som hadde en dramatisk utvidet proksimale convoluted tubuli (PCT) av pronephros, sebrafisk embryoniske nyre, ville føre til at forbindelsen brukes til å behandle vel som å bli kategorisert som (klasse I), som i dette tilfelle ville representere klassen forbundet med den mest alvorlige defekter, og det høyeste nivå av tillit til fenotype observert (figur 4B). Forbindelsen vil da bli merket med (PCT) og en (+), blir den komplette notasjon (klasse I - PCT +) (figur 4B). Dette konseptet om klassifisering gir en enkel og rask måte for å beskrive en kammer av informasjon vedrørende et lite molekyl av interesse, inkludert alvorligheten av forbindelsene effekt på organismen, regionen som er påvirket av medikamentet og den måte på hvilken regionen er påvirket (figur 4B).

Figur 1
Figur 1. & #En forsker kan feasibly teste Manuell sebrafisk embryo kjemisk skjermen strategi en 96 brønners plate av kjemikalier på sebrafisk embryo og utføre påfølgende WISH behandling i løpet av en uke, 160.. Utføre to uker med kjemiske tester (Uke 1 (dag 1-6) og Uke 2 (dag 7-12)) kan pares med en tredje uke dedikert til å prøve analyse. Omtrent to 96 brønners plater igjen av skjerm prøver kan scores og avbildes Uke 3 (dag 13-17). Dette scenariet beløper seg til screening av omtrent 200 forbindelser i en 3 ukers periode, noe som tilsvarer en liten bibliotek av ca. 600 helt forbindelser filtrert av 9 uker. Denne håndboken strategien kan endres avhengig av tilgjengelige ressurser. For eksempel kan tre forskere redusere tiden for å fullføre en skjerm på omtrent 600 forbindelser til 3 uker sammenlignet med de ni ukene det ville ta med en forsker. Screeningstrategier kan tilpasses ved å tildele forskere til spesifikke aspekter av skjermen, for eksempel narkotika godbitling og in situ hybridisering eller å dirigere forskere for uavhengig å utføre hele prosessen screening på separate deler av den kjemiske bibliotek.

Figur 2
Figur 2. Flytskjema:. Nedbryting av 6 dagers skjermen arbeidsflyt kan Den kjemiske screening prosessen diskret brutt ned i seks dager. Dag 1 består av å sette opp sebrafisk passende par (= /> 25) å gi embryoer for hver plate med 96 brønner skal skjermes. Dag 2 embryoer fra innebærer å samle de samvirkende kammer og arraying dem i en dyp 96 brønn plate, etterfulgt av medikamentbehandling. På dag 3 embryoer er forberedt for WISH, inkludert dechorionation, vev fiksering, og embryo dehydrering. Endelig er WISH utført på embryoene gjennom Day 4-6. Vær oppmerksom på at alternative farvningsprosedyrer på faste eksemplarer kan være lett substituted for WISH.

Figur 3
Figur 3. Plate transfer merking skjematisk. Sebrafisk embryo er kledd og narkotika behandlet i en 96 brønners plate deretter flyttet til en 24 brønners plate for rusk fjerning og pronase eksponering. Embryoene blir deretter flyttet til 48 brønners plater for embryo forberedelse, WISH, og vev fiksering. Deretter blir embryoer overføres til 12 brønners plater for scoring, bildebehandling, og lagring. Presis oppstillings av embryoer oppnås ved bruk av et fargekodesystem som gjør det mulig for forskeren å holde styr på den kjemiske opprinnelsesland for hver prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 Figur 4. Eksempel karaktersystem. Nyre segmentering analysen A WISH eksperiment gjør forskeren å farge spesifikke celletyper basert på identiteten til sondene som er valgt, slik at evalueringen av endringer i embryo fenotyper i henhold til endringer i mRNA transkripsjon plassering og / eller nivåer. Som et eksempel, tre segmenter av sebrafisk embryoniske nyre, de pronephros, ble merket ved å bruke skjerm Mix 1. Skjerm Mix 1 er en cocktail av prober består av wt1b, som spesifikt lokaliseres i podocytes (P), slc20a1a som markerer den proksimale viklet tubule (PCT), og slc12a1 hvilke etiketter distale tidlig (DE) segment 47. A (+) symbolet ved siden av en region etikett brukes til å kommentere utvidelse eller positiv forskyvning av at regionen, mens en (-) symbolet brukes til å diktere diminishment av en region. Her, embryos stoffet behandles med 13-cis RA har en forstørret proksimale nyretubuli og et fullstendig tap av distal tidlig segment med ingen åpenbare effekt på podocytes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Kjemiske genetikk i sebrafisk kan gjøre en avgjørende innvirkning på utviklingen av nye medisiner. Denne protokollen gir en manuell høy gjennomstrømming metode for å utføre kjemiske genetikk i sebrafisk embryo med en WISH lese-out, effektivt slik at en enkeltperson eller lite team for å gjennomføre et lite molekyl skjerm. Dette minimal-ressurs metoden utvider muligheten for kjemiske genetikk mange forskningsgrupper. Spesifikt tilveiebringer denne skjermen strategi et viktig alternativ til bruk av robot instrumentering, da slike systemer er ikke bredt tilgjengelig på tvers av forsknings- institutter. Denne håndboken skjermen gjør at en enkelt person til å teste en 96 brønners plate av forbindelser med en WISH avlesning i en 6 dagers arbeidsuke. Siden sebrafisk er oviparous, med embryoene utvikler utenfor forelder, og embryoene er store nok til å se med det blotte øye (mellom 1-3 mm), de er mottagelig for manuell håndtering med enkle instrumenter og forskeren kan array-prøvene imulti-brønnplater uten bruk av et mikroskop. Videre, siden sebrafisk utvikle seg raskt, kan lite molekyl eksponeringen være effektivt med en enkelt behandling av en forbindelse, i stedet for gjentatte doser, noe som minimaliserer ytterligere manuell behandling. Sebrafisk embryo er lette å dyrke fordi deres plomme gir næring opp til 5-6 dager etter befruktning, noe som eliminerer komplikasjon av yngel fôring. I tillegg har de fleste av larve organer utvikles og bli funksjonelle i denne perioden, noe som gir mulighet til å studere et bredt spekter av problemstillinger. Den enkle tilsetning av små molekyler til embryoet inkubering mediet er ikke-invasiv og tillater forskeren (e) å selektere for medikamentdose, tidspunktet for tilsetning, og varigheten av eksponeringen-og dermed gi stram kontroll over mange variabler, og slik at for spesifikke utviklingsprosessene av interesse som skal spørres. Som beskrevet her, kan betydelig forskning produktivitet oppnås på kort timeframe du leser denne håndboken skjermen metodikk. Etter vår erfaring er det en høy avkastning på investert innsats, noe som kan fremheves ved hjelp av en kjent bioaktive kjemiske biblioteket for å analysere en prosess av interesse, for eksempel nephron segmentering under nedsatt utvikling (Figur 4, Poureetezadi og Wingert, upublisert).

Den manuelle kjemiske skjermen beskrevet her er usedvanlig allsidig fordi det innebærer en analyse på faste sebrafisk prøver. For eksempel kan denne strategien revideres for å teste flere plater av forbindelser i en uke og deretter å score embryoer følgende uke. Alternative analyser på faste prøver sebrafisk, som for eksempel immunhistokjemi eller annet vev fargingspreparater, kan også bli anvendt istedenfor WISH utlesning. Eksperimentelle strategier for å utføre cellulære tester i sebrafisk er tilpasningsdyktig på grunn av optisk klarhet og åpenhet i tidlige utviklingsstadier. Videre kan forskerne hemme pigmentering på senere statot bruk av kjemikalier eller unngå komplikasjoner av pigment utvikling helt gjennom bruk av pigment mindre genetiske linjer som casper eller ren sebrafisk 13. Det er mulig å administrere små molekyler manuelt, behandle flekken (r) av interesse, og for å plassere ballen embryoer manuelt ved hjelp av en enkel stereomikroskop. Det er imidlertid viktig å huske på at automatisert bildeanalyse kan utføres, og kan faktisk være nødvendig for høyoppløselig fenotype analyse. For eksempel kan det være foretrukket å samarbeide en automatisert bildeanalyse-system med en direkte analyse, for eksempel en transgen reporter, da dette forenkler den manuelle behandling av prøver, kvantifiserer forskjellen ikke er så lett synlige for det blotte øye, og eliminerer forsker skjevhet 15. Heldigvis, noen automatiserte bildesystemer er både brukervennlig og økonomisk i forhold til programvarekostnader 15. Bruk og evnene til andre automatiserte systemer har raskt utviklet seg og kanbli brukt til å orientere organismer, administrere medikamentelle behandlinger, og selv å flytte organismer 12,15. Disse automatiserte systemer har innledet en ny teknologisk alder av forskning og har gitt innovative løsninger for å manipulere store mengder testpersonene og dermed utføre HTS og HCS tilnærminger i hele organismer 12,15. Mens slike maskiner er unektelig nyttige verktøy, de er også svært kostbart og er ute av rekkevidde for mange grunnleggende forskningslaboratorier. Uten tilgang til disse automatiserte evner kan det virke som kjemiske skjermer er ikke mulig. Men skisserer denne protokollen en guide for hvordan du kan gjennomføre en manuell skjerm som kan brukes til å fullføre en kjemisk genetikk skjermen på en praktisk måte over en rimelig tidsperiode.

Ulemper for både manuelle screening og kjemiske genetikk generelt finnes, og bør holdes i bakhodet når de vurderer en kjemisk skjerm. Spesielt er fremgangsmåten vist her nødvendiggjør en moderat gradav fysisk fingerferdighet. Denne bekymringen er redusert eller helt unngås gjennom repetisjon, som fingerferdighet vil forbedre med praksis. I tillegg er det minimalt rom for grov feil, så er det bare ti embryoer per brønn for analyse. Små molekyler kan variere i pene av fenotype som er indusert, så en rimelig scoring diett for å identifisere forbindelser av interesse må følges. Det er viktig at forskerne benytter denne protokollen utarbeide passende strenge kriterier for hva de vil vurdere en hit. Det er også viktig å huske på at innholdet i denne formen for skjermen vil mest sannsynlig gi en viss andel av falske positiver, som kan avgrenset gjennom videre kjemisk work-up. Videre er det avgjørende å stadium embryoer nøyaktig og å samle clutcher for screening kort tid etter befruktning, som asynkron utvikling kan føre til komplikasjoner i nøyaktig evaluering av virkningen av narkotika behandlinger. Videre, i forhold til kjemisk screening som en experimental strategi, er det en rekke begrensninger. Forbindelse løselighet og toksisitet av bærermolekyler (for eksempel, dimetylsulfoksid (DMSO)) kan også utgjøre et problem, og kan være prohibitive i å teste mange molekyler. Chorion kan også fungere som barriere for legemiddeleksponering. Til slutt, selv om sebrafisk er en kraftig og translasjonelle modell for kjemiske genetikk, forsiktighet bør alltid tas for å bestemme hvorvidt en alternativ kjemisk skjermen strategi, f.eks, ved hjelp av et in vitro-system som for eksempel en cellelinje, kan substitueres for bruk av hele dyr. Ikke desto mindre er kjemisk behandling i det hele sebrafisk systemet ansett å foretrekke å gjennomføre lignende tilnærminger i pattedyr, da det gir den fordel at samle de systemiske virkninger av forbindelsene, og kan gjøre det mulig å forskere triage listen av forbindelser som skal testes i en pattedyr modell.

Hittil har sebrafisk kjemiske skjermer gitt en kraftig eksperimentelt verktøy to avgrense mekanismene for utvikling og å fastslå kandidat farmakologiske midler for anvendelse innen medisinen, så som identifisering av molekyler som er i stand til å forhindre sykdoms patologier. For eksempel, en studie av Burns og kolleger utviklet en automatisert mikro godt analysen for hjertefrekvens ved hjelp av transgene sebrafisk embryo som uttrykte GFP i hjertemuskelen 42. De brukte denne transgen linje for å analysere hjertefrekvens under utvikling og hvordan den ble påvirket ved medikamentell behandling 42. En annen studie, ved å teste befolkningstettheten av blodkreft stamceller i sebrafisk embryo, identifisert som prostaglandin E2 regulerer HSC nisje 23. Dette funnet ble validert i mus, og ble senere tatt for klinisk testing i menneskelige navlestreng transplantasjoner 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Gjennom flere nyere studier, har kjemiske genetikk vist seg å være nyttig i å studere nyresykdom ved hjelp av sebrafisk 43. Nephron strukturen er svært konservert mellom sebrafisk embryonale nyre og den voksne pattedyr nyre 44-50. Flere studier har undersøkt sebrafisk embryonale nyre tydelig illustrerer dens iboende translasjonell potensial når kombinert med kjemiske genetikk. En kjemiske genetikk skjermen ble utført på to sebrafisk mutanter som ble kartlagt til gener pkd2 og ift172, som er kjent for å være sentrale aktører i polycystisk nyresykdom (PKD) 34. Skjermen resulterte i å identifisere den pan-histondeacetylase (HDAC) hemmer trichostatin A (TSA) som et lite molekyl som kan oppheve morfologiske defekter normalt sett i de muterte embryoer. En annen tilnærming tatt av de Groh og kolleger vist for forbindelser som induced ødem i villtype sebrafisk embryo, noe som skulle tilsi en forstyrrelse i nyrefunksjon 35. Etter identifisering av PTBA som et treff, observerte de at i tillegg til å forårsake ødem, øket PTBA også ekspresjonen av pax2a, en markør for nyre progenitorer. Viktigere, en optimalisert derivat av PTBA ble deretter vist å redusere den prosentvise dødelighet av voksne sebrafisk som gjennomgikk gentamicin-indusert nyreskader og videre, akselerert utvinning av musene som led av nyreskade 27. Samlet utgjør disse bidrag fra sebrafisk kjemiske genetikk presentere hvilke typer funn som kan gjøres ved hjelp av metoden beskrevet i denne protokollen.

Mens kjemiske genetisk forskning bærer betydelig fortjeneste, er det ikke uten visse utfordringer. Utelukkende ved hjelp av en kjemisk genetikk tilnærming kan gjøre det komplisert å fastslå den spesifikke gen eller gener som blir berørt av en sammensatt. Selv om en kilde (r) er funnet, en sibetydelige materielle gap kan forbli mellom forbindelse identifisering og forstått mekanisme (r) for virkning, hvor den oppfører seg lite molekyl. For eksempel kan det være vanskelig å bestemme den mekanisme der et lite molekyl, opptrer fordi en enkelt forbindelse er i stand til å ha en rekke forskjellige effekter i en organisme. Men med bruk av ny teknologi og flere kjemiske genetiske skjermer blir gjennomført i sebrafisk, er problemet med å bestemme en mekanisme krymper. En metode for å fastslå de molekylære effekter av identifiserte forbindelser er å velge et stoff bibliotek av kjente bioactives for screening, hvor mekanismer kan potensielt utledes fra tidligere kommenterte data. I tillegg chemoinformatic algoritmer, som Discovery gate, er tilgjengelig for bruk som kan sammenligne strukturelle likheter med et sammensatt mot en database av forbindelser med tilskrevet mekanismer 14. Enda en annen måte å belyse mekanismen av en forbindelse ville være å generere en MICRoarray profil etter behandling og deretter spørre denne profilen i en samling av microarray narkotika profiler, slik som Connectivity kart, søker etter mechanistically definerte forbindelser som lokke fram en lignende effekt 14. Denne fremgangsmåten kan også brukes for å identifisere genetiske mutanter som har en lignende virkning som forbindelsen av interesse. Å finne en forbindelse mellom en forbindelse og en mutant kan tyde på at forbindelsen virker molekylært oppstrøms eller nedstrøms av den tilknyttede genet, som kan være avgrenset ved behandling av mutanter med forbindelsen og morpholinos. Et annet alternativ ville være massespektrometri, som fortsetter å bli mer optimalisert for sebrafisk. Denne fremgangsmåte kan anvendes for å avgrense bestemte protein endringer eller post-translasjonelle modifiseringer etter medikamentbehandling. Til slutt, små molekyler eller hele biblioteker er ofte i stand til å bli merket for pull-down av bindingspartnere. Det er også verdt å merke seg at mens mekanismen for hvordan et lite molekyl funksjoner is av betydelig import, det er FDA-godkjente legemidler for hvilke mekanismer forblir ukjent.

Selv om sebrafisk utviser mange likheter til pattedyr både genetisk og fysiologisk, er det fortsatt et problem for narkotika crossover 14. En studie undersøkte crossover evnen av hits fra en skjerm for cellesyklus hemmere i sebrafisk embryo 50. Skjermen resulterte i identifisering av 14 treff som tidligere var ukjent å ha cellesyklus aktivitet. Ut av disse 14 forbindelsene, 6 ble funnet å ha cellesyklusaktiviteten i både humane og sebrafisk cellekulturanalyser, 3 ble vist å være inaktivert serum i cellekulturanalyser, 1 var aktiv bare i sebrafisk celler, og 4 ikke hadde noen aktivitet i enten sebrafisk eller menneskelige cellekultur-analyser, men bare i sebrafisk hele organismen. Spesielt de fire forbindelser som bare hadde aktivitet i sebrafisk viser at det er forskjeller mellom sebrafisk og pattedyr som kan prohibet det translasjonelle potensialet av visse forbindelser. Dette er en viktig faktor å være oppmerksom på, men det finnes eksempler på små molekyler, som PGE2 som forsterker evnen til HSCs å innpode i menneskelige mottakere og PTBA-derivater som forbedrer hastigheten av nedsatt bedring hos pattedyr, og dermed gi bevis av prinsippet om at crossover er mulig 23,31-33.

Uavhengig av disse fallgruvene, kjemiske genetikk og dette minimal-ressurs tilnærming har mye å tilby forskersamfunnet. Kjemiske genetikk er spesielt nyttig i sebrafisk og vil fortsette å spille en avgjørende rolle i molekylær pathway forhør og nye medisiner. Kjemiske skjermer basert på diskrete molekylære mål har historisk sett vært gjenstand for en høy strykprosent på grunn av det som er kjent som den konstellasjon av adsorpsjon, distribusjon, metabolisme, utskillelse og toksikologiske (ADMET) egenskaper 51. Kjemiske skjermer utnytte sebrafisk tilfokusere på en prosess, heller enn en diskret målet, kan omgå ADMET flere problemer, og å identifisere forbindelser som er effektive i sammenheng med hele organismen. Med den økende pool av ressurser som er tilgjengelige for sebrafisk undersøkelser, blant annet aktuelle mutantstammer og evnen til å bruke genom redigering for å lage målrettede genetiske mutanter og transgene, er det praktisk talt et ubegrenset antall potensielle kjemiske genetiske skjermer ved hjelp av sebrafisk. Mange kjemiske bibliotekene har blitt kuratert, og span samlinger med kjente bioactives, nye forbindelser, strukturelt varierte og liknende struktur. Disse reagenser gir et vell av spennende muligheter for skjermbildekombinasjoner som er tilgjengelige og kan forventes å ytterligere øke i de kommende årene. Med disse mulighetene i hånden, gir denne håndboken og høy gjennomstrømming protokollen en praktisk og brukervennlig måte å øke evnen til forskningsgrupper å gjennomføre kjemiske genetiske skjermer bruker sebrafisk.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler til Wingert forskningslaboratorium fra følgende: National Institutes of Health gir K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar stipend award # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science og Institutt for biologi; og en sjenerøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Michael Gallagher på vegne av Gallagher Family å fremme stamcelleforskning. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Paul T. Kroeger, Jr. for å gi kritiske tilbakemeldinger på manuskriptet. Vi takker de ansatte på Institutt for biologi for deres støtte, og Center for Sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt vil vi takke alle medlemmer av vår research lab for sine kommentarer, diskusjoner og innsikt om dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 - 10 μl natural pipet tips USA Scientific 1111-3800
1x E3 Generate using 50x E3 and DI water.
1x PBST Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS.
10x PBS American Bioanalytical AB11072
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
20x SSC American Bioanalytical AB13156
24 well plate BD-Falcon 35-3226
4% PFA/1x PBS Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 °C.
48 well plate CytoOne CC7672-7548
50x E3 Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water.
96 deep well plate VWR 100-11-940
96 well plate sealing mat VWR 10011-946
anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Keep at -20 °C.
BCIP stock Sigma B8503 Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 °C.
block solution Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.)
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.)
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Consult the manufacturer procedure.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
embryo incubation dish Falcon 35-1005
epT.I.P.S 20-300 μl Eppendorf 22492284
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C.
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Keep at -20 °C.
filter sterilization unit Corning 430516 0.45 μm CA / 1 L volume
fine forceps Roboz RS-1050
flat-bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Formamide American Bioanalytical AB00600 Keep at -20 °C.
glass basin 90 x 50 Kimax Kimble 23000
glass pipette VWR 14673-010
glass vial Wheaton 225012
glycerol Sigma G7893
glycine Sigma G8898
glycogen Roche 10901393001
HYB+ Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 μl/μl heparin
INT stock Sigma I8377 Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 °C.
MAB Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2 L and autoclave.
MABT Generate 0.1% Tween-20 in MAB
MeOH Sigma 34860-4L
mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
multi 8-channel pipette 0.5 - 10 μl Eppendorf 3122000.019
multi 8-channel pipette 30 - 300 μl Eppendorf 3122000.051
nanodrop Thermo ND-2000c
NBT stock Sigma N6876 Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 °C.
paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
PCR-Film adhesive Eppendorf 30127.48
plate container (Pencil Box) Sterilite 1722
pre-staining buffer Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)
Pronase Roche 11459643001 Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 °C.
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 °C.
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
rubber bulb Fisherbrand Fisher Scientific 03-448-22
staining solution-purple N/A N/A Generate using 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.
staining solution-red Generate using 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.
stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
transfer pipet Samco 202, 204
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
waterbath Thermo 51221073 (Model # 2831)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
  2. Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  4. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  5. Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
  6. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
  7. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  8. Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
  9. Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
  10. Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
  11. Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
  12. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
  13. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
  14. Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3 (5), 454-460 (2010).
  15. Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
  16. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
  17. Peterson, R. T., Fishman, M. C. Designing zebrafish chemical screens. Methods Cell Biol. 105, 525-541 (2011).
  18. Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
  19. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  20. Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
  21. Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
  22. Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
  23. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  24. Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
  25. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  26. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
  27. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
  28. Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
  29. Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
  30. White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
  31. Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
  32. Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
  33. Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
  34. Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
  35. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
  36. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
  37. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
  38. Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
  39. Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
  42. Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
  43. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
  44. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
  45. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
  47. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
  48. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  49. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
  50. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  51. Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
  52. Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).

Tags

Developmental Biology sebrafisk kjemiske genetikk kjemiske skjermen, medisiner hele mount high-throughput screening (HTS) high-innhold screening (HCS)
En manuell Small Molecule Screen Nærmer Høy throughput Bruke Sebrafisk embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., … More

Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063, doi:10.3791/52063 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter