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Biology

Zebrafish भ्रूण का उपयोग उच्च throughput आ मैनुअल छोटे अणु स्क्रीन

Published: November 8, 2014 doi: 10.3791/52063
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

zebrafish हड्डीवाला विकासात्मक प्रक्रियाओं और मॉडल मानव रोग का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रायोगिक जीव है. यहाँ, हम एक साथ zebrafish भ्रूण में एक पुस्तिका उच्च throughput रासायनिक स्क्रीन प्रदर्शन के लिए पर एक प्रोटोकॉल का वर्णन पढ़ने के लिए बाहर सीटू संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट.

Abstract

Zebrafish कारण मनुष्यों के साथ आनुवंशिक संरक्षण की उनकी काफी हद तक एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीव विकासात्मक जीव विज्ञान आबाद तंत्र है कि जांच करने के लिए और मानव रोग विकृति का अध्ययन करने के लिए बन गए हैं. रासायनिक आनुवंशिकी एक जैविक प्रक्रिया पर छोटे अणुओं है कि प्रभाव का परीक्षण जरूरत पर जोर देता है और चिकित्सीय यौगिकों की पहचान करने के लिए एक लोकप्रिय शोधों तरीका बनता जा रहा है. Zebrafish विशेष रूप से, क्योंकि बाहर से निषेचित कर रहे हैं जो पारदर्शी भ्रूण की बड़ी चंगुल उत्पादन करने की क्षमता के रासायनिक आनुवंशिकी के लिए उपयोग करने के लिए अपील कर रहे हैं. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण आसानी से भ्रूण मीडिया के लिए एक यौगिक के सरल अलावा द्वारा इलाज दवा हो सकता है. का प्रयोग सीटू संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट, mRNA अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से zebrafish भ्रूण के भीतर देखे जा सकते हैं. साथ में, रासायनिक आनुवंशिकी और इच्छा का उपयोग, zebrafish सेलुलर और शारीरिक निर्धारित करने के लिए जो में एक शक्तिशाली पूरे जीव संदर्भ बन जाता हैछोटे अणुओं के प्रभाव. अभिनव अग्रिम हालांकि इस तरह के विकल्प उपलब्ध नहीं हैं या लागत निषेधात्मक रहना कई प्रयोगशालाओं के लिए, मशीन-आधारित स्क्रीनिंग प्रक्रिया का उपयोग प्रौद्योगिकियों कि में बनाया गया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बुनियादी संसाधनों की आवश्यकता है और समय की एक कुशल अवधि में एक भी व्यक्ति या छोटे दल द्वारा पूरा किया जा सकता है कि एक पुस्तिका उच्च throughput रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन पर अमल करने के लिए कैसे करें. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल विकासात्मक प्रक्रियाओं, रोग तंत्र में मौलिक अंतर्दृष्टि पाने के लिए उपयोगी हो सकता है, और चिकित्सकीय प्रासंगिक आवेदन किया है कि उपन्यास यौगिकों और संकेत दे रास्ते की पहचान करने के लिए जो zebrafish में रासायनिक आनुवंशिकी प्रदर्शन करने के लिए अनुसंधान समूहों द्वारा लागू किया जा सकता है कि एक व्यावहारिक रणनीति, प्रदान करता है .

Introduction

मानव बीमारी के इलाज के लिए प्रभावी उपचारात्मक दवाओं की पहचान के कई जैव चिकित्सा शोधकर्ताओं के लिए एंडगेम है. नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए संभावित औषधीय एजेंटों की पहचान और लक्षण वर्णन स्वास्थ्य के लिए स्पष्ट मूल्य है, इसलिए यह एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है. अंत में, कई चिकित्सीय यौगिकों के विकास के विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को विकसित करने या समारोह या तो कैसे के ज्ञान से आता है. zebrafish, Danio rerio, विकासात्मक जीव विज्ञान 1 में एक मुख्यधारा मॉडल जीव बन गया है कि Cyprinidae परिवार का एक मीठे पानी teleost है. Zebrafish आनुवंशिक रूप से वैज्ञानिक अध्ययन 2,3 के लिए बनाए रखने और हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं कि विनयशील रीढ़ हैं. zebrafish भ्रूण बाहर से निषेचित, पारदर्शी है, और केवल एक सप्ताह 2,3 में एक भी वयस्क संभोग जोड़ी से सैकड़ों द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. इसके अलावा, zebrafish शेयर प्रमुख अंग प्रणालियों और एक बड़ी घ अधिकारीमनुष्य 4 सहित स्तनधारियों, साथ आनुवंशिक समानता के egree. Strikingly, मानव जीन के 70% एक zebrafish orthologue 4 है. इस वजह से यह समानता के लिए, zebrafish हड्डीवाला विकास और शरीर विज्ञान के तंत्र के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक प्रायोगिक प्रणाली किया गया है, और मानव रोगों 5-7 की एक भीड़ पुनरावृत्ति करने के लिए नियोजित किया गया है. इन कारणों से, दूसरों के बीच में, आनुवंशिक पूछताछ जारी रखने के लिए zebrafish एक आदर्श उम्मीदवार बना दिया है और जैव चिकित्सा अनुसंधान 6,7 में zebrafish के उपयोगिता के लिए एक तेजी से बढ़ सराहना हुई है.

पिछले कुछ दशकों में, आनुवंशिक उपकरणों की एक बहुतायत zebrafish में विकसित किया गया है. zebrafish जीनोम उत्परिवर्तजनन और transgenesis 3 करने के लिए उत्तरदायी है. तिथि करने के लिए, एक आगे की अधिकता और आनुवंशिक अध्ययनों रिवर्स 9,000 म्यूटेंट 3 की पीढ़ी के लिए अग्रणी प्रदर्शन किया गया है. इसके अलावा, कई ट्रांसजेनिक लाइनों होना हैएन विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं 3 की लेबलिंग और अलगाव के लिए सक्षम है, जो बनाया. Zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र (ZIRC) 8 के माध्यम से नहीं बल्कि एक कम कीमत पर प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच रहे हैं, जो अनुसंधान समुदाय के लिए इन संसाधनों को केंद्रीकृत और वितरित करने के लिए महत्वपूर्ण चल रहे प्रयासों की गई है. इसके अलावा, जैविक जानकारी और दृश्यों और प्रोटोकॉल morpholino के लिए जीन अभिव्यक्ति पैटर्न से लेकर आणविक उपकरण, की एक व्यापक भंडार, उत्तरोत्तर Zebrafish सूचना नेटवर्क (ZFIN) 9-11 पर एनोटेट किया गया है. ये zebrafish अनुसंधान infrastructures महत्वपूर्ण एनआईएच समर्थन और इस पशु मॉडल 8 की वकालत के माध्यम से संभव बनाया गया है. Zebrafish म्यूटेंट, ट्रांसजेनिक लाइनों, और उचित जानकारी के इस कैश को बड़े पैमाने पर जैविक अनुसंधान समुदाय को असाधारण मूल्य का होना जारी है. Zebrafish अब एक अच्छी तरह से स्थापित और पूर्व प्रख्यात मॉडल जीव हैं हालांकि, जबकि, वे एक ला प्रतिनिधित्वrgely अप्रयुक्त जलाशय रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के उपयोग के माध्यम से विकासात्मक जीव विज्ञान और रोग का अध्ययन करने के लिए.

रासायनिक आनुवंशिकी रहने वाले एक प्रणाली 12 के भीतर एक जैविक प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए ऐसी दवाओं या अन्य यौगिकों के रूप में छोटे अणुओं, का उपयोग है. रासायनिक आनुवंशिकी एजेंटों कि बचाव की पहचान या एक विशिष्ट आनुवंशिक दोष 12 ख़राब करने के लिए इस तरह के रूप में, जीन समारोह की आणविक तंत्र को समझने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, रासायनिक आनुवंशिकी शोधों 12 का संचालन करने के लिए एक प्रमुख एवेन्यू का प्रतिनिधित्व करता है. पशु मॉडल में परंपरागत आगे आनुवंशिक स्क्रीन रोगों के लिए विशिष्ट जीन को जोड़ने में काफी शक्तिशाली किया गया है, वे यह मुश्किल या कभी कभी असंभव जल्दी embryogenesis के बाद पैदा होता है कि phenotypes के निरीक्षण करने के लिए कर रही है, एक अस्थायी आयाम की कमी है. साथ ही, जीन अतिरेक व्याख्या करने के लिए आगे आनुवंशिकी से मनाया परिणाम कठिन बना सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीनठीक अस्थायी नियंत्रण के लिए अनुमति देते हैं और एक साथ दवाओं की खोज 12,13 के लिए एक मूल्यवान प्रारंभिक बिंदु प्रदान करते हैं.

रासायनिक आनुवंशिकी इस तरह के एक पूरे जीव के रूप में (उदाहरण के लिए, सेल लाइनों, प्रोटीन) इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग कर या एक में विवो प्रणाली, का उपयोग किया जा सकता है. रासायनिक आनुवंशिकी के लिए इन विट्रो प्रणाली का उपयोग करते हुए यह कम महंगा एक बड़े पैमाने पर साथ काम करना आसान है, एक पूरे जीव प्रणाली की तुलना में आसान है क्योंकि फायदेमंद हो सकते हैं, और कम समय लेने वाला. नतीजतन, इन विट्रो सिस्टम उच्च throughput स्क्रीनिंग (एचटीएस) और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) दोनों के लिए अनुमति देते हैं. यह भी एक रासायनिक आनुवंशिकी आ जब विचार किया जाना चाहिए कि इन विट्रो प्रणाली का उपयोग करने के लिए फायदे की संख्या, लेकिन महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. एक सेल लाइन का उपयोग करने के लिए एक प्रमुख सीमा छोटे अणुओं एक विशेष सेल लाइन में प्रभावोत्पादक और गैर-विषाक्त हो सकता है, अभी तक एक पूरे जीव में पेश किया जब विषाक्त हो सकता है. इस प्रकार, जड़मुद्दे की इन विट्रो में सिस्टम एक जीव के व्यापक संदर्भ कब्जा नहीं है और इसलिए हमेशा सही रूप में एक पूरे जीव में क्या होता है नकल करने में सक्षम नहीं हैं कि है. पूरे जीवों में यौगिक परीक्षण के इन मुद्दों को दरकिनार कर सकते हैं, स्तनधारी पूरे जीव मॉडल का उपयोग भौतिक और नैतिक सीमाओं के एक नंबर बना हुआ है. उदाहरण के लिए, माउस में दवा स्क्रीनिंग logistically एक पर्याप्त नमूना आकार परीक्षण करने के लिए आवश्यक स्थान और व्यय से रुकावट है. इसके अलावा, विकासात्मक सवालों कारण स्तनधारियों utero में विकसित तथ्य यह है कि, अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है. जैव चिकित्सा अनुसंधान का संचालन विशाल सामाजिक मूल्य है, जबकि अंत में, फिर भी गहन अध्ययन के सीमित और दर्द को समाप्त करने और अनुसंधान के लिए इस्तेमाल जानवरों के पीड़ित द्वारा पशु कल्याण की रक्षा करने के लिए पर्याप्त जरूरत है. Zebrafish स्तनधारियों की तरह उच्च रीढ़ के साथ काम करने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करते हैं, और इसके अलावा, कई विषयों पर रासायनिक आनुवंशिकी का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता हैभ्रूण और लार्वा चरणों न्यूरोलॉजिकल प्रसंस्करण एक कम स्तर 12,13 में अनुपस्थित या ऑपरेटिव है जब.

यौगिक वितरण ब्याज 12-15 की दवा युक्त मीडिया में भ्रूण डुबो कर पूरा किया जा सकता है के रूप में तारीख करने के लिए, रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के असंख्य, विशेष रूप से zebrafish भ्रूण का उपयोग किया गया है. इसके अलावा, रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन संभव है और 16-20 प्रबंधनीय बनाने के लिए कई वैज्ञानिक और तकनीकी विकास किया गया है. पीटरसन और उनके सहयोगियों ने 2000 में एक रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन में zebrafish उपयोग करने के लिए पहले थे, और बाद में 2004 में zebrafish 21,22 में एक महाधमनी निसंकुचन उत्परिवर्तन दबा दिया कि एक परिसर की पहचान की. रासायनिक स्क्रीन के बाद से कई विकासशील ऊतकों (जैसे, दिल, रक्त वाहिकाओं) 23-25, शारीरिक कार्यों (जैसे, व्यवहार के लिए मस्तिष्क संबंधी आधार) 26, वयस्क उत्थान 27,28, और diseas अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है ई मॉडल (जैसे, पेशी dystrophy और कैंसर) 29,30. इन zebrafish रासायनिक स्क्रीन के बीच में से, प्रास्टाग्लैंडिनों hematopoietic स्टेम कोशिकाओं को विनियमित खोज की है कि "बिस्तर के लिए टैंक" से स्थानांतरित करने के लिए शक्ति प्रदर्शन, मानव में चिकित्सीय परीक्षण के लिए लिया गया है 23,31-33 (एनआईएच, क्लीनिकल Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). इन क्लिनिकल परीक्षण के लिए ले जाने के लिए अभी तक है, हालांकि हाल ही में, होनहार उम्मीदवार चिकित्सा विज्ञान, पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (PKD) 34 और तीव्र गुर्दे की चोट 27,35 में सेलुलर पैथोलॉजी remediate जो गुर्दे की तरह जटिल अंगों, के लिए उभरा है. ये रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन मोटे तौर पर विकासशील zebrafish और वयस्क ऊतक समारोह पूछताछ के लिए रासायनिक आनुवंशिकी लागू करने की क्षमता में छोटे यौगिकों के परीक्षण की उपयोगिता प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, अकादमिक अध्ययन 19 के लिए उपलब्ध हैं कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध औषध संग्रह की बढ़ती सूची है.

पिछले कई वर्षों में ove_content ">, स्वचालित इमेजिंग सिस्टम 36-38 के साथ साथ, दवा वितरण और हैंडलिंग के लिए रोबोट की स्वचालित प्रणाली के उपयोग सहित रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रमुख अग्रिमों, वहाँ किया गया है. इस तरह की प्रणाली की संभावना के लिए अनुमति यौगिकों के कई हजारों का परीक्षण दोनों एचटीएस और HCS के 36-38 प्राप्त करने के लिए. दुर्भाग्य से, इन नए रोबोट उद्यमों के साथ रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के उपक्रम आम तौर पर काफी संसाधन की आवश्यकता होती है. संसाधनों के इन प्रकार के अधिग्रहण के लिए पूंजी की कमी है कि कई संस्थानों के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा हैं प्लेटों arrayed को भ्रूण के हस्तांतरण सहित रासायनिक पुस्तकालयों के रोबोट से निपटने के लिए बुनियादी सुविधाओं की स्थापना करते हैं, काम करते हैं, और इस तरह के उपकरण बनाए रखें., कई प्रयोगशालाओं, स्वचालित इमेजिंग और विश्लेषण के लिए अत्यधिक लागत आम तौर पर और अधिक सुलभ है रहता है 12. स्वचालित छवि स्क्रीनिंग मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक फिर सेकुलियों और विशिष्ट प्ररूपी विश्लेषण 12,15 सुविधा.

स्वचालित प्रणाली उपयोगी तकनीकी विकास का प्रतिनिधित्व करते हैं, कई सवाल ऐसे सीटू संकरण (इच्छा) readout के 39 में एक साबुत माउंट के साथ एक विकासात्मक प्रक्रिया पर कई हजार biologically सक्रिय यौगिकों के प्रश्न के रूप में, और अधिक ध्यान केंद्रित पुस्तिका स्क्रीन से संबोधित किया जा सकता है. प्रयोगशालाओं की संख्या बढ़ने के एक अनुसंधान प्रश्न की जांच करने के लिए zebrafish रासायनिक स्क्रीन लागू किया है, जबकि इसके अलावा, कुछ प्रयासों पर पहुँच गए हैं (अगर कोई है) संतृप्ति और कई विषयों रासायनिक आनुवंशिकी का उपयोग कर उल्लंघन किया जाना अभी बाकी है. रासायनिक स्क्रीन केवल कुछ जंगली प्रकार या ट्रांसजेनिक टैंक से मिलकर एक छोटे zebrafish कॉलोनी का उपयोग कर मार डाला जा सकता है. इसलिए, आनुवंशिक पूछताछ के लिए इस प्रपत्र / विस्तार इस क्षेत्र में विविधता लाने में दिलचस्पी सबसे zebrafish अनुसंधान समूहों द्वारा प्राप्य होना चाहिए. अलग-अलग आकार के रासायनिक पुस्तकालयों एक वाणिज्यिक वितरक और / या कर्नल से प्राप्त किया जा सकता हैlaborators. इन कारणों के लिए, रासायनिक आनुवंशिकी भी कठोर वित्त पोषण के मौसम में आर्थिक रूप से व्यवहार्य हो सकता है. उदाहरण के लिए, एक सफल स्क्रीन के लिए आवश्यक कर्मियों की संख्या, एक साथ समर्पित समय और piecing का आवंटन एक शारीरिक प्रोटोकॉल के लिए मैन्युअल प्रक्रिया नमूने: हालांकि, इस तरह के स्क्रीन के सैन्य पहलुओं योजना कैसे के रूप में एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन शुरू करने के लिए बाधाओं, कर रहे हैं कई हजार तक सैकड़ों से उस नंबर. यहाँ, हम विस्तार से एक पुस्तिका उच्च throughput प्रोटोकॉल एक पढ़ा-बाहर के रूप में इच्छा के साथ zebrafish भ्रूण में रासायनिक आनुवंशिकी प्रदर्शन करने के लिए. इस विधि mRNA टेप की riboprobe का पता लगाने के द्वारा पीछा zebrafish भ्रूण की दवा उपचार, शामिल है. यथोचित स्क्रीन कर सकते हैं इस प्रोटोकॉल, एक छोटी सी टीम या एक भी व्यक्ति का उपयोग करना और 9 सप्ताह की अवधि में एक मामूली रासायनिक पुस्तकालय लगभग 600 यौगिकों का विश्लेषण.

Protocol

यहाँ वर्णित zebrafish के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं नोट्रे डेम विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. Zebrafish में इस पुस्तिका छोटे अणु स्क्रीन के लिए अनुसंधान डिजाइन के लिए एक गाइड (चित्रा 1) प्रदान की जाती है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित के तरीके का अवलोकन एक प्रवाह चार्ट (चित्रा 2) के रूप में प्रदान की जाती है. पार्ट्स 4-10 में वर्णित भ्रूण प्रसंस्करण कदम की योजना के लिए उदाहरण लेबलिंग प्रणाली (चित्रा 3) को देखें. भ्रूण के मंचन के लिए, zebrafish मचान श्रृंखला 40 का संदर्भ लें, और पार्ट्स 9-10 में इस्तेमाल इच्छा antisense riboprobes की तैयारी के लिए, हाल ही में प्रकाशित तरीकों 41 को देखें.

Zebrafish संभोग मंडलों के 1. तैयारी

  1. कक्ष विभक्त हे / एन द्वारा अलग एक वयस्क पुरुष zebrafish और एक संभोग चेंबर में एक वयस्क महिला zebrafish, रखें.
    नोट: मास matings, इस तरह के एक2-3 महिलाओं और 2-3 पुरुषों की उन का उपयोग समूहों एकल बनती matings की तुलना में अधिक भ्रूण उत्पन्न कर सकते हैं, और उचित आकार संभोग कक्षों के साथ किया जा सकता है.
  2. दोहराने कदम 1.1 zebrafish के 25 जोड़े की कुल परीक्षण किया जाएगा कि छोटे अणुओं के हर 96 अच्छी तरह से थाली के लिए सेट अप कर रहे हैं कि इस तरह के.

Zebrafish भ्रूण 2. संग्रह

  1. अगले दिन, प्रत्येक मछली जोड़ी है कि अलग विभक्त हटाने और 1 घंटे के बाद, एक ठीक-जाल छलनी का उपयोग zebrafish भ्रूण इकट्ठा और E3 भ्रूण मध्यम (नुस्खा के लिए सामग्री सूची देखें) युक्त एक पेट्री डिश में उन्हें जगह है.
    नोट: 1 घंटा भ्रूण समान विकास के चरणों में हैं सुनिश्चित करता है कि एकत्रित भ्रूण के बाद.
  2. मलबे (जैसे, भोजन और ठोस अपशिष्ट) को हटाने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें. इसके बाद, किसी भी unfertilized अंडे भ्रूण के प्रत्येक क्लच निरीक्षण और निकालने के लिए एक stereomicroscope का उपयोग करें.
  3. फिर प्रत्येक डि जगह, E3 के भ्रूण मीडिया छानना और ताजा E3 के साथ की जगहएक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में भ्रूण की श. 2 घंटे के बाद एक stereomicroscope का उपयोग भ्रूण के प्रत्येक क्लच निरीक्षण और किसी भी unfertilized अंडे को हटा दें.
    नोट: unfertilized अंडे अन्य भ्रूण जहर कर सकते हैं और एक सेल मंच या अपारदर्शी पर होने के लिए दिखाई देगा.
  4. वे epiboly 40% तक पहुँच जब तक एक stereomicroscope का उपयोग भ्रूण के विकास की प्रगति की निगरानी करने के लिए आगे बढ़ें. 40% epiboly चरण 40 पर दो अलग-अलग परतों से बना होने लगता है कि भ्रूण के क्षेत्र आकार को ध्यान से देखें.

3. रासायनिक कमजोर पड़ने तैयारी

  1. , -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से रासायनिक पुस्तकालय थाली निकालें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर और आरटी पर यह पिघलना.
    नोट: विभिन्न पुस्तकालयों इस्तेमाल किया जा रहा विलायक पर मुख्य रूप से निर्भर करता है अलग दरों पर गल जाएगा. आमतौर पर, -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एक रासायनिक पुस्तकालय पूरी तरह से आरटी पर लगभग 3 घंटे में thawed किया जाएगा. उचित hazmat लेबलिंग के साथ एक सुरक्षित स्थान में स्टोर विगलन प्लेट (ओं). पहनें एकppropriate Eyewear, एक प्रयोगशाला कोट, और दस्ताने के दो सेट रसायनों से निपटने जब.
  2. कॉलम एक 96 अच्छी तरह से थाली के 2-12 में E3 के 99 μl जोड़ने के लिए एक 8 चैनल multichannel विंदुक का प्रयोग करें.
    नोट: हमारे अनुभव से, एक उपयुक्त शुरुआत दवा सीमा माइक्रोन 10 के बीच है - मौजूदा प्रोटोकॉल 39 में वर्णित 50 माइक्रोन, और भी रूप में. एक 1 मिमी रासायनिक पुस्तकालय शेयर प्लेट का उपयोग अगर यहाँ हम एक 10 माइक्रोन उपचार प्रदर्शित करता है.
  3. E3 के साथ अपने-अपने अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक परिसर के 1 μl जोड़ने के लिए एक 8 चैनल multichannel विंदुक का प्रयोग करें.
  4. (यहाँ, स्तंभ 12) नियंत्रण स्तंभ में 1 DMSO के μl (या उपयुक्त विलायक) पिपेट एक P10 उपयोग करें.
  5. एल्यूमीनियम पन्नी पुस्तकालय में किसी भी प्रकाश के प्रति संवेदनशील यौगिकों की रक्षा के लिए, और शेयर रासायनिक पुस्तकालय थाली वापसी करेंगे के रूप में, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ रासायनिक कमजोर पड़ने प्लेट कवर -80 भंडारण के लिए डिग्री सेल्सियस.

4. arraying zebrafish भ्रूण

  1. एक पेट्री डिश को चुनें40% epiboly चरण में zebrafish भ्रूण युक्त. एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, ध्यान से एक (1.1 मिलीलीटर) के प्रत्येक अच्छी तरह से गहरी 96 अच्छी तरह से थाली के अंदर लगभग 10 भ्रूण जगह है. कॉलम गहरी 96 अच्छी तरह से थाली के 2-12 में भ्रूण बांटना.
    नोट: शोधकर्ता सबसे अच्छा वे पूछताछ करना चाहते विकास की प्रक्रिया के अनुरूप है कि नशीली दवाओं के अलावा के timepoint का चयन करना चाहिए. एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का प्रयोग भ्रूण क्षति को कम कर सकते हैं. दवा इलाज से पहले 40% epiboly वृद्धि हुई भ्रूण मारक में परिणाम सकता है, बाद में विकास की प्रक्रिया की जांच की जा रही हैं, खासकर जब अब से पहले दवा लोगों तक पहुंचाने के लिए भ्रूण का विकास. प्रत्येक कुएं में अधिक से अधिक 15-20 भ्रूण रखने के कारण भीड़ और बचा जाना चाहिए करने के लिए विकासात्मक देरी हो सकती है. यह भ्रूण युक्त गहरी 96 अच्छी तरह से थाली रासायनिक कमजोर पड़ने 96 अच्छी तरह से थाली से अलग है कि नोट करना महत्वपूर्ण है.
  2. में अतिरिक्त E3 के प्रत्येक अच्छी तरह से अतिरिक्त E3 के हटाने, और निष्कासित करने के लिए एक गिलास हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करेंएक तरल अपशिष्ट कंटेनर.
    नोट: यह प्रक्रिया आम तौर पर शोधकर्ता की गति के आधार पर 30 मिनट के 1 करने के लिए घंटा लगता है, इसलिए भ्रूण यहाँ वर्णित रासायनिक कमजोर पड़ने के अलावा के लिए लक्ष्य विकास मंच है जो पूरा होने से 50% और 60% epiboly के बीच हैं. थाली पिपेट की नोक अतिरिक्त E3 के बंद आकर्षित करने के लिए अच्छी तरह से नीचे के खिलाफ लगाए जा सकते हैं ताकि भ्रूण अच्छी तरह से नीचे गिर करने के लिए पैदा करने के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर झुका जा सकता है.

रासायनिक उपचार के 5. जुड़ाव

  1. Arrayed zebrafish भ्रूण युक्त गहरी 96 अच्छी तरह से थाली में अपने-अपने कुओं को 100 μl रासायनिक dilutions के हस्तांतरण के लिए एक 8 चैनल multichannel विंदुक का प्रयोग करें.
    नोट: यौगिक का मूल अच्छी तरह से स्थान इसी गहरी 96 अच्छी तरह से थाली (जैसे, रासायनिक कमजोर पड़ने की थाली में बी 1 में अच्छी तरह से स्थान गहरे में बी 1 में अच्छी तरह से स्थान में pipetted है में अच्छी तरह से स्थान के साथ मेल खाता है कि सुनिश्चित करें96 अच्छी तरह से थाली).
  2. एक कागज तौलिया गीले और एक 96 अच्छी तरह से थाली पकड़ काफी बड़े एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील कंटेनर में रखें.
    नोट: गीला कागज तौलिया रासायनिक कमजोर पड़ने के वाष्पीकरण को रोकने में मदद मिलेगी.
  3. अगला, गहरी, 96 अच्छी तरह से थाली सील प्रकाश के प्रति संवेदनशील कंटेनर में जगह, और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते एक सील चटाई का उपयोग करें.
    नोट: zebrafish भ्रूण अगली सुबह तक का विकास करते हैं. वैकल्पिक रूप से, इस प्रक्रिया के लिए उचित विकास मंच का विश्लेषण किया जा रहा है जब तक भ्रूण का विकास करते हैं.

रसायन 6. निकालना

  1. दवा इलाज किया कुओं की प्रत्येक पंक्ति को E3 के 300 μl जोड़ने के लिए एक 8 चैनल multichannel विंदुक का प्रयोग करें. बंद ड्रा और कुओं की प्रत्येक पंक्ति से E3 / रासायनिक कमजोर पड़ने त्यागें. E3 के 300 μl के साथ भ्रूण 3 बार धोएं.
    नोट: इस उद्देश्य के लिए ही इस्तेमाल किया एक लेबल कंटेनर में दवा बेकार त्यागें. Washes की आसानी के लिए, mult उपयोग करने के लिए पर्याप्त विस्तृत E3 के साथ भरा एक गिलास बेसिन का उपयोगichannel पिपेट.

7. pronase और zebrafish भ्रूण फिक्सिंग

  1. चार 24 अच्छी तरह प्लेटें में एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग zebrafish भ्रूण स्थानांतरण, तो किसी भी मृत भ्रूण को हटा दें. वे मूल दवा अच्छी तरह से स्थानों के अनुरूप इतना है कि 24 अच्छी तरह प्लेटें लेबल. पिपेट में भ्रूण कल्पना करने के लिए और भ्रूण अच्छी तरह से विदेशी रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से स्थानांतरण के बाद एक काले रंग की पृष्ठभूमि के सामने पिपेट रखें.
  2. भ्रूण मुश्किल से तरल में डूबे हुए हैं कि इतने E3 के बंद आकर्षित करने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें.
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए pronase शेयर की 2 बूँदें (50 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग करें. भ्रूण कुओं जरायु अलग तोड़ने के लिए पैदा करने के लिए आंदोलन फिर 5 मिनट के लिए pronase में सेते हैं और करते हैं. वे विश्लेषण के लिए वांछित विकास के चरण में हैं पहले वैकल्पिक रूप से, भ्रूण pronase.
  4. E3 के साथ दो बार भ्रूण धोने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें.
  5. भ्रूण विश्लेषण, कंप्यूटर अनुप्रयोग के वांछित स्तर पर कर रहे हैं एक बारletely बंद आकर्षित और शेष E3 त्यागें.
  6. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ताजा 4% पीएफए ​​/ पीबीएस जोड़ने के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें. 4 डिग्री सीओ पर भ्रूण सेते / एन ठीक करने के लिए. का प्रयोग करें हौसले शुरू में भ्रूण को ठीक करने के लिए पीएफए ​​thawed.
    नोट: ब्याज की अपने स्क्रीन परख प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें. धारा 8-10 में यहाँ विस्तृत इच्छा के साथ स्क्रीन प्लेटों पर कार्रवाई करने के लिए एक प्रक्रिया है. वैकल्पिक तरीकों के रूप में वांछित है, तो धारा 11 के लिए आगे बढ़ना है और परिणामों का मूल्यांकन प्रतिस्थापित किया जा सकता.

8. भ्रूण Permeabilization

  1. आकर्षित बंद करने के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस भ्रूण से एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें और 1x साथ दो बार भ्रूण धो PBST (बीच के साथ खारा फॉस्फेट बफर). फिर भ्रूण से 1x PBST बंद आकर्षित, 48 अच्छी तरह प्लेटें में भ्रूण स्थानांतरण. गहरी 96 अच्छी तरह से थाली के मूल में अच्छी तरह से स्थानों मैच के लिए 48 अच्छी तरह प्लेटें लेबल.
  2. इसे दूर आकर्षित और 100% methano जोड़ तो एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कुओं के लिए 100% मेथनॉल जोड़कर धोभ्रूण को फिर से एल.
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण रखें, और कम से कम 20 मिनट के लिए सेते हैं. वैकल्पिक रूप से, लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल में भ्रूण रहते हैं.
  4. 100% मेथनॉल निकालें और 50% MeOH / 1x PBST, तो 30% MeOH / 1x PBST के साथ भ्रूण धोने, और अंत में दो बार 1x PBST के साथ.
    नोट: भ्रूण से अधिक उम्र के 24 घंटे के बाद निषेचन (HPF) रंजकता 39 दूर करने के लिए इस बिंदु पर प्रक्षालित किया जा सकता है.
  5. एक proteinase कश्मीर (5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) काम कर समाधान तैयार करने के लिए 1x PBST के 50 मिलीलीटर thawed proteinase कश्मीर स्टॉक (10 मिलीग्राम / एमएल) की 15 μl जोड़ें.
  6. भ्रूण से 1x PBST निकालें और proteinase कश्मीर काम कर समाधान जोड़ें. 4 मिनट के बाद proteinase कश्मीर निकालें.
    नोट: प्रयोगकर्ता भ्रूण गिरावट को रोकने के लिए इस कदम के दौरान जल्दी से काम करना चाहिए. Proteinase कश्मीर एकाग्रता और ऊष्मायन अवधि 41 इलाज किया जा रहा भ्रूण की उम्र के आधार पर अलग किया जा करने की जरूरत है. यहाँ वर्णित मापदंडों भ्रूण से संबंधित24 HPF कर रहे हैं.
  7. 1x PBST के साथ भ्रूण धो लें, फिर ठंडा 4% पीएफए ​​/ पीबीएस जोड़ें. भ्रूण आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में सेते दें.

9. संकरण और जांच निकालना

  1. एक गिलास हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग 4% पीएफए ​​/ पीबीएस हटाने और 1x PBST के साथ दो बार भ्रूण धो लो. HYB + के 500 μl के साथ 1x PBST बदलें और 70 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए भ्रूण सेते हैं.
    नोट: पूर्व संकरण के रूप में कुछ के रूप में 2 घंटे के लिए किया जा सकता है, लेकिन 4 घंटा आदर्श है. इसके अलावा, विभिन्न संकरण और धोने के तापमान में इस तरह के 65 डिग्री सेल्सियस के रूप में कुछ जांच के लिए आदर्श हो सकता है, लेकिन एक व्यक्ति के आधार पर परीक्षण किया जाना चाहिए.
  2. ब्याज 41 के जीन (ओं) के लिए इसी digoxygenin लेबल riboprobes उत्पन्न करता है.
  3. HYB + के 16 मिलीलीटर riboprobe के 16 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें. उपयोग करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर riboprobe / HYB + समाधान पूर्व गर्म. कई जांच का उपयोग करते हैं, तो एक ही एच के लिए हर जांच के लिए 16 माइक्रोग्राम प्रति जोड़नावाई बी + मात्रा (16 मिलीलीटर).
  4. एक गिलास हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, HYB + हटाने और riboprobe / HYB + मिश्रण के 200 μl पर जोड़ने के लिए एक P1000 उपयोग करें. का उपयोग करें और ऊपर पिपेट करने से ठीक पहले और नीचे एक बार अच्छी तरह से प्रत्येक में मिश्रण जोड़ने से पहले riboprobe / HYB + कॉकटेल उलटें. Riboprobe / HYB + समाधान जोड़ने के लिए बाधा पिपेट युक्तियों का उपयोग करें, इस पिपेट में प्रवेश करने से मिश्रण भाप से बचाता है.
  5. 70 डिग्री सीओ / एन पर riboprobe / HYB + कॉकटेल में भ्रूण सेते हैं. ओ / एन जांच ऊष्मायन और निम्न गर्म washes के सभी के लिए थाली कुओं को कवर करने के लिए एक चिपकने वाला फिल्म का प्रयोग करें.
  6. 70 डिग्री सीओ / एन पर 50% formamide / 2x SSCT, 2x SSCT, और 0.2x SSCT और पूर्व गर्म तैयार करें.
  7. एक P1000 उपयोग करना, riboprobe / HYB + हटाने और -20 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण की दुकान. वैकल्पिक रूप से, तीन गुना तक riboprobe / HYB + मिश्रण का फिर से उपयोग. प्रत्येक पुन: उपयोग करने से पहले, मूल ribopr को riboprobe के 3 माइक्रोग्राम प्रति में जोड़ओबीई / HYB + मिश्रण.
  8. एक गिलास हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, 70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 50% formamide / 2x SSCT साथ दो बार भ्रूण धो लो. 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2x SSCT साथ एक बार भ्रूण धो लें. 70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.2x SSCT साथ दो बार भ्रूण धो लें. 0.2x SSCT निकालें और आरटी पर दो बार MABT साथ भ्रूण धो लो.

10 विरोधी digoxygenin एंटीबॉडी ऊष्मायन और जांच

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से MABT दूर करने के लिए एक गिलास हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करें. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए नए सिरे से ब्लॉक समाधान जोड़ें. भ्रूण आरटी पर 4 घंटे के लिए ब्लॉक में सेते दें. ब्लॉक समाधान (5000 गुना कमजोर पड़ने) के 40 मिलीलीटर विरोधी digoxygenin एंटीबॉडी के 8 μl जोड़ें.
  2. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, एंटीबॉडी / ब्लॉक समाधान के साथ ब्लॉक समाधान की जगह. पूरी तरह से भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी / ब्लॉक समाधान जोड़ें.
  3. कोई प्रकाश भ्रूण के माध्यम से प्रवेश कर सकते हैं, ताकि एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 48 अच्छी तरह से थाली को कवर किया. इंक4 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण हे / एन ubate. एक गिलास विंदुक का प्रयोग, एंटीबॉडी / ब्लॉक समाधान निकालने और 5-10 मिनट प्रत्येक के लिए भ्रूण MABT साथ 10 बार धो लो.
    नोट: यह कुओं में ताजा MABT प्रत्येक थाली से MABT हटाने और वितरित करने के लिए शोधकर्ता 5-10 मिनट का समय लगेगा रूप MABT washes, लगातार किया जा सकता है.
  4. पूर्व धुंधला बफर के 40 एमएल (80 मिलीलीटर कुल) के दो ट्यूबों उत्पन्न करता है. धुंधला समाधान बनाने के लिए पूर्व धुंधला बफर के लिए तैयार ट्यूबों में से एक के लिए एनबीटी के 180 μl (50 मिलीग्राम / एमएल) और BCIP के 140 μl (50 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें.
    नोट: इस धुंधला समाधान एक बैंगनी रंग का सब्सट्रेट उत्पन्न होगा.
  5. पूर्व धुंधला बफर के साथ MABT बदलें और भ्रूण 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते दें.
  6. धुंधला समाधान के साथ पूर्व धुंधला बफर बदलें और आरटी पर छोड़ दें. वर्णमिति प्रतिक्रिया एक stereomicroscope का उपयोग हर 15 मिनट पर नज़र रखें.
    नोट: धुंधला प्रतिक्रियाओं की जांच के आधार पर कई घंटे के लिए कुछ मिनट से ले जा सकते हैं.
  7. प्रतिनिधिधुंधला प्रतिक्रिया पूरा हो गया है और फिर 5 मिनट के लिए 1x PBST के साथ दो बार भ्रूण धोने के बाद 1x PBST के साथ धुंधला समाधान फीता.
  8. 1x PBST निकालें और भ्रूण को ठीक करने के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस जोड़ें.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक विरोधी fluorescein एंटीबॉडी के साथ लेबल riboprobes पता लगाने के लिए एक डबल इच्छा करते हैं. बगल में एक डबल प्रदर्शन तो, 1x PBST धोने (चरण 10.8) के बाद 4% पीएफए ​​/ पीबीएस (चरण 10.9) जोड़ने छोड़ और MABT washes के साथ 15 मिनट के लिए दो बार, 0.1 एम ग्लिसरॉल के साथ 15 मिनट के लिए दो बार भ्रूण धोने, और ब्लॉक में 30 मिनट के लिए भ्रूण सेते हैं. उसके बाद सही धुंधला समाधान का उपयोग कर कदम 10.3-10.9 सही एंटीबॉडी हे / एन पर जोड़ सकते हैं और प्रदर्शन करते हैं. , Fluoroscein लेबल riboprobe का पता लगाने के एक लाल सब्सट्रेट निरीक्षण करने के लिए BCIP और int के साथ एक धुंधला समाधान तैयार करने के लिए (10.1 कदम को देखें).

11. स्कोरिंग रासायनिक स्क्रीन भ्रूण प्लेट्स

  1. भ्रूण sampl मूल्यांकन करने के लिए एक stereomicroscope का उपयोग कर परिणाम के दृश्य स्कोरिंग प्रदर्शनफेनोटाइप परख में तों.
  2. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, इष्टतम दृश्य के लिए 12 अच्छी तरह प्लेटें 48 अच्छी तरह प्लेटें से भ्रूण हस्तांतरण. वे मूल गहरी 96 अच्छी तरह से थाली से अच्छी तरह से स्थानों के अनुरूप इतना है कि 12 अच्छी तरह प्लेटें लेबल. हस्तांतरण पूरा होने पर, stereomicroscope के तहत देखें.
    नोट: प्रतिनिधि भ्रूण 12 अच्छी तरह प्लेटें से चयनित और एक कवर पर्ची 41 के तहत गिलास स्लाइड पर imaged किया जा सकता है.

Representative Results

यहाँ वर्णित पुस्तिका दृष्टिकोण कुशलता और सफलतापूर्वक छोटे अणु रासायनिक आनुवंशिकी zebrafish भ्रूण मॉडल (चित्रा 1) का उपयोग करते हुए स्क्रीन एक उच्च throughput संचालन करने के लिए एक भी शोधकर्ता के लिए अनुमति देता है. एक भी व्यक्ति को एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस विधि का प्रयोग, यह 9 सप्ताह के पाठ्यक्रम पर एक व्यक्ति (40 घंटा काम सप्ताह के लिए प्रतिबद्ध) ~ 600 यौगिकों के एक सर्वेक्षण बाहर ले जा सकता है कि, इस तरह के व्यावहारिक है (चित्रा 1) . इस प्रकार, एक व्यक्ति की बेंच समय उच्च संसाधन की मांग उपकरण, जैसे स्वचालित प्रणाली के लिए जरूरत बायपास कर सकते हैं. व्यापार बंद एक पुस्तिका स्क्रीन समर्पित प्रयास के कई हफ्तों की आवश्यकता है. इसके विपरीत, स्वचालित प्रणाली का उपयोग रोबोट समय के 1-2 हफ्तों में शामिल समय सेक कर सकते हैं, और समग्र अपेक्षाकृत न्यूनतम शोधकर्ता प्रयास आवश्यक हो सकता है. एक पुस्तिका स्क्रीन की दक्षता और / या दायरे को बढ़ाने के लिए एक तरह से मीटर की स्क्रीनिंग के लिए सक्षम होगा, जो कुल में 2-3 शोधकर्ताओं भर्ती करने के लिए हैअयस्क यौगिकों, अलग यौगिक एकाग्रता, और / या समय की एक छोटी अवधि में स्क्रीनिंग.

एक इच्छा readout के साथ zebrafish भ्रूण में एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन को पूरा करने के लिए प्रोटोकॉल में शामिल प्राथमिक कदम एक फ़्लोचार्ट (चित्रा 2) के रूप में सचित्र हैं. (1) रासायनिक जोखिम और भ्रूण लेबलिंग, और (2) विश्लेषण और इमेजिंग: प्रायोगिक कार्यों काम सप्ताह के दो प्रकार में विभाजित किया जा सकता है. रासायनिक जोखिम का काम सप्ताह में, इन चरणों दिवस 4 ((3 दिन) स्वस्थानी संकरण में के लिए भ्रूण की तैयारी, zebrafish वयस्कों (दिन 1), भ्रूण संग्रह, arraying भ्रूण और दवा उपचार (2 दिन) की स्थापना, और स्वस्थानी संकरण में शामिल -6). विश्लेषण / इमेजिंग सप्ताह में, शोधकर्ता भ्रूण और छवि हिट (दिन 7-11) स्कोर करने के लिए mRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है.

एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन प्रदर्शन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा लगातार और सही ढंग से अच्छी तरह से स्थानों लेबल करने के लिए है. रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन पी के रूप मेंrocess एक अलग प्लेट में एक अच्छी तरह से करने के लिए एक थाली में एक अच्छी तरह से कई बार भ्रूण के सेट के हस्तांतरण शामिल है एक रासायनिक हिट रन बनाए है जब यह रैखिक और आसानी से वापस पता लगाया जा सकता है कि इतना सटीक और स्पष्ट लेबलिंग के लिए जरूरत सर्वोपरि है, यहाँ विस्तृत रासायनिक पुस्तकालय के भीतर अपनी पहचान (चित्रा 3) के लिए. यह सुनिश्चित करने के लिए एक आसान तरीका है किसी भी समय एक यौगिक द्वारा इलाज भ्रूण का एक सेट के लिए अच्छी तरह से स्थान सीधे उन भ्रूणों का इलाज किया जाता यौगिक के रासायनिक पुस्तकालय दवा प्लेट अच्छी तरह से पांच मैचों के इस तरह है कि में प्लेटें लेबल करने के लिए है (चित्रा 3). इधर, रंग-कोडिंग और संख्यात्मक लेबल के एक दोहरी प्रणाली स्थायी मार्कर (चित्रा 3) का उपयोग करते हुए स्क्रीन प्लेटों के लिए जोड़ा गया था जो नमूने, व्यवस्थित करने के लिए उपयोग किया जाता है.

एक उच्च throughput स्क्रीन के परिणामों का विश्लेषण करते हुए, एक विधि सही ढंग से व्यवस्थित करने के लिए विकसित व्याख्या, और संभावित छोटे अणु का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता हैहिट. इसलिए, एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन सावधानी से बनाया गया है और कड़ाई से पालन किया जाता है कि एक पूरी तरह से और स्पष्ट ग्रेडिंग प्रणाली होनी चाहिए. इस तरह की एक प्रणाली को आसानी से और पूरी तरह से एक यौगिक के महत्वपूर्ण गतिशीलता हूं और समाप्त स्क्रीन के परिणाम पेश करने के लिए एक संक्षिप्त तरीके प्रदान करना चाहिए. एक ऐसी प्रणाली का निर्माण करने के लिए एक तरह से समग्र रूपात्मक गंभीरता और एक हिट का विश्वास समझाना होगा जो एक वर्ग प्रणाली, उपयोग ग्रेड भ्रूण के लिए है. इसके अलावा, वर्ग श्रेणियों के साथ मिलकर किया जा सकता है एक (+) या (-) ब्याज के क्षेत्र (ओं) पर एक विशाल या reductive प्रभाव या तो वर्णन करने के लिए. इधर, zebrafish भ्रूण 24 HPF 50% epiboly से एक bioactive पुस्तकालय (एंज़ो रसायन) से व्यक्तिगत यौगिकों के अधीन है, और फिर नेफ्रॉन क्षेत्रों (चित्रा -4 ए) का पता लगाने के लिए तीन riboprobes की एक कॉकटेल का उपयोग इच्छा से assayed गया. एक उदाहरण ग्रेडिंग प्रणाली, एक नाटकीय रूप से बढ़े हुए समीपस्थ convolu था कि भ्रूण का एक समूह होता है कि एक ही साथpronephros के टेड छोटी नली (पीसीटी), zebrafish भ्रूण गुर्दे, कि अच्छी तरह से इस मामले में सबसे गंभीर दोष के साथ जुड़े वर्ग और के उच्चतम स्तर का प्रतिनिधित्व करेंगे जो (कक्षा आई), के रूप में वर्गीकृत किया जा रहा है के इलाज के लिए इस्तेमाल किया यौगिक का कारण होगा (चित्रा 4 बी) मनाया फेनोटाइप में विश्वास. (चित्रा 4 बी) - यौगिक तो (पीसीटी) और एक (+) किया जा रहा है पूरा संकेतन (पीसीटी + वर्ग मैं) के साथ एनोटेट किया जाएगा. वर्गीकरण की यह अवधारणा, दवा और क्षेत्र है जिस तरह से प्रभावित है कि क्षेत्र जीव पर यौगिकों प्रभाव की गंभीरता सहित ब्याज का एक छोटा सा अणु के विषय में जानकारी की एक निधि, का वर्णन करने के लिए एक सरल और तेज तरीका प्रदान करता है प्रभावित (4B चित्रा).

चित्रा 1
चित्रा 1. & #160;. मैनुअल zebrafish भ्रूण रासायनिक स्क्रीन रणनीति एक शोधकर्ता feasibly zebrafish भ्रूण पर रसायनों के एक 96 अच्छी तरह से थाली का परीक्षण और एक सप्ताह के दौरान बाद में इच्छा प्रसंस्करण प्रदर्शन कर सकते हैं. रासायनिक परीक्षण (सप्ताह 1 (दिन 1-6) और 2 सप्ताह (दिन 7-12)) के दो सप्ताह के प्रदर्शन के विश्लेषण के नमूने के लिए समर्पित तीसरे सप्ताह के साथ जोड़ा जा सकता है. लगभग स्क्रीन नमूनों की कीमत दो 96 अच्छी तरह प्लेटें सप्ताह 3 (दिन 13-17) रन बनाए और imaged किया जा सकता है. इस परिदृश्य पूरी तरह से 9 सप्ताह से जांच की लगभग 600 यौगिकों के एक छोटे पुस्तकालय के लिए equating, 3 सप्ताह का समय अवधि में लगभग 200 यौगिकों की स्क्रीनिंग के बराबर है. इस पुस्तिका रणनीति उपलब्ध संसाधनों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, तीन शोधकर्ताओं यह एक शोधकर्ता साथ ले जाएगा 9 सप्ताह की तुलना में 3 सप्ताह के लिए लगभग 600 यौगिकों का एक स्क्रीन को पूरा करने के लिए समय कम कर सकते हैं. स्क्रीनिंग रणनीतियों ऐसी दवा इलाज के रूप में स्क्रीन के विशिष्ट पहलुओं के लिए शोधकर्ताओं ने बताए द्वारा अनुकूलित किया जा सकताबयान और सीटू संकरण या शोधकर्ताओं के निर्देशन में स्वतंत्र रूप से रासायनिक पुस्तकालय के अलग अलग हिस्सों पर पूरी जांच प्रक्रिया को करने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. फ़्लोचार्ट:. 6 दिन स्क्रीन कार्यप्रवाह के टूटने के रासायनिक जांच प्रक्रिया कड़ाई से 6 दिन में नीचे टूट सकता है. 1 दिन प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली की जांच की जा करने के लिए भ्रूण की आपूर्ति करने के लिए zebrafish संभोग जोड़े (= /> 25) की स्थापना के होते हैं. 2 दिन दवा उपचार के बाद, संभोग कक्षों से भ्रूण का संग्रह है और एक गहरी 96 अच्छी तरह से थाली में उन्हें arraying शामिल है. 3 दिन, भ्रूण dechorionation, ऊतक निर्धारण, और भ्रूण निर्जलीकरण सहित, काश के लिए तैयार हैं. अंत में, काश दिवस 4-6 के माध्यम से भ्रूण पर किया जाता है. एस आसानी से किया जा सकता है तय नमूनों पर कि वैकल्पिक धुंधला प्रक्रियाओं कृपया ध्यान देंइच्छा के लिए ubstituted.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्लेट हस्तांतरण लेबलिंग योजनाबद्ध. Zebrafish भ्रूण arrayed रहे हैं और दवा एक 96 अच्छी तरह से थाली में इलाज तो मलबा हटाने और pronase लोगों तक पहुंचाने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली में ले जाया गया. भ्रूण तो भ्रूण तैयारी, इच्छा, और ऊतक निर्धारण के लिए 48 अच्छी तरह प्लेटें में ले जाया जाता है. अगला, भ्रूण स्कोरिंग, इमेजिंग, और भंडारण के लिए 12 अच्छी तरह प्लेटें स्थानांतरित कर रहे हैं. भ्रूण की सटीक arraying प्रत्येक परीक्षण नमूना के लिए मूल के रासायनिक का ट्रैक रखने के शोधकर्ता सक्षम बनाता है एक रंग-कोडिंग प्रणाली का उपयोग करके पूरा किया है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4 चित्रा 4. उदाहरण ग्रेडिंग प्रणाली:. गुर्दा विभाजन परख एक इच्छा प्रयोग mRNA के प्रतिलेखन स्थान में परिवर्तन के अनुसार भ्रूण phenotypes में परिवर्तन के मूल्यांकन की अनुमति, चयनित कर रहे हैं कि जांच की पहचान के आधार पर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं दाग शोधकर्ता सक्षम बनाता है और / या स्तरों. एक उदाहरण के रूप में, zebrafish भ्रूण गुर्दे की तीन खंडों, pronephros, स्क्रीन मिक्स 1. स्क्रीन मिक्स 1 विशेष रूप से podocytes (पी) में localizes जो wt1b, से मिलकर जांच की एक कॉकटेल है का उपयोग जटिल समीपस्थ निशान जो slc20a1a लेबल थे बाहर का प्रारंभिक (डे) खंड 47 लेबल जो छोटी नली (पीसीटी), और slc12a1. (-) प्रतीक एक क्षेत्र का diminishment हुक्म लिए किया जाता है एक समय एक (+) प्रतीक एक क्षेत्र लेबल के बगल में, विस्तार या उस क्षेत्र की सकारात्मक बदलाव पर टिप्पणी करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इधर, उन्हें13-सीआईएस आरए के साथ इलाज bryos दवा एक बढ़े हुए समीपस्थ घुमावदार नलिका और podocytes पर कोई स्पष्ट प्रभाव से बाहर का प्रारंभिक खंड का एक पूरा नुकसान है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

Zebrafish में रासायनिक आनुवंशिकी दवाओं की खोज की प्रगति पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव बना सकते हैं. इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से एक छोटा सा अणु स्क्रीन का संचालन करने के लिए एक व्यक्ति या छोटे दल को सक्षम करने, एक इच्छा पढ़ने के लिए बाहर के साथ zebrafish भ्रूण में रासायनिक आनुवंशिकी प्रदर्शन करने के लिए एक पुस्तिका उच्च throughput तरीका प्रदान करता है. यह कम से कम-संसाधन विधि कई अनुसंधान समूहों के लिए रासायनिक आनुवंशिकी की व्यवहार्यता फैली हुई है. ऐसी व्यवस्था मोटे तौर पर अनुसंधान विभागों में सुलभ नहीं हैं विशेष रूप से, इस स्क्रीन रणनीति, रोबोट उपकरण का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण विकल्प प्रदान करता है. इस पुस्तिका स्क्रीन एक ही व्यक्ति एक 6 दिन काम सप्ताह में एक इच्छा readout के साथ यौगिकों में से एक 96 अच्छी तरह से थाली परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है. Zebrafish चूंकि भ्रूण माता पिता बाहर के विकास के साथ, डिंबप्रसू हैं, और भ्रूण, वे पुस्तिका साधारण उपकरणों से निपटने और शोधकर्ता कर सकते सरणी नमूनों में के लिए उत्तरदायी हैं (मिमी 1-3 के बीच) नग्न आंखों से देखने के लिए काफी बड़े हैंएक माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल के बिना बहु अच्छी तरह प्लेटें. Zebrafish तेजी से विकसित के बाद से इसके अलावा, छोटे अणु लोगों तक पहुंचाने के लिए आगे का मार्गदर्शन प्रसंस्करण जो कम से कम एक एक यौगिक का ही इलाज के बजाय दोहराया खुराक के साथ प्रभावी हो सकता है. उनके जर्दी खिला भून की जटिलता को समाप्त जो 5-6 दिनों के बाद निषेचन, के लिए पोषण का एक स्रोत प्रदान करता है क्योंकि zebrafish भ्रूण आसानी से संवर्धित कर रहे हैं. साथ ही, लार्वा अंगों के बहुमत विकसित और अनुसंधान सवालों की एक विस्तृत सरणी के अध्ययन का अवसर प्रदान करता है जो इस अवधि के दौरान कार्यात्मक हो गए हैं. भ्रूण ऊष्मायन मीडिया के लिए छोटे अणुओं के सरल इसके अलावा गैर इनवेसिव है और शोधकर्ता (ओं) दवा खुराक के लिए चयन करने के लिए, इसके अलावा के समय, और की अवधि की अनुमति देता है जोखिम-इस प्रकार कई चर पर कड़ा नियंत्रण प्रदान करने और विशिष्ट विकासात्मक प्रक्रियाओं के लिए अनुमति ब्याज के पूछे होंगे. यहाँ वर्णित है, महत्वपूर्ण अनुसंधान उत्पादकता एक छोटी timefr में प्राप्त किया जा सकता हैइस पुस्तिका स्क्रीन पद्धति का उपयोग ame. (;, अप्रकाशित Poureetezadi और Wingert चित्रा 4) हमारे अनुभव में, इस तरह के गुर्दे विकास के दौरान नेफ्रॉन विभाजन के रूप में ब्याज की एक प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए एक ज्ञात bioactive रासायनिक पुस्तकालय का उपयोग करके बल जा सकता है जो निवेश के प्रयास पर एक उच्च वापसी, वहाँ है.

यह तय zebrafish नमूनों पर एक परख शामिल है क्योंकि यहाँ वर्णित पुस्तिका रासायनिक स्क्रीन असाधारण बहुमुखी है. उदाहरण के लिए, इस रणनीति से एक सप्ताह में यौगिकों के कई प्लेटें परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और फिर अगले हफ्ते भ्रूण स्कोर करने के लिए. ऐसे immunohistochemistry या अन्य ऊतक धुंधला तैयारी के रूप में तय zebrafish नमूने पर वैकल्पिक assays, भी इच्छा पढ़ने के लिए बाहर के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है. प्रायोगिक रणनीतियों zebrafish में सेलुलर assays के कारण जल्दी विकास के चरणों के ऑप्टिकल स्पष्टता और पारदर्शिता को निभा रहे हैं करने के लिए. इसके अलावा, शोधकर्ताओं ने बाद में स्टेशन पर रंजकता को बाधित कर सकते हैंGES रसायनों का उपयोग कर या पूरी तरह कैस्पर या सरासर zebrafish 13 जैसे वर्णक-कम आनुवंशिक लाइनों के उपयोग के माध्यम वर्णक विकास की जटिलता से बचने. यह मैन्युअल छोटे अणुओं प्रशासन के लिए संभव है ब्याज के दाग (एस) की प्रक्रिया, और करने के लिए मैन्युअल रूप से एक सरल stereomicroscope का उपयोग भ्रूण स्कोर. हालांकि, यह स्वचालित छवि विश्लेषण किया जा सकता है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और वास्तव में उच्च संकल्प phenotype के विश्लेषण के लिए आवश्यक हो सकता है. इस नमूने की पुस्तिका प्रसंस्करण streamlines नग्न आंखों को आसानी से साफ़ नहीं मतभेद quantifies, और शोधकर्ता पूर्वाग्रह 15 समाप्त के रूप में उदाहरण के लिए, यह इस तरह के एक ट्रांसजेनिक पत्रकार के रूप में साथी एक प्रत्यक्ष परख के साथ एक स्वचालित छवि विश्लेषण प्रणाली के लिए बेहतर हो सकता है. सौभाग्य से, कुछ स्वचालित इमेजिंग सिस्टम उपयोगकर्ता के अनुकूल दोनों सॉफ्टवेयर लागत 15 के संदर्भ में और किफायती हैं. उपयोग और अन्य स्वचालित प्रणाली की क्षमताओं को तेजी से विकसित किया है और कर सकते हैंजीवों 12,15 स्थानांतरित करने के लिए भी दवा उपचार प्रशासन, और, ओरिएंट जीवों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. ये स्वचालित प्रणाली अनुसंधान की एक नई तकनीकी युग की शुरुआत हुई है और परीक्षण विषयों की एक बड़ी मात्रा में हेरफेर और इस प्रकार एचटीएस प्रदर्शन करने के लिए अभिनव समाधान प्रदान की है और HCS के पूरे जीवों 12,15 में दृष्टिकोण. ऐसी मशीनों इसमें शक नहीं उपयोगी उपकरण हैं, वे भी बहुत महंगी हैं और कई बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से बाहर हैं. इन स्वचालित क्षमताओं के उपयोग के बिना यह रासायनिक स्क्रीन संभव नहीं हैं कि लग सकता है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल के समय का एक उचित अवधि में एक व्यावहारिक रास्ता में एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन को पूरा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक पुस्तिका स्क्रीन का संचालन करने के लिए एक गाइड की रूपरेखा.

सामान्य में दोनों मैनुअल स्क्रीनिंग और रासायनिक आनुवंशिकी के लिए कमियां मौजूद हैं, और एक रासायनिक स्क्रीन पर जब ध्यान में रखा जाना चाहिए. विशेष रूप से, यहां का प्रदर्शन विधि एक उदारवादी डिग्री जरूरीशारीरिक दक्षता की. कौशल अभ्यास के साथ सुधार होगा के रूप में यह चिंता का विषय है, कम या पूरी तरह पुनरावृत्ति के माध्यम से नहीं रही है. विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से प्रति केवल 10 भ्रूण के रूप में वहाँ ही, सकल त्रुटि के लिए कम से कम कमरा है. एक उचित स्कोरिंग आहार का पालन किया जाना चाहिए हित के यौगिकों की पहचान करने के लिए बहुत छोटे अणुओं, प्रेरित है कि phenotype के अंतर्वेधन में भिन्न हो सकते हैं. यह इस प्रोटोकॉल का उपयोग शोधकर्ताओं वे एक हिट पर विचार करेगी कि क्या के लिए उपयुक्त कठोर मानदंड चिंतन करना है कि महत्वपूर्ण है. यह स्क्रीन के इस रूप की प्रकृति सबसे अधिक संभावना आगे रासायनिक कार्य-अप के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है जो झूठी सकारात्मक, का एक निश्चित भाग निकलेगा कि मन में रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, यह ठीक भ्रूण मंच और अतुल्यकालिक विकास सही ढंग से दवा उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने में जटिलताएं पैदा कर सकते हैं, जैसा कि कुछ ही देर में निषेचन के बाद जांच के लिए चंगुल इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, एक पूर्व के रूप में रासायनिक स्क्रीनिंग करने के संबंध मेंperimental रणनीति, सीमाओं की मेजबानी कर रहे हैं. यौगिक घुलनशीलता और वाहक अणुओं की विषाक्तता (जैसे, डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO)) भी एक मुद्दा पेश कर सकते हैं और कई अणुओं के परीक्षण में निषिद्ध किया जा सकता है. जरायु भी दवा लोगों तक पहुंचाने के लिए बाधा के रूप में कार्य कर सकते हैं. अंत में, zebrafish रासायनिक आनुवंशिकी के लिए एक शक्तिशाली और translational मॉडल हैं, भले ही ख्याल हमेशा इस तरह के एक सेल लाइन के रूप में इन विट्रो प्रणाली का उपयोग, उदाहरण के लिए, एक वैकल्पिक रासायनिक स्क्रीन रणनीति निर्धारण में लिया जाना चाहिए, पूरे के उपयोग के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है जानवरों. यह यौगिकों के प्रणालीगत प्रभाव जुटाने का लाभ प्रदान करता है और एक स्तनधारी मॉडल में परीक्षण किया जाना यौगिकों की सूची ट्राइएज करने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं कर सकते हैं फिर भी, पूरे zebrafish प्रणाली में रासायनिक उपचार, स्तनधारियों में समान दृष्टिकोण का आयोजन करने के लिए बेहतर माना जाता है.

तिथि करने के लिए, zebrafish रासायनिक स्क्रीन एक शक्तिशाली प्रायोगिक उपकरण टी प्रदान की हैओ विकास के तंत्र को चित्रित और इस तरह के रोग विकृतियों को रोकने में सक्षम अणुओं की पहचान के रूप में, चिकित्सा में उपयोग के लिए उम्मीदवार औषधीय एजेंटों का पता लगाने के लिए. उदाहरण के लिए, बर्न्स और उनके सहयोगियों द्वारा एक अध्ययन मायोकार्डियम 42 में GFP व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण का उपयोग दिल की दर के लिए एक स्वचालित सूक्ष्म अच्छी तरह से परख विकसित की है. वे विकास में दिल की दर का विश्लेषण करने के लिए इस ट्रांसजेनिक लाइन का इस्तेमाल किया और यह दवा इलाज 42 पर कैसे प्रभावित किया गया था. एक अन्य अध्ययन में, zebrafish भ्रूण में hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की जनसंख्या घनत्व परीक्षण द्वारा, प्रोस्टाग्लैंडीन E2 एचएससी आला 23 को नियंत्रित करता है कि पहचान की. यह निष्कर्ष माउस में मान्य किया गया था, और बाद में मानव गर्भनाल प्रत्यारोपण 23,31-33 (एनआईएच, क्लीनिकल Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314) में नैदानिक ​​परीक्षण के लिए लागू किया गया था. कई हाल ही के अध्ययन के माध्यम से, रासायनिक आनुवंशिकी zebrafish का उपयोग गुर्दे की बीमारी का अध्ययन करने में उपयोगी साबित हो गया है 43 के दौरान गुर्दे शामिल है कि कार्यात्मक इकाई का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रतिमान प्रदान करता है. नेफ्रॉन संरचना अत्यधिक zebrafish भ्रूण गुर्दे और वयस्क स्तनधारी गुर्दा 44-50 के बीच संरक्षित है. रासायनिक आनुवंशिकी के साथ मिलकर जब zebrafish भ्रूण गुर्दे की जांच कई अध्ययनों से स्पष्ट रूप से अपने निहित translational संभावित उदाहरण देकर स्पष्ट करना. एक रासायनिक आनुवंशिकी स्क्रीन पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (PKD) 34 में प्रमुख खिलाड़ियों माने जाते हैं जो जीन pkd2 और ift172, के लिए मैप किया गया है कि दो zebrafish म्यूटेंट पर प्रदर्शन किया गया था. स्क्रीन अखिल हिस्टोन deacetylase (HDAC) की पहचान अवरोध सामान्य रूप से उत्परिवर्ती भ्रूण में देखा रूपात्मक दोष उठा देना सकता है कि एक छोटे अणु के रूप में एक (टीएसए) trichostatin में हुई. डे Groh और उनके सहयोगियों द्वारा की गई एक अलग दृष्टिकोण induc कि यौगिकों के लिए जांचगुर्दे समारोह 35 में व्यवधान का संकेत होगा जो जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण में एड शोफ. एक हिट के रूप में PTBA पहचान करने के बाद, वे शोफ पैदा करने के अलावा, PTBA भी, गुर्दे progenitors के लिए एक मार्कर pax2a की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है कि मनाया. महत्वपूर्ण बात है, PTBA के एक अनुकूलित व्युत्पन्न तो जेंटामाइसिन प्रेरित गुर्दे की क्षति लिया और इसके अलावा, गुर्दे की क्षति 27 से सामना करना पड़ा है कि चूहों की वसूली त्वरित कि वयस्क zebrafish का प्रतिशत विपत्ति में कमी दर्ज की गई थी. साथ में ले ली, zebrafish रासायनिक आनुवंशिकी से इन योगदान इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि का उपयोग किया जा सकता है कि खोजों के प्रकार का प्रदर्शन.

रासायनिक आनुवंशिकी अनुसंधान पर्याप्त योग्यता भालू, यह कुछ चुनौतियों के बिना नहीं है. केवल यह एक यौगिक से प्रभावित किया जा रहा है कि विशिष्ट जीन या जीन निर्धारित करने के लिए जटिल बना सकता है एक रासायनिक आनुवंशिकी दृष्टिकोण का उपयोग कर. एक लक्ष्य (ओं) पाया जाता है, भले ही एक एसआईgnificant खाई यौगिक पहचान और छोटे अणु बर्ताव करती है, जिसमें कार्रवाई के तंत्र (ओं) को समझने के बीच रह सकता है. उदाहरण के लिए, यह एक यौगिक एक जीव के भीतर अलग अलग प्रभाव की एक श्रृंखला होने में सक्षम है क्योंकि एक छोटे अणु काम कर रहा है, जिसमें तंत्र निर्धारित करने के लिए मुश्किल हो सकता है. नई तकनीक और अधिक रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के आगमन zebrafish में पूरा किया जा रहा है, फिर भी, एक तंत्र का निर्धारण करने की समस्या कम होती है. पहचान यौगिकों के आणविक प्रभाव निर्धारित करने में मदद करने के लिए एक विधि तंत्र संभवतः पहले से एनोटेट डेटा से deduced किया जा सकता है जहां स्क्रीनिंग के लिए जाना जाता bioactives की एक दवा पुस्तकालय का चयन करने के लिए है. साथ ही, chemoinformatic एल्गोरिदम, डिस्कवरी गेट की तरह, जिम्मेदार माना तंत्र के साथ 14 यौगिकों का एक डाटाबेस के खिलाफ एक यौगिक के संरचनात्मक समानता तुलना कर सकते हैं कि उपयोग के लिए उपलब्ध हैं. अभी तक एक यौगिक के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक और रास्ता एक माइकर उत्पन्न करने के लिए किया जाएगाoarray उपचार के बाद प्रोफ़ाइल और फिर एक समान प्रभाव 14 बटोर कि mechanistically परिभाषित यौगिकों के लिए खोज, ऐसी कनेक्टिविटी नक्शे के रूप में माइक्रोएरे दवा प्रोफाइल, का एक संकलन में इस प्रोफाइल क्वेरी. यह दृष्टिकोण भी ब्याज की यौगिक के रूप में एक समान प्रभाव है कि आनुवंशिक म्यूटेंट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक परिसर और एक उत्परिवर्ती के बीच एक कनेक्शन ढूँढना यौगिक molecularly नदी के ऊपर या यौगिक और morpholinos साथ म्यूटेंट के इलाज से चित्रित किया जा सकता है जो संबंधित जीन, के बहाव से काम करता है कि सुझाव दे सकता है. एक अन्य विकल्प zebrafish के लिए अधिक अनुकूलित बनने के लिए जारी है जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री, होगा. इस विधि दवा उपचार के बाद विशेष प्रोटीन परिवर्तन या बाद translational संशोधनों को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, छोटे अणुओं या यहाँ तक कि पूरे पुस्तकालयों बंधन भागीदारों के पुल से नीचे के लिए चिह्नित किया जा रहा से कभी कभी सक्षम हैं. यह भी ध्यान देने योग्य है कि जबकि कैसे एक छोटा सा अणु कार्यों का तंत्र मैंमहत्वपूर्ण आयात की है, तंत्र अनजान रहते हैं, जिसके लिए एफडीए को मंजूरी दी दवाओं रहे हैं.

Zebrafish दोनों आनुवंशिक रूप से और physiologically स्तनधारियों के लिए कई समानताएं प्रदर्शन हालांकि, अभी भी दवा क्रॉसओवर 14 का एक मुद्दा है. एक अध्ययन में zebrafish भ्रूण 50 में सेल चक्र अवरोधकों के लिए एक स्क्रीन से हिट की विदेशी क्षमता की जांच की. स्क्रीन सेल चक्र गतिविधि के अधिकारी पहले से अनजान थे कि 14 हिट की पहचान में हुई. इन 14 यौगिकों में से 6 दोनों मानव और zebrafish सेल संस्कृति assays में सेल चक्र गतिविधि पाए गए, 3, 1 केवल zebrafish कोशिकाओं में सक्रिय था सेल संस्कृति assays में सीरम निष्क्रिय होना दिखाया गया है, और 4 में कोई गतिविधि नहीं था या तो zebrafish या मानव सेल संस्कृति assays के, लेकिन केवल Zebrafish पूरा जीव में. विशेष रूप से, केवल zebrafish में गतिविधि था कि 4 यौगिकों prohi सकता है कि zebrafish और स्तनधारियों के बीच मतभेद हैं कि प्रदर्शितकुछ यौगिकों के translational संभावित काटा. यह, हालांकि स्तनधारियों में गुर्दे की वसूली की दर में सुधार है कि मानव प्राप्तकर्ताओं और PTBA-डेरिवेटिव में टीका लगाना करने HSCs की क्षमता बढ़ाता है जो पीजीई 2, इस प्रकार के सबूत उपलब्ध कराने जैसे छोटे अणुओं के उदाहरण हैं, वहाँ के प्रति जागरूक होने के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है सिद्धांत की कि विदेशी 23,31-33 संभव है.

भले ही इन कमियों, रासायनिक आनुवंशिकी और यह कम से कम-संसाधन दृष्टिकोण के अनुसंधान समुदाय की पेशकश ज्यादा है. रासायनिक आनुवंशिकी zebrafish में विशेष रूप से उपयोगी है और आणविक मार्ग पूछताछ और दवाओं की खोज में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहेगा. असतत आणविक लक्ष्यों पर आधारित रासायनिक स्क्रीन ऐतिहासिक कारण सोखना, वितरण, चयापचय, उत्सर्जन, और विषाक्तता (ADMET) गुण 51 के नक्षत्र के रूप में जाना जाता है के लिए एक उच्च विफलता दर के अधीन किया गया है. करने के लिए zebrafish उपयोग रासायनिक स्क्रीनबल्कि एक असतत लक्ष्य की तुलना में, कई ADMET समस्याओं को दरकिनार और पूरे जीव के संदर्भ में प्रभावी रहे हैं कि यौगिकों की पहचान कर सकते हैं, एक प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित. वर्तमान उत्परिवर्ती उपभेदों और लक्षित आनुवंशिक म्यूटेंट और ट्रांसजेनिक्स बनाने के लिए जीनोम संपादन का उपयोग करने की क्षमता सहित zebrafish अनुसंधान, के लिए उपलब्ध संसाधनों की बढ़ती पूल के साथ, zebrafish का उपयोग संभावित रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन के एक असीम संख्या लगभग वहाँ रहे हैं. कई रासायनिक पुस्तकालयों curated, और ज्ञात bioactives, संरचनात्मक रूप विविध और structurally इसी उपन्यास यौगिकों, साथ अवधि संग्रह किया गया है. ये अभिकर्मकों वर्तमान में उपलब्ध हैं और आगे आने वाले वर्षों में बढ़ने की संभावना है कि स्क्रीन संयोजन के लिए आकर्षक अवसरों का खजाना प्रदान करते हैं. हाथ में इन संभावनाओं के साथ, इस पुस्तिका और उच्च throughput प्रोटोकॉल zebrafish का उपयोग रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन शुरू करने के लिए अनुसंधान समूहों की क्षमता को बढ़ाने के लिए एक व्यावहारिक और उपयोगकर्ता के अनुकूल रास्ता प्रदान करता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के बाद से Wingert अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए धन के द्वारा समर्थित किया गया था: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237 अनुदान; ऑफ डाइम्स तुलसी ओ'कॉनर स्टार्टर विद्वान अनुदान पुरस्कार # 5 FY12-75 के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज विश्वविद्यालय से धन शुरू; और Gallagher परिवार की ओर से एलिजाबेथ और माइकल Gallagher से नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के एक उदार उपहार स्टेम सेल शोध को बढ़ावा. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम पांडुलिपि पर गंभीर प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए पॉल टी Kroeger, जूनियर धन्यवाद. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारियों को धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके बकाया समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. अंत में, हम अपने शोध के सदस्यों को धन्यवादइस काम के बारे में उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और अंतर्दृष्टि के लिए चर्चा प्रयोगशाला.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 - 10 μl natural pipet tips USA Scientific 1111-3800
1x E3 Generate using 50x E3 and DI water.
1x PBST Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS.
10x PBS American Bioanalytical AB11072
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
20x SSC American Bioanalytical AB13156
24 well plate BD-Falcon 35-3226
4% PFA/1x PBS Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 °C.
48 well plate CytoOne CC7672-7548
50x E3 Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water.
96 deep well plate VWR 100-11-940
96 well plate sealing mat VWR 10011-946
anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Keep at -20 °C.
BCIP stock Sigma B8503 Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 °C.
block solution Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.)
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.)
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Consult the manufacturer procedure.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
embryo incubation dish Falcon 35-1005
epT.I.P.S 20-300 μl Eppendorf 22492284
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C.
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Keep at -20 °C.
filter sterilization unit Corning 430516 0.45 μm CA / 1 L volume
fine forceps Roboz RS-1050
flat-bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Formamide American Bioanalytical AB00600 Keep at -20 °C.
glass basin 90 x 50 Kimax Kimble 23000
glass pipette VWR 14673-010
glass vial Wheaton 225012
glycerol Sigma G7893
glycine Sigma G8898
glycogen Roche 10901393001
HYB+ Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 μl/μl heparin
INT stock Sigma I8377 Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 °C.
MAB Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2 L and autoclave.
MABT Generate 0.1% Tween-20 in MAB
MeOH Sigma 34860-4L
mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
multi 8-channel pipette 0.5 - 10 μl Eppendorf 3122000.019
multi 8-channel pipette 30 - 300 μl Eppendorf 3122000.051
nanodrop Thermo ND-2000c
NBT stock Sigma N6876 Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 °C.
paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
PCR-Film adhesive Eppendorf 30127.48
plate container (Pencil Box) Sterilite 1722
pre-staining buffer Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.)
Pronase Roche 11459643001 Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 °C.
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 °C.
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
rubber bulb Fisherbrand Fisher Scientific 03-448-22
staining solution-purple N/A N/A Generate using 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.
staining solution-red Generate using 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer.
stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
transfer pipet Samco 202, 204
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
waterbath Thermo 51221073 (Model # 2831)

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Zebrafish भ्रूण का उपयोग उच्च throughput आ मैनुअल छोटे अणु स्क्रीन
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Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063, doi:10.3791/52063 (2014).

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