Summary
Zebrafisken er en fremragende eksperimenterende organisme for at studere hvirveldyr udviklingsprocesser og human sygdom model. Her beskriver vi en protokol om, hvordan du udfører en manuel high-throughput kemisk skærm i zebrafisk embryoner med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) udlæsning.
Abstract
Zebrafisk er blevet en udbredt model organisme til at undersøge de mekanismer, der ligger til grund for udviklingsbiologi og til at studere human patologi på grund af deres betydelige grad af bevarelse af genetiske med mennesker. Kemiske genetik indbefatter afprøvning den virkning, at små molekyler har på en biologisk proces, og er ved at blive en populær translationel forskning metode til at identificere terapeutiske forbindelser. Zebrafisk er specielt tiltrækkende bruge til kemiske genetik på grund af deres evne til at producere store koblinger gennemsigtige embryoner, der er eksternt befrugtede. Endvidere kan zebrafisk embryoner let stof behandlet ved simpel tilsætning af en forbindelse til embryo medier. Brug hel-mount in situ hybridisering (WISH), kan mRNA-ekspression klart visualiseret inden zebrafisk embryoner. Sammen med kemiske genetik og WISH bliver zebrafisk en potent hel organisme kontekst, som at bestemme den cellulære og fysiologiskevirkningerne af de små molekyler. Innovative fremskridt er blevet gjort i teknologier, der udnytter maskine-baserede screening procedurer, men for mange labs sådanne muligheder ikke er tilgængelige eller forblive omkostnings-prohibitivt. Protokollen beskrevet her forklarer, hvordan man kan udføre en manuel high-throughput kemisk genetisk skærm, der kræver grundlæggende ressourcer og kan gennemføres af en enkelt person eller lille hold på en effektiv periode. Således er denne protokol giver en realistisk strategi, der kan implementeres af forskergrupper at udføre kemiske genetik i zebrafisk, som kan være nyttige for at opnå grundlæggende indsigt i udviklingsprocesser, sygdomsmekanismer og identificere hidtil ukendte forbindelser og signalveje, der har medicinsk relevante applikationer .
Introduction
Identifikationen af effektive terapeutiske lægemidler til behandling af sygdomme hos mennesker er det slutspil for mange biomedicinske forskere. Mens identifikation og karakterisering af potentielle farmakologiske midler til kliniske anvendelser har indlysende værdi for sundhedsydelser, har det været en stor udfordring. I sidste ende er udviklingen af mange terapeutiske forbindelser kommer fra viden om, hvordan specifikke celletyper enten udvikle eller funktion. Den zebrafisk, Danio rerio, er en ferskvands teleost af familien Cyprinidae der er blevet en mainstream model organisme i udviklingsmæssige biologi 1. Zebrafisk er genetisk medgørlige hvirveldyr, der er nemme at vedligeholde og manipulere for videnskabelige studier 2,3. Zebrafisk embryo er gennemsigtig, eksternt befrugtet, og kan fremstilles ved de hundredvis fra en enkelt voksen parring par i kun en uge 2,3. Endvidere zebrafisk andel større organsystemer og besidder en stor degree af genetisk lighed med pattedyr, herunder mennesker 4. Slående, 70% af de menneskelige gener har en zebrafisk ortholog 4. På grund af denne lighed er zebrafisk været et yderst relevant eksperimentelt system til at undersøge de mekanismer, hvirveldyr udvikling og fysiologi, og er blevet anvendt til at rekapitulere et væld af humane sygdomme 5-7. Disse grunde, blandt andre, har gjort zebrafisk en ideel kandidat til at fortsætte genetiske forhør og har resulteret i en stadigt stigende forståelse for anvendeligheden af zebrafisk i biomedicinsk forskning 6,7.
Gennem de seneste årtier har en overflod af genetiske værktøjer blevet udviklet i zebrafisk. Zebrafisk genom er modtagelig for mutagenese og gensplejsning 3. Til dato har en overflod af forlæns og baglæns genetiske undersøgelser blevet udført, hvilket fører til dannelsen af mere end 9.000 mutanter 3. Desuden talrige transgene linjer har væreen oprettet, som har gjort det muligt for mærkning og isolering af specifikke celletyper 3. Der er sket betydelige igangværende bestræbelser på at centralisere og distribuere disse ressourcer til forskningen, der er tilgængelige for laboratorier ved en temmelig lav pris gennem zebrafisk International Resource Center (zirco) 8. Yderligere et omfattende arkiv af biologisk information og molekylære værktøjer, der spænder fra genekspressionsmønstre at morfolino sekvenser og protokoller, er gradvis blevet kommenteret på zebrafisk Information Network (ZFIN) 9-11. Disse zebrafisk forskningsinfrastruktur er blevet gjort mulig gennem en betydelig NIH støtte og fortalervirksomhed for denne dyremodel 8. Denne cache af zebrafisk mutanter, transgene linjer og relevante oplysninger fortsætter med at være af usædvanlig værdi for den biologiske forskning samfundet som helhed. Men mens zebrafisk er nu en veletableret og fremtrædende model organisme, de repræsenterer en largely uudnyttet reservoir til at studere udviklingsmæssige biologi og sygdom gennem anvendelse af kemiske genetiske skærme.
Kemiske genetik er anvendelsen af små molekyler, såsom lægemidler eller andre forbindelser, for at påvirke en biologisk proces i et levende system 12. Kemiske genetik kan gennemføres for at forstå de molekylære mekanismer i gen funktion, såsom at identificere midler, som rednings- eller forværre en bestemt genetisk defekt 12. Endvidere kemiske genetik repræsenterer en stor avenue til at udføre translationel forskning 12. Mens traditionelle terminskontrakter genetiske skærme i dyremodeller har været uhyre magtfulde i at knytte specifikke gener for sygdomme, de mangler en tidsmæssig dimension, hvilket gør det vanskeligt eller nogle gange umuligt at observere fænotyper, der ville opstå efter tidlig embryogenese. Derudover kan gen-redundans gøre resultaterne observeret fra forward genetik svære at fortolke. Alternativt kan kemiske genetiske skærmemulighed for fin tidsmæssig kontrol og samtidig give et værdifuldt udgangspunkt for drug discovery 12,13.
Kemiske genetik kan udføres ved anvendelse af in vitro systemer (f.eks, cellelinjer, proteiner), eller ved anvendelse af et in vivo system, såsom en hel organisme. Anvendelse af et in vitro-system til kemiske genetik kan være gavnligt, fordi det er enklere end en hel organisme system nemmere at arbejde med i stor skala og mindre omkostningskrævende og mindre tidskrævende. Som et resultat, in vitro systemer giver mulighed for både high-throughput screening (HTS) og høj-indhold screening (HCS). Der er en række fordele ved at bruge et in vitro system, der bør overvejes, når du nærmer kemiske genetik, men også betydelige begrænsninger. En væsentlig begrænsning for anvendelse af en cellelinje er, at små molekyler kan være effektive og ikke-toksiske i en specifik cellelinie, men bliver toksiske, når de indføres i en hel organisme. Således kernenaf problemet er, at in vitro ikke systemer, der ikke fange den brede kontekst af en organisme og er derfor ikke altid i stand til præcist at efterligne, hvad der sker i en hel organisme. Mens sammensatte test i hele organismer kan omgå disse problemer, brug af pattedyr hel organisme modeller udgør en række fysiske og etiske begrænsninger. For eksempel er lægemiddel-screening i mus logistisk hæmmet af plads og omkostninger er nødvendige for at teste en passende stikprøve. Desuden kan udviklingsmæssige spørgsmål være vanskeligt at studere på grund af det faktum, at pattedyr udvikler sig i livmoderen. Endelig mens afviklingen af biomedicinsk forskning har enorme samfundsmæssige værdi, er der ikke desto mindre betydelige behov for at beskytte dyrenes velfærd ved at begrænse intense studier og lindre smerte og lidelse af dyr, der anvendes til forskning. Zebrafisk giver et levedygtigt alternativ til at arbejde med højere hvirveldyr som pattedyr, og desuden kan mange emner studeres under anvendelse af kemiske genetik påde embryonale og larvestadier når neurologisk behandling er fraværende eller operative på et lavt niveau 12,13.
Til dato har et utal af kemiske genetiske skærme blevet udført ved hjælp af zebrafisk embryoner i særdeleshed, som forbindelse levering kan opnås ved at nedsænke embryoner i medier indeholdende stoffet af interesse 12-15. Endvidere har der været en lang række videnskabelige og teknologiske fremskridt til at gøre kemiske genetiske skærme muligt og håndterbar 16-20. Peterson og hans kolleger var de første til at bruge zebrafisk i en kemisk genetisk skærm i 2000, og senere i 2004 identificeret en forbindelse, der undertrykt en aorta coarctatio mutation i zebrafisk 21,22. Kemiske skærme er siden blevet gennemført for at studere adskillige udviklingslande væv (f.eks, hjerte, blod, fartøjer) 23-25, fysiologiske funktioner (f.eks neurologisk basis for adfærd) 26, voksen regenerering 27,28, og diseas E-modeller (f.eks muskeldystrofi og kræft) 29,30. Blandt disse zebrafisk kemiske skærme, har opdagelsen af, at prostaglandiner regulere hæmatopoietiske stamceller taget til kliniske forsøg på mennesker, demonstrere magt til at flytte fra "tank to bedside" 23,31-33 (NIH, Klinisk Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Mere for nylig er lovende, potentielle terapeutiske opstået for komplekse organer som nyre, som oprydning cellulær patologi polycystisk nyresygdom (PKD) 34 og akut nyreskade 27,35, selv om disse har endnu at flytte til kliniske forsøg. Disse kemiske genetiske skærme bredt demonstrere anvendeligheden af at teste små forbindelser i udviklingslandene zebrafisk og evnen til at anvende kemiske genetik at forhøre voksent væv funktion. Desuden er der en voksende liste over kommercielt tilgængelige farmakologiske samlinger, der er tilgængelige for akademiske studier 19.
ove_content "> I de sidste mange år, har der været fremtrædende fremskridt i kemisk genetisk screening teknologi, herunder anvendelse af automatiserede systemer af robotter til lægemiddel-dispensering og håndtering, sammen med automatiserede billeddannende systemer 36-38. Sådanne systemer giver mulighed for mulighed for teste mange tusinde af forbindelser til at opnå både HTS og HCS 36-38. Desværre virksomheden af kemiske genetiske skærme med disse innovative robot virksomheder typisk kræve betydelige ressourcer. Disse typer af ressourcer er en væsentlig hindring for mange institutioner, der mangler kapital til at erhverve , drive og vedligeholde en sådan instrumentering. Mens oprettelse af infrastruktur til robot håndtering af kemiske biblioteker, herunder overførsel af embryoner til klædt plader, forbliver omkostningerne uoverkommelige for mange laboratorier, automatiseret billedbehandling og analyse generelt er mere tilgængelig 12. Automatiseret billede screening muliggør kvantificering fluorescerende transgene redragere og letter specifik fænotypeanalyse 12,15.Selvom automatiserede systemer repræsenterer brugbare teknologiske fremskridt, kan mange spørgsmål løses ved mere fokuserede manuelle skærme, såsom forespørgslen på flere tusinde biologisk aktive forbindelser på en udviklingsproces med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) udlæsning 39. Endvidere mens et stigende antal laboratorier har påberåbt zebrafisk kemiske skærme for at undersøge en problemstilling, få (hvis nogen) indsats har nået et mætningspunkt, og mange emner er endnu ikke brudt under anvendelse af kemiske genetik. Kemiske skærme kan udføres ved hjælp af en lille zebrafisk koloni bestående af kun få vildtype eller transgene tanke. Derfor bør denne form for genetisk forhør kunne opnås af de fleste zebrafisk forskergrupper interesseret i at udvide / diversificering i denne arena. Kemiske biblioteker af varierende størrelse kan udtages fra en kommerciel distributør og / eller collaborators. Af disse grunde kan kemiske genetik være økonomisk muligt, selv i barske finansiering klimaer. Men der er hindringer for begynder en skærm kemiske genetik, såsom hvordan man kan planlægge logistiske aspekter af skærmen: fx antallet af personale, der er nødvendige for en vellykket skærm, tildelingen af dedikerede tid og sammenstykke en fysisk protokol for manuelt procesprøver dette nummer fra hundrede til flere tusinde. Her har vi detalje en manuel high-throughput-protokollen til at udføre kemiske genetik i zebrafisk embryo med ønske som en read-out. Denne metode indebærer lægemiddelbehandling af zebrafisk embryoner, efterfulgt af riboprobe påvisning af mRNA-transkripter. Ved anvendelse af denne protokol, et lille team eller endda en person med rimelighed kan screene og analysere en beskeden kemisk bibliotek cirka 600 forbindelser i span af 9 uger.
Protocol
Procedurerne for at arbejde med zebrafisk her beskrevet blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of Notre Dame. En guide til den forskning, design for denne manual lille molekyle skærm i zebrafisk er tilvejebragt (Figur 1). En oversigt over de metoder, der beskrives i denne protokol er tilvejebragt som et rutediagram (figur 2). Der henvises til eksempel mærkningsordning (Figur 3) at planlægge de embryonale procestrin, der er beskrevet i del 4-10. For iscenesættelsen af embryoner, henvises til zebrafisk staging-serien 40, og til fremstilling af WISH antisense riboprober anvendes i dele 9-10 henvises til nyligt offentliggjorte metoder 41.
1. Fremstilling af zebrafisk Parring Chambers
- Placer en voksen mand zebrafisk og en voksen kvinde zebrafisk på en parring kammer, adskilt af kammeret divider O / N.
BEMÆRK: Masse parringer, sådans dem, der bruger grupper på 2-3 hunner og 2-3 hanner kan generere flere fostre i forhold til enlige parrede parringer, og kan udføres med passende størrelse parring kamre. - Gentag trin 1.1, således at i alt 25 par af zebrafisk er sat op til hver 96-brønds plade af små molekyler, der vil blive testet.
2. Indsamling af zebrafisk embryoner
- Den næste dag, skal du fjerne divider, der adskiller hver fisk par, og efter 1 time, indsamle zebrafisk embryoner ved hjælp af en finmasket si og placere dem i en petriskål indeholdende E3 embryo medium (se materiale liste til opskriften).
BEMÆRK: Indsamling embryoner efter 1 time sikrer, at fostre er på nogenlunde samme udviklingstrin. - Bruge en plastic overførselspipetten at fjerne snavs (fx fødevarer og fast affald). Brug derefter et stereomikroskop at observere hver kobling af embryoner og fjern eventuelle ubefrugtede æg.
- Dekanteres E3 embryo medie og udskift med frisk E3, og derefter placere hver dish af embryoner i en 28,5 ° C inkubator. Efter 2 timer observere hver kobling af embryoner ved hjælp af et stereomikroskop, og fjern eventuelle ubefrugtede æg.
BEMÆRK: befrugtede æg kan forgifte andre embryoner og vil synes at være på enkelt celle stadiet eller uigennemsigtig. - Fortsætte med at overvåge den udviklingsmæssige fremskridt af embryonerne anvendelse af et stereomikroskop, indtil de når 40% epiboly. Overhold sfære form af embryoet der ser ud til at bestå af to adskilte lag på 40% epiboly stadie 40.
3. Kemisk Fortynding Forberedelse
- Fjern den kemiske bibliotek plade fra opbevaring ved -80 ° C, dække den med alufolie og tø det ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Forskellige biblioteker vil tø op ved forskellige satser afhængigt primært på opløsningsmiddel, der anvendes. Typisk vil et kemisk bibliotek nedfrosset ved -80 ° C optøs fuldstændigt i ca. 3 timer ved stuetemperatur. Store optøning plade (r) på et sikkert sted med passende Hazmat mærkning. Bær enppropriate briller, kittel og to sæt handsker ved håndtering af kemikalier. - Brug en 8-kanals multikanalpipette at tilføje 99 pi E3 i kolonner 2-12 af en plade med 96 brønde.
BEMÆRK: Fra vores erfaring, en passende begynder lægemiddel er mellem 10 uM - 50 uM, og også som beskrevet i de nuværende protokoller 39. Her demonstrerer vi en 10 uM behandling, hvis du bruger en 1 mM kemisk bibliotek lager plade. - Brug en 8-kanals multikanalpipette at tilføje 1 ml af hver forbindelse til dets respektive godt med E3.
- Brug en P10 at pipettere 1 ml af DMSO (eller det passende opløsningsmiddel) til kontrol kolonne (her, kolonne 12).
- Dæk kemiske fortynding plade med alufolie, da aluminiumsfolie vil beskytte eventuelle lysfølsomme forbindelser i biblioteket, og bestanden kemisk bibliotek plade vende tilbage til -80 ° C til opbevaring.
4. opstillingsindretningen zebrafisk embryoner
- Vælg en petriskålindeholdende zebrafisk embryoner på 40% epiboly fase. Ved anvendelse af en overførselspipette, anbring forsigtigt ca. 10 embryoner i hver brønd af en (1,1 ml) dyb plade med 96 brønde. Dispensere embryoner i kolonner 2-12 af den dybe plade med 96 brønde.
BEMÆRK: Forskeren skal vælge tidspunkterne af narkotika tilføjelse, der passer bedst til den udviklingsproces, de ønsker at afhøre. Anvendelse af en plastik overførselspipette kan minimere skader foster. Da medicinsk behandling forud for 40% epiboly kan resultere i øget fosterletalitet, udvikle embryoner til længere før drug eksponering, især når senere udviklingsprocesser undersøges. Placering mere end 15-20 embryoner i hver brønd kan føre til forsinket udvikling på grund af fortrængning og bør undgås. Det er vigtigt at bemærke, at den dybe med 96 brønde indeholdende embryoner er forskellig fra den kemiske fortynding 96 brønds plade. - Brug et glas overførselspipette at fjerne overskydende E3 fra hver brønd, og bortvise overskydende E3 inden flydende affaldsbeholder.
BEMÆRK: Denne proces tager typisk 30 minutter til 1 time, afhængigt af forskerens hastighed, så embryonerne er mellem 50% og 60% epiboly ved afslutningen, som er målet udviklingsstadiet for tilsætning af kemiske fortynding beskrevet her. Pladen kan vippes med en vinkel på 45 ° forårsage embryoner til at falde til bunden af brønden, således at spidsen af pipetten kan presses mod bunden af brønden for at trække overskydende E3.
5. Tilsætning af kemiske behandlinger
- Anvende en 8-kanals multikanalpipette at overføre 100 pi kemiske fortyndinger til deres respektive brønde i den dybe med 96 brønde indeholdende array zebrafisk embryoner.
BEMÆRK: Kontroller, at originalen og placering af forbindelsen matcher med brøndlokaliteten i den tilsvarende dyb plade med 96 brønde (fx er B1 og placering i den kemiske fortyndingsplade pipetteret i B1 og placering i den dybePlade med 96 brønde). - Fugt et stykke køkkenrulle og læg det i en lysfølsom beholder stor nok til at holde en plade med 96 brønde.
BEMÆRK: Den våde køkkenrulle vil hjælpe med at forhindre fordampning af kemiske fortynding. - Brug derefter en tætningsmåtten at forsegle den dybe plade med 96 brønde, læg det i den lysfølsomme beholder, og inkubér det ved 28,5 ° C.
BEMÆRK: Lad zebrafisk embryoner udvikler indtil næste morgen. Alternativt, lad embryonerne udvikles, indtil passende udviklingsstadiet for processen blive analyseret.
6. Fjernelse af kemikalier
- Brug en 8-kanals multikanalpipette at tilføje 300 pi E3 til hver række af de lægemiddelbehandlede brønde. Tegn ud og kassér E3 / kemisk fortynding fra hver række af brønde. Vask embryoner 3 gange med 300 pi E3.
BEMÆRK: Kassér lægemiddel-affald i en mærket beholder kun anvendes til dette formål. For at lette vask, bruge et glas bækkenet fyldt med E3 bred nok til at bruge multichannel pipette.
7. Pronase og Fastsættelse zebrafisk embryoner
- Overfør zebrafisk embryoner ved hjælp af en plastik overførselspipette i fire plader med 24 brønde, og fjern derefter eventuelle døde fostre. Mærk de 24 brønde, så de svarer til de oprindelige stof godt placeringer. Placer pipette foran en mørk baggrund efter hver brønd overførsel til visualisere embryoner i pipetten og forhindre embryo godt crossover.
- Brug en plastik overførselspipette at trække off E3 så at embryonerne knap nedsænket i væske.
- Anvende en glaspipette til at tilføje 2 dråber pronase lager (50 mg / ml) til hver brønd. Lad embryoner inkuberes i pronase i 5 minutter og derefter omrøre brøndene at forårsage chorion at bryde fra hinanden. Alternativt pronase embryonerne før de er på det ønskede udviklingstrin til analyse.
- Bruge en plastic transfer pipette til at vaske embryoerne to gange med E3.
- Når embryonerne er på den ønskede fase af analysen, completely trække ud og kassér den resterende E3.
- Brug en plastik overførselspipette at tilføje frisk 4% PFA / PBS til hver brønd. Inkubér embryoner ved 4 ° CO / N til at fastsætte. Bruge frisk optøet PFA indledningsvis fastsætte embryoer.
BEMÆRK: Fortsæt for at udføre din skærm assay af interesse. Detaljeret her i §§ 8-10 er en procedure til at behandle skærmen plader med WISH. Alternative metoder kan være substitueret som ønsket, derefter gå videre til afsnit 11 og evaluere resultaterne.
8. Embryo Permeabilisering
- Bruge en plastic overførselspipetten at trække-off 4% PFA / PBS fra embryoner og vaske embryoner to gange med 1x (phosphatpufret saltvand med Tween) PBST. Overfør embryoner i plader med 48 brønde, og derefter trække off 1x PBST fra embryoner. Mærk plader med 48 brønde til at matche de oprindelige og placeringer af den dybe plade med 96 brønde.
- Vask ved tilsætning af 100% methanol til brøndene ved hjælp af en plastik overførselspipette derefter tegne det ud og tilsæt 100% methanol igen til de embryoner.
- Placer embryoner ved -20 ° C, og der inkuberes i mindst 20 min. Alternativt holde embryoner i 100% methanol ved -20 ° C til langvarig opbevaring.
- Fjern 100% methanol og vask embryoner med 50% MeOH / 1x PBST, og derefter 30% MeOH / 1x PBST, og endelig to gange med 1x PBST.
BEMÆRK: Embryoner ældre end 24 timer efter befrugtning (HPF) kan bleges på dette tidspunkt for at fjerne pigmentering 39. - Der tilsættes 15 pi optøet proteinase K stock (10 mg / ml) til 50 ml 1x PBST at udarbejde en proteinase K (5 ug / ml) brugsopløsning.
- Fjern 1x PBST fra embryoner og tilsæt proteinase K arbejder løsning. Fjern proteinase K efter 4 min.
BEMÆRK: Eksperimentatoren bør arbejde hurtigt under dette trin for at forhindre nedbrydning foster. Proteinase K koncentration og inkubationstid skal varieres afhængigt af alder af embryonerne behandles 41. De her beskrevne parametre vedrører embryonerder er 24 HPF. - Vask embryoner med 1x PBST, tilsæt derefter iskold 4% PFA / PBS. Lad embryonerne inkuberes i 4% PFA / PBS i 20 minutter ved stuetemperatur.
9. Hybridisering og Probe Removal
- Ved hjælp af et glas overførselspipette fjerne 4% PFA / PBS og vask embryoner to gange med 1x PBST. Erstatte 1x PBST med 500 pi HYB + og inkuber embryoner til 4 timer ved 70 ° C.
BEMÆRK: Pre-hybridisering kan udføres for så få som 2 timer, men 4 timer er ideel. Ligeledes kan forskellige hybridiserings- og vasketemperaturer være ideel til visse prober, såsom 65 ° C, men bør afprøves på et individuelt grundlag. - Generere digoxygenin-mærkede riboprober svarende til genet (generne) af interesse 41.
- Der tilsættes 16 ug riboprobe til 16 ml HYB +. Pre-varme riboprobe / HYB + opløsning ved 70 ° C i mindst 20 min før brug. Hvis der anvendes multiple prober, tilsættes 16 ug af hver probe til det samme HYB + volumen (16 ml).
- Ved hjælp af et glas overførselspipette fjerne HYB + og bruge en P1000 at tilføje 200 pi af riboproben / HYB + blanding. Vend riboprobe / HYB + cocktail lige før anvendelse og pipettere op og ned en gang før tilsætning af blandingen i hver brønd. Brug barriere pipettespidser at tilføje riboproben / HYB + løsning, dette forhindrer blanding damp trænger ind i pipetten.
- Inkubér embryonerne i riboprobe / HYB + cocktail ved 70 ° CO / N. Brug en klæbende film til dækning af brønde for O / N probe inkubation og alle følgende varme vask.
- Forbered 50% formamid / 2x SSCT, 2x SSCT, og 0,2x SSCT og pre-varm ved 70 ° CO / N.
- Ved hjælp af en P1000, fjern riboprobe / HYB + og opbevar blandingen ved -20 ° C. Eventuelt genanvende riboproben / HYB + blanding op til tre gange. Før hver genbrug, tilføje i 3 ug riboprobe til den oprindelige riboprOBE / HYB + blanding.
- Ved hjælp af et glas overførselspipette vaskes embryoner to gange med 50% formamid / 2x SSCT i 30 min ved 70 ° C. Vask embryoner gang med 2x SSCT i 15 minutter ved 70 ° C. Vask embryoner to gange med 0,2x SSCT i 30 minutter ved 70 ° C. Fjern 0,2x SSCT og vaske embryoner med MABT to gange ved stuetemperatur.
10. Anti-digoxygenin Antibody Incubation og Detection
- Brug et glas overførselspipetten at fjerne MABT fra hver brønd. Ved hjælp af en plastik overførselspipette, tilsæt frisk blok løsning til hver brønd. Lad embryoner inkuberes i blok i 4 timer ved stuetemperatur. Tilføje 8 pi anti-digoxygenin antistof til 40 ml blok opløsning (5.000 ganges fortynding).
- Ved hjælp af en plast transfer pipette erstatte blok opløsning med antistof / blok opløsning. Tilføj nok antistof / blok løsning til helt at dække embryoner.
- Dæk plade med 48 brønde med aluminiumsfolie, således at intet lys kan trænge igennem til embryonerne. Incubate embryonerne O / N ved 4 ° C. Ved hjælp af et glas pipette til at fjerne antistof / blok opløsning og vaske embryoner 10 gange med MABT i 5-10 minutter hver.
BEMÆRK: MABT vasker kan udføres kontinuerligt, da det vil tage forskeren 5-10 min at fjerne MABT fra hver plade og dispensere frisk MABT i brøndene. - Generere to rør på 40 ml (80 ml i alt) af præ-farvning buffer. Tilføj 180 pi NBT (50 mg / ml) og 140 pi af BCIP (50 mg / ml) til en af de fremstillede rør af præ-farvning buffer at skabe farveopløsning.
BEMÆRK: Denne farvning løsning vil generere et lilla farvet substrat. - Erstatte MABT med præ-farvning buffer og lad embryonerne inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Erstatte den præ-farvning buffer med farveopløsning og henstår ved stuetemperatur. Overvåg kolorimetriske reaktion hver 15 minutter under anvendelse af et stereomikroskop.
BEMÆRK: Farvning reaktioner kan tage fra nogle få minutter til mange timer afhængig af proben. - Repsnøre farveopløsningen med 1x PBST efter farvning reaktionen er fuldstændig og derefter vaske embryoerne to gange med 1x PBST i 5 minutter.
- Fjern 1x PBST og tilføje 4% PFA / PBS til at fastsætte embryoner.
BEMÆRK: Alternativt udføre en dobbelt ønske om at opdage riboprober mærket med et anti-fluorescein antistof. Hvis der udføres en dobbelt in situ, springe tilsætning af 4% PFA / PBS (trin 10.9) efter 1x PBST vask (trin 10.8) og vaskes embryoner to gange i 15 minutter med 0,1 M glycerol, to gange i 15 minutter med MABT vask, og derefter inkuber embryoner til 30 minutter i blok. Tilsæt derefter på den korrekte antistof O / N og udfør trin 10,3-10,9 bruger den korrekte farveopløsning. At påvise fluoroscein-mærkede riboprobe, udarbejde en farveopløsning med BCIP og INT at observere en rød substrat (se Trin 10.1).
11. Scoring den kemiske Screen Embryo Plates
- Udføre visuel scoring af resultaterne ved hjælp af et stereomikroskop for at vurdere embryo samples i fænotype analysen.
- Ved hjælp af en plastik transfer pipette embryoner fra de 48 brønde til 12 brønds plader for optimal visualisering. Mærk plader med 12 brønde, således at de svarer til såvel steder fra den oprindelige dybe plade med 96 brønde. Når overførslen er færdig, se under stereomikroskop.
BEMÆRK: Der kan vælges Repræsentative embryoner fra 12 brønde og afbildes på objektglas under et dækglas 41.
Representative Results
Den manuelle fremgangsmåde beskrevet her giver mulighed for en enkelt forsker til effektivt og med succes gennemføre en high-throughput småmolekyle kemiske genetik skærmen ved hjælp af zebrafisk embryo model (figur 1). Ved hjælp af denne metode, er det praktisk for en enkelt person til at udføre en skærm kemiske genetik, sådan at én person (forpligtet til en 40 timers arbejdsuge), i løbet 9 uger kan gennemføre en undersøgelse af ~ 600 forbindelser (figur 1) . Således kan bænken tid af én person omgå behovet for høj ressourcekrævende udstyr, som automatiserede systemer. Det trade-off er, at en manuel skærm kræver flere ugers dedikeret indsats. I modsætning hertil kan brugen af automatiserede systemer komprimere involveret i 1-2 uger af robot tid tid, og kan medføre relativt minimal forsker indsats generelt. En måde at øge effektiviteten og / eller omfanget af en manuel skærm er at hverve 2-3 forskere i alt, hvilket ville muliggøre screening af mmalm forbindelser, varierende sammensatte koncentration og / eller screening i løbet af en kortere periode.
De primære trin involveret i protokollen til at fuldføre en kemisk genetik skærm i zebrafisk embryoner med et ønske udlæsning er illustreret som et flowchart (Figur 2). De eksperimentelle opgaver kan opdeles i to typer arbejde uger: (1) kemisk eksponering og mærkning embryo, og (2) analyse og billedbehandling. I den kemiske eksponering arbejdsuge, omfatter disse trin oprette zebrafisk voksne (dag 1), embryonindsamling arraying embryoner og lægemiddelbehandling (dag 2), forberedelse embryoner til in situ hybridisering (Dag 3), og in situ hybridisering (Dag 4 -6). I analysen / imaging uge, forskeren analyserer mRNA-ekspression at score embryoner og billedfiler hits (dag 7-11).
En vigtig del af at udføre en skærm kemiske genetik er konsekvent og præcist mærke godt steder. Da skærmen kemiske genetik pprocesmodeller detaljeret her indebærer overførsel sæt af embryoner fra en brønd i en plade på en brønd i en anden plade flere gange, er altafgørende behov for præcis og tydelig mærkning, således at når en kemisk hit er scoret det kan være lineært og nemt spores tilbage til sin identitet inden for kemisk bibliotek (figur 3). En nem måde at sikre dette er at mærke pladerne på en sådan måde, at til enhver tid og sted for et sæt af embryoner, der behandles med en forbindelse passer direkte kemisk bibliotek lægemiddel plade og placering af forbindelsen anvendes til behandling af disse embryoner (figur 3). Her et dobbelt system med farvekodning og numeriske etiketter bruges til at organisere prøverne, som blev føjet til skærmpladerne anvender permanente markører (Figur 3).
Når man analyserer resultaterne af en high-throughput skærm, der er et kritisk behov for at udvikle en metode til korrekt organisere, anmærke og analysere potentielle lille molekylehits. Derfor skal en skærm kemiske genetik have en grundig og klar grading system, der er omhyggeligt designet og strengt. Et sådant system bør let og helt formidle de vigtige dynamik en forbindelse og give en kortfattet måde at præsentere resultaterne af den færdige skærm. En måde at konstruere et sådant system er til at sortere fostre anvender en klasse-system, hvilket ville forklare overordnede morfologiske sværhedsgrad og tillid et hit. Endvidere kunne de klasser kobles med en (+) eller (-) for at beskrive enten en ekspansiv eller reduktiv virkning på regionen (r) af interesse. Her blev zebrafisk embryoner underkastes individuelle forbindelser fra en bioaktiv bibliotek (Enzo Chemicals) fra 50% til 24 epiboly HPF og derefter analyseret ved WISH anvendelse af en cocktail af tre riboprober til påvisning nephron segmenter (figur 4A). Som et eksempel grading system, en brønd, der indeholder en gruppe af embryoner, der havde en dramatisk forstørret proximal convoluted tubulus (PCT) af pronephros, zebrafisk embryoniske nyre, ville forårsage forbindelsen anvendes til at behandle og kategoriseres som (klasse I), som i dette tilfælde ville repræsentere klasse er forbundet med den mest alvorlige defekt og det højeste niveau af tillid fænotypen observeret (figur 4B). Forbindelsen vil derefter blive kommenteret med (PCT) og et (+), den komplette notation (klasse I - PCT +) (figur 4B). Dette koncept for klassificering giver en enkel og hurtig måde at beskrive en guldgrube af information vedrørende et lille molekyle af interesse, herunder sværhedsgraden af forbindelserne effekt på organismen, den region, der er påvirket af lægemidlet og den måde, hvorpå regionen påvirket (figur 4B).
Figur 1. & #160;. Manual zebrafisk embryo kemisk skærm strategi En forsker kan indpasses teste en plade med 96 brønde af kemikalier på zebrafisk embryoner og udfører efterfølgende WISH forarbejdning i løbet af en enkelt uge. Udførelse af to uger af kemiske test (Uge 1 (dag 1-6) og Uge 2 (Dag 7-12)) kan parres med en tredje uge er dedikeret til at prøve analyse. Ca. to plader med 96 brønde værd af skærmen prøver kan scorede og filmede Uge 3 (Dag 13-17). Dette scenario svarer til screening af ca. 200 forbindelser i en 3 ugers periode, svarende til en lille bibliotek med ca. 600 forbindelser helt afskærmet af 9 uger. Denne manual strategi kan ændres, afhængigt af de tilgængelige ressourcer. For eksempel kan tre forskere reducere tid til at fuldføre en skærm omkring 600 forbindelser til 3 uger sammenlignet med de 9 uger er det ville tage med en forsker. Screening strategier kan tilpasses ved at tildele forskere til specifikke aspekter af skærmen, såsom narkotika treatling og in situ hybridisering eller lede forskerne til selvstændigt at varetage hele screening proces på separate dele af den kemiske biblioteket.
Figur 2. Flowchart:. Opdeling af seks dage workflow Skærmbilledet kemisk screening proces kan diskret opdeles i 6 dage. Dag 1 består af etablering zebrafisk parring par (= /> 25) til at levere embryoner for hver plade med 96 brønde, der skal screenes. Dag 2 indebærer indsamling embryoner fra de samvirkende kamre og gruppere dem i en dyb plade med 96 brønde, efterfulgt af lægemiddelbehandling. På dag 3, embryoner er forberedt til WISH, herunder dechorionation, vævsfiksering, og embryo dehydrering. Endelig WISH foretaget på embryoner gennem Day 4-6. Bemærk venligst, at alternative farvningsprocedurer på faste prøver kan være let substituted for WISH.
Figur 3. Plate mærkning transfer skematisk. Zebrafisk embryoner grupperes og behandlet med lægemiddel i en plade med 96 brønde derefter flyttet til en 24-brønds plade til fjernelse snavs og pronase eksponering. Embryonerne flyttede derefter til plader med 48 brønde til forberedelse embryo, WISH, og vævsfiksering. Dernæst embryoner overført til plader med 12 brønde til scoring, billedbehandling og lagring. Præcis opstillingsindretningen af embryoner opnås ved brug af en farvekodning system, der gør det muligt for forskeren at holde styr på de kemiske oprindelseslandet for hver prøve. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Eksempel grading system:. Nyre segmentering assay A WISH eksperiment gør det muligt for forskeren at farve specifikke celletyper baseret på identiteten af de sonder, der er udvalgt, så vurderingen af ændringer i embryo fænotyper henhold til ændringer i mRNA transskription placering og / eller niveauer. Som et eksempel, tre segmenter af zebrafisk embryoniske nyre, de pronephros blev mærket under anvendelse Screen Mix 1. Screen Mix 1 er en cocktail af prober bestående af wt1b, der specifikt lokaliseres i podocytterne (P), slc20a1a som markerer den proximale snørklet tubulus (PCT), og slc12a1 hvilke etiketter distale tidligt (DE) segment 47. A (+) symbol ved siden af en region etiket bruges til at anmærke ekspansion eller positivt skift i denne region, mens en (-) symbol bruges til at diktere formindskelse af en region. Her, embryos lægemiddel behandlet med 13-cis RA har en forstørret proximal tubulus og et fuldstændigt tab af det distale tidlige segment med ingen synlig effekt på podocytterne. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
Kemiske genetik i zebrafisk kan gøre en afgørende indflydelse på udviklingen af lægemiddelforskning. Denne protokol giver en manuel high-throughput metode til at udføre kemiske genetik i zebrafisk embryoner med et ønske udlæsning, effektivt muliggør en enkeltperson eller lille team til at gennemføre et lille molekyle skærm. Dette minimal-ressource metode udvider mulighederne for kemiske genetik til mange forskergrupper. Specifikt giver dette skærmbillede strategi giver et vigtigt alternativ til brugen af robot-instrumentering, som sådanne systemer ikke bredt tilgængelige på tværs af forskningsafdelinger. Denne manual skærm giver mulighed for en enkelt person til at teste en plade med 96 brønde af forbindelser med et ønske udlæsning i en 6 dages arbejdsuge. Da zebrafisk er oviparous, med embryonerne udvikler udenfor forælder, og embryonerne er store nok til at se med det blotte øje (mellem 1-3 mm), de er medgørlige for manuel håndtering med enkle virkemidler og forskeren kan array-prøver imulti-brønds plader uden brug af et mikroskop. Eftersom zebrafisk udvikle sig hurtigt, kan lille molekyle eksponering være effektiv med en enkelt behandling med en forbindelse, snarere end gentagne doser, hvilket minimerer yderligere manuel behandling. Zebrafisk embryoner er let dyrkes, fordi deres æggeblomme tilvejebringer en kilde til ernæring op til 5-6 dage efter befrugtningen, hvilket eliminerer komplikation af fiskeyngel fodring. Derudover har de fleste af de larver organer udvikles og bliver funktionelt i denne periode, som giver mulighed for at studere en bred vifte af forskningsspørgsmål. Den enkle tilsætning af små molekyler til embryo inkubationsmedierne er ikke-invasiv og tillader forskeren (s) for at vælge for lægemiddeldosis, tidspunktet for tilsætning, og varigheden af eksponeringen hvilket giver en stram kontrol med mange variabler og mulighed for specifikke udviklingsmæssige processer af interesse, der skal forespørges. Som beskrevet her, kan betydelige forskning produktivitet opnås på et kort timefravn bruge denne manual skærm metodologi. Det er vores erfaring, at der er et højt afkast af den investerede indsats, som kan blive forstærket ved hjælp af en kendt bioaktiv kemisk bibliotek til at analysere en proces af interesse, såsom nephron segmentering under renal udvikling (Figur 4, Poureetezadi og Wingert, upubliceret).
Den manuelle kemisk skærm beskrevet her er usædvanlig alsidig, fordi den indebærer en analyse på faste zebrafisk prøver. For eksempel kan denne strategi revideres for at teste flere plader af forbindelser i en uge og derefter at score embryoner den følgende uge. Alternative assays på faste zebrafisk prøver, såsom immunhistokemi eller andet væv farvning præparater, kan også være substitueret for WISH udlæsning. Eksperimentelle strategier til at udføre cellulære assays i zebrafisk kan tilpasses på grund af den optiske klarhed og gennemsigtighed i tidlige udviklingsstadier. Endvidere kan forskerne hæmme pigmentering på senere staGES brug af kemikalier eller undgå komplikation af pigment udvikling helt gennem brug af pigment-mindre genetiske linjer som casper eller ren og skær zebrafisk 13. Det er muligt manuelt at administrere små molekyler, behandler pletten (r) af interesse, og manuelt score embryoner ved hjælp af en simpel stereomikroskop. Det er imidlertid vigtigt at huske på, at automatiseret billedanalyse kan udføres, og kan faktisk være påkrævet for høj opløsning fænotype-analyse. For eksempel kan det være foretrukket at partner et automatiseret billedanalysesystem med et direkte assay, såsom en transgen reporter, da dette forenkler den manuelle behandling af prøver kvantificeres forskelle ikke er lette at skelne med det blotte øje, og eliminerer forsker skævhed 15. Heldigvis nogle automatiserede billeddannende systemer er både brugervenlig og økonomisk i form af software omkostninger 15. Brugen og kapaciteter af andre automatiserede systemer har hurtigt udviklet sig og kanlægges til grund for organismer, administrere medicinske behandlingsmetoder, og endda til at flytte organismer 12,15. Disse automatiserede systemer har indvarslet en ny teknologisk tidsalder forskning og har givet innovative løsninger for at manipulere store mængder af testpersoner, og dermed udføre HTS og HCS tilgange i hele organismer 12,15. Mens sådanne maskiner er unægtelig nyttige værktøjer, de er også meget dyre og er uden for rækkevidde for mange grundlæggende forskningslaboratorier. Uden adgang til disse automatiske funktioner kan det synes, at kemiske skærme er ikke mulige. Men denne protokol skitserer en guide til, hvordan man laver en manuel skærm, der kan bruges til at fuldføre en skærm kemiske genetik på en praktisk måde i løbet af en rimelig periode.
Ulemper for både manuelle screening og kemiske genetik generelt findes, og bør holdes i betragtning, når en kemisk skærm. Især fremgangsmåden vist her kræver en moderat gradfysisk fingerfærdighed. Denne bekymring er formindsket eller helt undgås gennem gentagelse, da fingerfærdighed vil forbedre med praksis. Derudover er der minimal plads til grov fejl, som der er kun 10 embryoner pr godt til analyse. Små molekyler kan variere i penetrans af fænotype, der induceres, så en rimelig scoring regime til at identificere forbindelser af interesse skal overholdes. Det er afgørende, at forskerne udnytter denne protokol udtænke passende strenge kriterier for, hvad de vil overveje et hit. Det er også vigtigt at huske på, at karakteren af denne form for skærm sandsynligvis vil give en vis del af falske positiver, som kan afgrænset gennem yderligere kemisk oparbejdning. Endvidere er det vigtigt at embryoer præcist og at indsamle koblinger til screening kort efter befrugtning, som asynkron udvikling kan føre til komplikationer i nøjagtigt at vurdere effekten af lægemiddelbehandlinger. Endvidere med hensyn til kemisk screening som en exeksperimenterende strategi, der er et væld af begrænsninger. Forbindelsesopløselighed og toksicitet af bærestoffer (f.eks, dimethylsulfoxid (DMSO)) kan også præsentere et problem, og kan være uoverkommelige i at teste mange molekyler. Chorion kan også fungere som barriere for lægemiddel. Endelig, selv om zebrafisk er en kraftfuld og translationel model for kemiske genetik, pleje skal altid tages i at bestemme, om et alternativt kemisk skærm strategi, fx ved anvendelse af et in vitro system, såsom en cellelinie, kan substitueres for anvendelse af hele dyr. Ikke desto mindre er kemisk behandling i hele zebrafisk systemet frem for at gennemføre lignende tiltag i pattedyr, da det giver den fordel, at samle de systemiske virkninger af forbindelserne og kan sætte forskerne at triage listen over forbindelser, der skal testes i et pattedyr model.
Til dato har zebrafisk kemiske skærme forudsat en effektiv eksperimentel værktøj to afgrænse de mekanismer udvikling og at sikre kandidat farmakologiske midler til anvendelse i medicin, såsom identifikation af molekyler, der kan forebygge sygdom sygdomme. For eksempel viser en undersøgelse af Burns og kolleger udviklet en automatiseret mikro-godt assay for hjertefrekvens ved hjælp af transgene zebrafisk embryoner, der udtrykte GFP i myokardiet 42. De brugte denne transgene linje at analysere puls i udvikling, og hvordan det blev påvirket ved lægemiddelbehandling 42. En anden undersøgelse, ved at teste befolkningstætheden af hæmatopoietiske stamceller i zebrafisk embryo, der er konstateret, at prostaglandin E2 regulerer HSC niche 23. Dette fund blev valideret i musen, og blev senere implementeret til klinisk afprøvning i humane navlestreng transplantationer 23,31-33 (NIH, Klinisk Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Gennem flere nylige undersøgelser har kemiske genetik vist sig at være nyttige i at studere nyresygdom hjælp af zebrafisk
Mens kemiske genetik forskning bærer betydelig fortjeneste, er det ikke uden visse udfordringer. Udelukkende ved hjælp af en kemisk genetik tilgang kan gøre det vanskeligt at bestemme den specifikke gen eller gener, der påvirkes af en forbindelse. Selv hvis et mål (er) er fundet, en significant kløft kan forblive mellem sammensatte identifikation og forstå mekanismen (r) for, hvor lille molekyle opfører sig. For eksempel kan det være vanskeligt at afgøre den mekanisme, hvor et lille molekyle optræder, fordi en enkelt forbindelse kan have en række forskellige virkninger i en organisme. Men med fremkomsten af ny teknologi og flere kemiske genetiske skærme er afsluttet i zebrafisk, er problemet med fastsættelse af en ordning faldende. En metode til at hjælpe med at bestemme de molekylære virkninger af identificerede forbindelser er at vælge et lægemiddel bibliotek af kendte bioactives til screening, hvor mekanismer kan potentielt udledes tidligere kommenterede data. Derudover chemoinformatic algoritmer, ligesom Discovery gate, er til rådighed til brug, der kan sammenligne strukturelle ligheder af en forbindelse mod en database af forbindelser med tilskrevet mekanismer 14. Endnu en måde at belyse mekanismen af en forbindelse ville være at generere et MICRoarray profil efter behandling og derefter forespørge denne profil i en samling af microarray narkotika profiler, såsom Connectivity Kort, der søger efter mekanistisk definerede forbindelser, som fremkalder en lignende effekt 14. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at identificere genetiske mutanter, der har en lignende virkning som forbindelsen af interesse. At finde en forbindelse mellem en forbindelse og en mutant antyder, at forbindelsen fungerer molekylært opstrøms eller nedstrøms for det tilknyttede gen, som kan afgrænses ved behandling af mutanter med forbindelsen og morpholinos. En anden mulighed ville være massespektrometri, der fortsætter med at blive mere optimeret til zebrafisk. Denne metode kan anvendes til at afgrænse specifikke protein-ændringer eller post-translationelle modifikationer efter lægemiddelbehandling. Endelig, små molekyler eller endda hele biblioteker er undertiden i stand til at blive mærket for pull-down af bindingspartnere. Det er også værd at bemærke, at mens den mekanisme for, hvordan en lille molekyle fungerer is af væsentlig import, der er FDA-godkendte lægemidler, for hvilke mekanismer forbliver ukendt.
Selv zebrafisk udviser mange ligheder til pattedyr både genetisk og fysiologisk, er der stadig et problem af lægemiddel crossover 14. Et studie undersøgte crossover evne af hits fra en skærm til cellecyklusinhibitorer i zebrafisk embryoner 50. Skærmen resulterede i identifikationen af 14 hits, der tidligere var ukendte at besidde cellecyklusaktivitet. Ud af disse 14 forbindelser blev 6 sig at have cellecyklusaktivitet i begge celledyrkningsassays menneskelige og zebrafisk blev 3 vist at være serum inaktiveret i cellekulturassays, 1 var kun aktiv i zebrafisk celler, og 4 havde nogen aktivitet i enten zebrafisk eller humane celledyrkningsassays, men kun i zebrafisk hele organismen. Især de 4 forbindelser, der kun har haft aktivitet i zebrafisk viser, at der er forskelle mellem zebrafisk og pattedyr, der kan prohibit den translationelle potentiale af visse forbindelser. Dette er en vigtig overvejelse at være opmærksomme på, men der er eksempler på små molekyler, som PGE2 som forstærker evne HSC'er at indpode i menneskelige modtagere og PTBA-derivater, der forbedrer hastigheden af renal opsving i pattedyr, hvilket giver bevis af princippet om, at crossover er mulig 23,31-33.
Uanset disse faldgruber, kemiske genetik og denne minimal-ressourceorienteret tilgang har meget at tilbyde forskningsmiljøet. Kemiske genetik er særlig nyttig i zebrafisk og vil fortsat spille en afgørende rolle i molekylær pathway forhør og lægemiddelforskning. Kemiske skærme baseret på diskrete molekylære mål har historisk været genstand for en høj fejlrate grund af, hvad der er kendt som den konstellation af adsorption, distribution, metabolisme, udskillelse og toksikologiske (ADMET) egenskaber 51. Kemiske skærme anvender zebrafisk tilfokusere på en proces snarere end en diskret mål kan omgå flere ADMET problemer og identificere forbindelser, der er effektive i forbindelse med hele organismen. Med den stigende pulje af ressourcer til rådighed for zebrafisk forskning, herunder de nuværende mutantstammer og evnen til at bruge genom-redigering til at skabe målrettede genetiske mutanter og transgene, er der praktisk talt et ubegrænset antal potentielle kemiske genetiske skærme med zebrafisk. Mange kemiske biblioteker er blevet kurateret og span samlinger med kendte bioactives, nye forbindelser, strukturelt forskellige og strukturelt lignende. Disse reagenser giver et væld af spændende muligheder for skærmen kombinationer, der er tilgængelige i øjeblikket, og som sandsynligvis vil vokse yderligere i de kommende år. Med disse muligheder i hånden, denne vejledning og high-throughput protokol giver en praktisk og brugervenlig måde at øge evnen til forskergrupper til at foretage kemiske genetiske skærmbillederne vha zebrafisk.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af finansiering til Wingert forskningslaboratorium fra følgende: National Institutes of Health giver K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar tilskud award # 5-FY12-75; opstart midler fra University of Notre Dame College of Science og Biologisk Institut; og en generøs gave til University of Notre Dame fra Elizabeth og Gallagher på vegne af Gallagher Family at fremme stamcelleforskning. De finansieringskilderne havde ingen rolle i undersøgelsen design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker Paul T. Kroeger, Jr. til at give kritisk feedback på manuskriptet. Vi takker personalet på Biologisk Institut for deres støtte, og Center for zebrafisk Forskning på Notre Dame for deres enestående engagement i pleje og velfærd i vores zebrafisk koloni. Endelig vil vi takke medlemmerne af vores research lab for deres kommentarer, diskussioner og indsigter om dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 10 μl natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1x E3 | Generate using 50x E3 and DI water. | ||
| 1x PBST | Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS. | ||
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1x PBS | Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 °C. | ||
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50x E3 | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water. | ||
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 °C. |
| block solution | Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) | ||
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 μl | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 μm CA / 1 L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 μl/μl heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2 L and autoclave. | ||
| MABT | Generate 0.1% Tween-20 in MAB | ||
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 - 10 μl | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) | ||
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | Generate using 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. | ||
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
References
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
- Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D. Small molecule screening in zebrafish. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3 (5), 454-460 (2010).
- Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
- Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Designing zebrafish chemical screens. Methods Cell Biol. 105, 525-541 (2011).
- Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
- Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
- Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
- Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
- Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
- Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
- Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
- Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
- Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
- Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
- Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
- Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).
