Summary
De zebravis is een uitstekend experimenteel organisme om gewervelde ontwikkelingsprocessen en model menselijke ziekten te bestuderen. Hier, een protocol over hoe je een handmatige high-throughput chemische scherm presteren in de zebravis embryo's met een beschrijven we whole-mount in situ hybridisatie (WISH) uitgelezen.
Abstract
Zebravis hebben een veelgebruikt modelorganisme om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkelingsbiologie te onderzoeken en om menselijke ziekte pathologie geworden vanwege hun grote mate van genetische conservering met de mens. Chemische genetica houdt in het testen van het effect dat kleine moleculen hebben op een biologisch proces en wordt steeds meer een populair translationeel onderzoek methode om therapeutische verbindingen te identificeren. Zebravis zijn speciaal aantrekkelijk om voor chemische genetica vanwege hun hoge klauwen transparante embryo's die extern bevrucht produceren. Bovendien kan zebravisembryo's gemakkelijk geneesmiddel behandelde door eenvoudige toevoeging van een verbinding om de embryo media. Met behulp van whole-mount in situ hybridisatie (WISH), kan mRNA expressie duidelijk worden gevisualiseerd in zebravis embryo's. Samen, met behulp van chemische genetica en WISH, de zebravis wordt het een potente hele organisme context waarin het bepalen van de cellulaire en fysiologischeeffecten van kleine moleculen. Innovatieve vooruitgang geboekt in technologieën die machinale screening procedures te gebruiken, maar voor vele labs dergelijke opties zijn niet toegankelijk of blijven kosten prohibitief. De hier beschreven protocol uitgelegd hoe een handmatige high-throughput chemische genetische screen dat basismaterialen vereist en kan worden bewerkstelligd door een enkel individu of een klein team efficiënte tijd uitvoeren. Zo, dit protocol biedt een haalbare strategie die kan worden uitgevoerd door onderzoeksgroepen aan chemische genetica te voeren in de zebravis, die nuttig zijn voor het verkrijgen van fundamentele inzichten in ontwikkelingsprocessen, ziekte mechanismen kan worden, en om nieuwe verbindingen en signaalwegen die medisch relevante toepassingen te identificeren .
Introduction
De identificatie van effectieve therapeutische geneesmiddelen voor de behandeling van ziekten is het eindspel voor vele biomedische onderzoekers. Terwijl de identificatie en karakterisering van mogelijke farmacologische middelen voor klinische toepassingen evidente waarde voor de gezondheidszorg, is het een belangrijke uitdaging gebleven. Uiteindelijk is de ontwikkeling van vele therapeutische verbindingen afkomstig uit de kennis van hoe specifieke celtypen of ontwikkelen of functie. De zebravis, Danio rerio, is een zoetwater teleost van de familie Cyprinidae, dat is uitgegroeid tot een mainstream modelorganisme in ontwikkelingsbiologie 1. Zebravis genetisch handelbaar gewervelde dieren die gemakkelijk te onderhouden en te manipuleren voor wetenschappelijke studies 2,3 zijn. De zebravis embryo transparant extern bevrucht, en kan worden geproduceerd door de honderden van een volwassene parende slechts een week 2,3. Bovendien zebravis aandeel grote orgaansystemen en bezitten een groot degree van genetische gelijkenis met zoogdieren, waaronder mensen 4. Opvallend is dat 70% van de menselijke genen hebben een zebravis ortholoog 4. Vanwege deze overeenkomst hebben zebravis een zeer relevant experimenteel systeem voor het bestuderen van de mechanismen van ontwikkeling van vertebraten en fysiologie, en werden gebruikt om een veelheid aan menselijke ziekten 5-7 recapituleren. Deze redenen, onder anderen, hebben de zebravis een ideale kandidaat gesteld voor de voortzetting van genetische ondervragingen en heeft geresulteerd in een steeds grotere waardering voor het nut van de zebravis in biomedisch onderzoek 6,7.
In de afgelopen decennia hebben een overvloed aan genetische instrumenten ontwikkeld in de zebravis. De zebravis genoom vatbaar is voor mutagenese en transgenese 3. Tot op heden zijn een overvloed aan voorwaartse en omgekeerde genetische studies uitgevoerd, leidt tot de vorming van meer dan 9000 mutanten 3. Bovendien talrijke transgene lijnen zijnnl gecreëerd, waarin de etikettering en isolatie van specifieke celtypen 3 hebt ingeschakeld. Er zijn significante voortdurende inspanningen om te centraliseren en te verspreiden deze middelen aan de onderzoeksgemeenschap, die toegankelijk is voor laboratoria zijn op een vrij lage kosten door middel van de zebravis International Resource Center (Zirc) 8 geweest. Verder een uitgebreide repository van biologische informatie en moleculaire technieken, variërend van genexpressie patronen om sequenties en protocollen morfolino, zijn geleidelijk geannoteerd op de zebravis Information Network (ZFIN) 9-11. Deze zebravis onderzoeksinfrastructuren zijn mogelijk gemaakt door aanzienlijke NIH ondersteuning en belangenbehartiging van dit diermodel 8. Deze cache van zebravismutanten, transgene lijnen, en relevante informatie blijft van uitzonderlijke waarde aan het biologisch onderzoek gemeenschap in het algemeen te zijn. Echter, terwijl de zebravis zijn nu een gevestigde en vooraanstaande modelorganisme, zij vertegenwoordigen een largely onbenut reservoir aan de ontwikkelingsbiologie en ziekte te bestuderen door middel van het gebruik van chemische genetische screens.
Chemische genetica is het gebruik van kleine moleculen, zoals geneesmiddelen of andere verbindingen, een biologisch proces beïnvloeden in een levend systeem 12. Chemische genetica kan worden geïmplementeerd begrijpen van de moleculaire mechanismen van genfunctie, bijvoorbeeld om middelen te identificeren die reddings- of verergeren van een specifieke genetische defect 12. Verder, chemische genetica vertegenwoordigt een belangrijke straat naar translationeel onderzoek 12 uit te voeren. Terwijl traditionele forward genetische screens in diermodellen enorm krachtig zijn bij het koppelen specifieke genen ziekten, ze missen een tijdsdimensie, waardoor het moeilijk en soms onmogelijk om fenotypen kan rijzen na vroege embryogenese observeren. Bovendien kan gen redundantie de waargenomen vanuit forward genetics resultaten moeilijk te interpreteren. Als alternatief, chemische genetische screenszorgen voor fijne tijdelijke controle en tegelijkertijd een waardevol uitgangspunt voor drug discovery 12,13.
Chemische genetica kan worden uitgevoerd met in vitro systemen (bijvoorbeeld cellijnen, eiwitten) of met een in vivo systeem, zoals een geheel organisme. Toepassing van een in vitro systeem voor chemische genetica kan voordelig zijn omdat het eenvoudiger is dan een hele organisme systeem handiger werkt op een grote schaal, goedkoper en minder tijdrovend. Dientengevolge, in vitro systemen kunnen zowel high-throughput screening (HTS) en high content (HCS). Er zijn een aantal voordelen aan het gebruik van een in vitro systeem dat moet worden overwogen bij het naderen van chemische genetica, maar ook belangrijke beperkingen. Een belangrijke beperking van het gebruik van een cellijn die kleine moleculen werkzaam en niet giftig in een specifieke cellijn kan worden, maar giftig worden wanneer geïntroduceerd in een geheel organisme. Zo is de cruxhet probleem is dat in vitro systemen niet de brede context van een organisme te vangen en daarom niet altijd nauwkeurig nabootsen wat in een geheel organisme. Terwijl beproeving in gehele organismen deze problemen kunnen omzeilen, het gebruik van zoogdierlijke modellen hele organisme vormt een aantal fysische en ethische beperkingen. Zo is het screenen van geneesmiddelen in de muis logistiek belemmerd door de ruimte en kosten nodig voor een toereikende steekproef testen. Bovendien kunnen ontwikkelingskwesties moeilijk te bestuderen, omdat dat zoogdieren ontwikkelen in utero. Tot slot, terwijl het gedrag van het biomedisch onderzoek heeft een enorme maatschappelijke waarde, zijn er toch aanzienlijke behoeften aan dierenwelzijn te beschermen door het beperken van intense studies en het verlichten van de pijn en het lijden van de dieren gebruikt voor onderzoek. Zebravis bieden een goed alternatief voor het werken met hogere gewervelde dieren, zoals zoogdieren, en bovendien kan veel aandacht besteed worden aan het gebruik van chemische genetica aande embryonale en larvale stadia wanneer neurologisch verwerking afwezig of werkzaam op een laag niveau 12,13.
Tot op heden zijn een groot aantal chemische genetische screens uitgevoerd met zebravis embryo's in het bijzonder, als verbinding levering kan worden uitgevoerd door onderdompeling in embryo medium dat het geneesmiddel van belang 12-15. Verder zijn er tal van wetenschappelijke en technologische vooruitgang geweest om chemische genetische screens mogelijk en beheersbaar 16-20 te maken. Peterson en zijn collega's waren de eersten die de zebravis gebruikt in een chemische genetische screen in 2000, en later in 2004 identificeerde een verbinding die een aorta coarctatie mutatie onderdrukt in zebravis 21,22. Chemische schermen zijn sindsdien uitgevoerd meerdere ontwikkelende weefsels (bijvoorbeeld het hart, bloed, vaten) 23-25, fysiologische functies (bijv neurologische basis voor gedrag) 26, volwassen regeneratie 27,28 en diseas studie e-modellen (bv, spierdystrofie en kanker) 29,30. Uit deze zebravis chemische schermen, heeft de ontdekking dat prostaglandines reguleren hematopoietische stamcellen genomen om klinische proeven bij de mens, tonen de kracht om van "tank to bedside" 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Recenter zijn veelbelovende therapieën ontstaan voor complexe organen zoals de nieren, die cellulaire pathologie in polycystische nierziekte (PKD) 34 en Acuut nierfalen 27,35 saneren, maar deze moeten nog naar klinische proeven. Deze chemische genetische screens algemeen tonen de bruikbaarheid testen kleine verbindingen in de zebravisembryo en de mogelijkheid om chemische genetica toepassing volwassen weefsel functie ondervragen. Bovendien is er een groeiende lijst van commercieel verkrijgbare farmacologische collecties vindt academische studies 19 zijn.
ove_content "> In de afgelopen jaren zijn er belangrijke vooruitgang in genetische screening chemische technologie, inclusief het gebruik van geautomatiseerde systemen van robots voor toediening van geneesmiddelen en behandeling geweest, samen met geautomatiseerde beeldvormingssystemen 36-38. Dergelijke systemen zorgen voor de mogelijkheid het testen van vele duizenden verbindingen naar zowel HTS en HCS 36-38 te bereiken. Helaas, de onderneming van chemische genetische screens met deze innovatieve robot bedrijven doorgaans aanzienlijke middelen. Deze types van middelen een significante belemmering voor veel instellingen die het vermogen missen om te verwerven , werken, en dergelijke instrumenten te onderhouden. Terwijl oprichting van de infrastructuur voor robotische behandeling van chemische bibliotheken, inclusief de overdracht van embryo's om platen bekleed geweest, blijft onbetaalbaar voor vele laboratoria, geautomatiseerde beeldvorming en analyse is over het algemeen beter bereikbaar 12. Geautomatiseerde image screening maakt kwantificering TL transgene rekruiers en faciliteert specifieke fenotypische analyse 12,15.Hoewel geautomatiseerde systemen waardevol zijn technologische vooruitgang veel vragen worden aangepakt door meer gerichte handmatige schermen, zoals de vraag van enkele duizenden biologisch actieve verbindingen op een ontwikkelingsproces met een hele-mount in situ hybridisatie (WISH) uitlezing 39. Verder, terwijl een toenemend aantal laboratoria zebravis chemische schermen hebben ingeroepen om een onderzoeksvraag te onderzoeken, weinig (of geen) inspanningen hebben bereikt verzadiging en vele onderwerpen moeten nog worden doorbroken met behulp van chemische genetica. Chemische schermen kunnen worden uitgevoerd met een kleine zebravis kolonie bestaande uit slechts enkele wild type of transgene tanks. Daarom moet deze vorm van genetische ondervraging haalbaar door de meeste zebravis onderzoeksgroepen geïnteresseerd in het uitbreiden / diversificatie in deze arena zijn. Chemische bibliotheken van verschillende grootte kunnen worden verkregen uit commerciële distributeur en / of collaborators. Om deze redenen kan de chemische genetica zijn economisch haalbaar, zelfs in moeilijke financiering klimaten. Echter, er zijn obstakels voor het begin van een scherm chemische genetica, zoals hoe om logistieke aspecten van het scherm te plannen: bijvoorbeeld, het aantal personeelsleden dat nodig is voor een succesvolle scherm, de toewijzing van toegewijde tijd en patchwork samen een fysieke protocol handmatig proces monsters dat getal van de honderden tot enkele duizenden. Hier, we detail een handleiding high-throughput-protocol aan chemische genetica presteren in de zebravis embryo met WISH als een read-out. Deze werkwijze omvat medicamenteuze behandeling van zebravis embryo, gevolgd door riboprobe detectie van mRNA transcripten. Met behulp van dit protocol, een klein team of zelfs één persoon redelijkerwijs kan screenen en analyseren van een bescheiden chemische bibliotheek ongeveer 600 verbindingen in de tijdsspanne van 9 weken.
Protocol
De procedures voor het werken met de zebravis hier beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Notre Dame. Een gids voor de onderzoeksopzet deze handleiding kleine molecule scherm in de zebravis is aangebracht (figuur 1). Een overzicht van de in dit protocol beschreven werkwijzen wordt verschaft als een stroomschema (Figuur 2). Zie het voorbeeld etikettering (figuur 3) naar de embryo verwerkingsstappen in delen 4-10 beschreven plannen. Voor de enscenering van embryo's, verwijzen wij u naar de zebravis staging-serie 40, en voor de bereiding van WISH antisense riboprobes gebruikt in de delen 9-10, zie onlangs gepubliceerde methoden 41.
1. Voorbereiding van de zebravis Mating Chambers
- Een volwassen mannelijke zebravissen en een volwassen vrouwtje zebravis in een paring kamer, gescheiden door de kamer divider O / N.
OPMERKING: Mass dekkingen dergelijkes die middels groepen 2-3 en 2-3 vrouwtjes mannetjes meer embryo geregistreerd dan één gepaarde paringen, en kan worden uitgevoerd met geschikte grootte paring kamers. - Herhaal stap 1.1, zodat een totaal van 25 paren zebravis zijn opgezet voor elke plaat met 96 putjes van kleine moleculen die worden getest.
2. Verzameling van zebravis embryo's
- De volgende dag, verwijder de deler dat elke vis paar scheidt en na 1 uur, verzamelen zebravis embryo's met behulp van een fijne zeef en plaats ze in een petrischaal met E3 embryo medium (zie materiaal lijst voor recept).
OPMERKING: Het verzamelen van de embryo's na 1 uur zorgt ervoor dat de embryo's zijn dan vergelijkbare ontwikkelingsstadia. - Gebruik een plastic transferpipet om vuil (bijvoorbeeld voedsel en vast afval) te verwijderen. Vervolgens gebruikt u een stereomicroscoop aan elke koppeling van de embryo's te observeren en verwijder eventuele onbevruchte eieren.
- Schenk de E3 embryo media en te vervangen door verse E3, plaats dan elke dish van embryo's in een 28,5 ° C incubator. Na 2 uur in acht te nemen elke koppeling van embryo's met behulp van een stereomicroscoop en verwijder eventuele onbevruchte eieren.
OPMERKING: onbevruchte eieren kunnen andere embryo's vergiftigen en zal blijken te zijn bij de enkele cel stadium of ondoorzichtig. - Doorgaan om de ontwikkelingsdoelen voortgang van de embryo's met behulp van een stereomicroscoop tot ze 40% epiboly bewaken. Let op de bol vorm van de embryo die lijkt te bestaan uit twee afzonderlijke lagen bij de 40% epiboly fase 40.
3. Chemische Verwatering Voorbereiding
- Verwijder de chemische bibliotheek plaat uit de opslag bij -80 ° C, dek het af met aluminiumfolie en ontdooi het bij RT.
OPMERKING: Verschillende bibliotheken ontdooien verschillende snelheden primair afhankelijk van het oplosmiddel wordt gebruikt. Typisch zal een chemische bibliotheek bij -80 ° C ingevroren volledig ontdooid in ongeveer 3 uur bij KT. Store ontdooien plaat (s) op een veilige locatie met de juiste Hazmat etikettering. Draag eenppropriate brillen, een labjas, en twee sets van handschoenen bij het omgaan met chemicaliën. - Gebruik een 8 kanaals multichannel pipet tot 99 ul van E3 toe te voegen in de kolommen 2-12 van een 96 wells plaat.
OPMERKING: Vanuit onze ervaring, een passend begin drug bereik ligt tussen 10 M - 50 pm, en ook zoals beschreven in de huidige protocollen 39. Hier laten we zien een 10 uM behandeling bij gebruik van een 1 mM chemische bibliotheek stock plaat. - Gebruik een 8 kanaals multichannel pipet 1 pi van elke verbinding toe te voegen om het betreffende goed met E3.
- Gebruik een P10 tot 1 pl van DMSO (of het geschikt oplosmiddel) pipet in de stuurkolom (hier, kolom 12).
- Bedek de chemische verdunning plaat met aluminiumfolie, als de aluminiumfolie zal beschermen elke lichtgevoelige verbindingen in de bibliotheek, en de terugkeer van de voorraad chemische bibliotheek plaat naar de -80 ° C voor opslag.
4. arraying zebravis embryo's
- Selecteer een petrischaalbevattende zebravis embryo's in de 40% epiboly podium. Met behulp van een overdracht pipet voorzichtig plaats ongeveer 10 embryo in elk putje van een (1,1 ml) diep plaat met 96 putjes. Doseer embryo's in kolommen 2-12 van de diepe 96 well plaat.
OPMERKING: De onderzoeker moet het tijdstip van drugsverslaving die het best is afgestemd op het ontwikkelingsproces zij willen ondervragen selecteren. Het gebruik van een plastic transfertpipet kunnen embryo schade te minimaliseren. Omdat behandeling met geneesmiddelen voorafgaand aan 40% epiboly kan resulteren in een verhoogde embryonale sterfte, de ontwikkeling van de embryo's langer voorafgaand aan blootstelling aan het geneesmiddel, vooral wanneer later ontwikkelingsprocessen worden onderzocht. Waarbij meer dan 15-20 embryo in elk putje kan leiden tot ontwikkelingsstoornissen vertraging door verdringing en moet worden vermeden. Het is belangrijk op te merken dat de 96 diepe wells plaat met de embryo verschilt van de chemische verdunning plaat met 96 putjes. - Gebruik een glazen transferpipet om overtollig E3 te verwijderen uit elk putje, en verdrijven de overtollige E3 ineen vloeibaar afval container.
Opmerking: Dit proces duurt gewoonlijk 30 minuten tot 1 uur afhankelijk van de snelheid van de onderzoeker, zodat de embryo's tussen 50% en 60% epiboly door voltooiing, die het voorwerp ontwikkelingsfase voor toevoeging van de chemische verdunning beschreven. De plaat kan worden gekanteld onder een hoek van 45 ° te veroorzaken het embryo naar de bodem van de put te vallen zodat de punt van de pipet tegen de bodem van de put kan worden ingedrukt om verwijder de overtollige E3.
5. Toevoeging van chemische behandelingen
- Een 8 kanaals multichannel pipet om 100 ul chemische verdunningen dragen aan hun respectievelijke putjes in de diepe 96 wells plaat met array zebravisembryo.
OPMERKING: Zorg dat het origineel goed locatie van de verbinding overeenkomt met de goed locatie in het overeenkomstige diepe 96 well plaat (bijvoorbeeld, wordt de B1 goed locatie in de chemische verdunning plaat gepipetteerd in de B1 goed locatie in het diepe96 wells plaat). - Bevochtig een papieren handdoek en plaats deze in een lichtgevoelige container groot genoeg om een 96 wells plaat houden.
OPMERKING: De natte papieren handdoek zal helpen verdamping van de chemische verwatering te voorkomen. - Vervolgens gebruikt u een afsluitende mat te verzegelen de diepe 96 well plaat, plaats het in het licht gevoelige container, en incubeer het bij 28,5 ° C.
OPMERKING: Laat de zebravis embryo's te ontwikkelen tot de volgende ochtend. Als alternatief, laat de embryo's te ontwikkelen, totdat de juiste ontwikkelingsstadium voor het proces wordt geanalyseerd.
6. Het verwijderen van chemische stoffen
- Een 8 kanaals multichannel pipet 300 ul E3 aan elke rij van de met geneesmiddel behandelde putjes. Trekken uit en gooi de E3 / chemische verdunning van elke rij van putten. Was de embryo 3 maal met 300 pi E3.
OPMERKING: Gooi drug-afval in een gelabelde container alleen voor dit doel gebruikt. Voor het gemak wasbeurten Gebruik een glazen bassin gevuld met E3 breed genoeg om de mult gebruikenichannel pipet.
7. Pronase en Fixing zebravis embryo's
- Transfer zebravis embryo's met behulp van een plastic transferpipet in vier 24 well platen, verwijder dan alle dode embryo's. Label de 24 well platen, zodat ze overeenkomen met het oorspronkelijke geneesmiddel goed locaties. Plaats de pipet in de voorkant van een donkere achtergrond na elk putje transfer naar embryo's in de pipet te visualiseren en om embryo goed crossover voorkomen.
- Gebruik een plastic transferpipet te trekken uit de E3, zodat de embryo's nauwelijks worden ondergedompeld in een vloeistof.
- Gebruik een glazen pipet tot 2 druppels van pronase voorraad (50 mg / ml) en toe te voegen aan elk. Laat embryo's broeden in pronase gedurende 5 minuten en dan schudden de putten te veroorzaken het chorion aan elkaar te breken. Als alternatief pronase de embryo's voordat ze op de gewenste ontwikkelingsstadium voor analyse.
- Gebruik een plastic overdracht pipet om de embryo's twee keer wassen met E3.
- Zodra de embryo's in de gewenste fase van het onderzoek, compom- geven door te trekken uit en gooi de resterende E3.
- Gebruik een plastic transferpipet frisse 4% PFA / PBS goed toe te voegen aan elk. Incubeer de embryo's bij 4 ° CO / N op te lossen. Maak gebruik van vers ontdooide PFA om embryo's in eerste instantie op te lossen.
OPMERKING: Ga naar je scherm assay van belang uit te voeren. Hier worden beschreven in de paragrafen 8-10 is een procedure om het scherm platen verwerken met WISH. Alternatieve methoden kunnen worden vervangen zoals gewenst, ga dan naar Hoofdstuk 11 en de resultaten te evalueren.
8. Embryo Permeabilisatie
- Gebruik een plastic transferpipet te tekenen-off van de 4% PFA / PBS van de embryo's en was de embryo tweemaal met 1x (fosfaat-gebufferde zoutoplossing met Tween) PBST. Breng de embryo's in 48 well platen, dan verwijder de 1x PBST van de embryo's. Label de 48 well platen met de originele waterput locaties van de diepe 96 well plaat passen.
- Was Door toevoeging van 100% methanol aan de putjes met behulp van een plastic transferpipet teken dan het af en toe 100% methanol opnieuw de embryo.
- Plaats het embryo bij -20 ° C en incubeer gedurende ten minste 20 min. Alternatief houdt het embryo in 100% methanol bij -20 ° C voor lange termijn opslag.
- Verwijder 100% methanol en was de embryo's met 50% MeOH / 1x PBST, daarna 30% MeOH / 1x PBST en tenslotte tweemaal met 1x PBST.
OPMERKING: Embryo's die ouder zijn dan 24 uur na de bevruchting (HPF) kan worden gebleekt op dit punt aan pigmentatie 39 verwijderen. - Voeg 15 ul van ontdooide proteïnase K voorraad (10 mg / ml) tot 50 ml 1X PBST een proteinase K (5 ug / ml) werkoplossing bereiden.
- Verwijder de 1x PBST uit de embryo en voeg de proteinase K werkoplossing. Verwijder de proteinase K na 4 min.
OPMERKING: De experimentator moet snel werken tijdens deze stap om embryo degradatie te voorkomen. Proteinase K concentratie en incubatietijd te worden gevarieerd afhankelijk van de leeftijd van het embryo wordt behandeld 41. De hier beschreven parameters betreffen embryodat zijn 24 HPF. - Was de embryo's met 1x PBST, voeg vervolgens ijskoud 4% PFA / PBS. Laat de embryo's geïncubeerd in 4% PFA / PBS gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
9. Hybridisatie en Probe Removal
- Met behulp van een glas transferpipet verwijder de 4% PFA / PBS en was de embryo tweemaal met 1x PBST. Vervang de 1x PBST met 500 ul HYB + en incubeer de embryo gedurende 4 uur bij 70 ° C.
OPMERKING: Pre-hybridisatie kunnen worden uitgevoerd voor zo weinig als 2 uur, maar 4 uur is ideaal. Ook kunnen verschillende hybridisatie en wastemperaturen geschikt voor bepaalde probes, zoals 65 ° C, maar worden getest op individuele basis. - Genereer-digoxygenine gemerkte riboprobes overeenkomt met het gen (en) van belang 41.
- Voeg 16 ug riboprobe 16 ml HYB +. Voorverwarmen de riboprobe / HYB + oplossing bij 70 ° C gedurende ten minste 20 minuten voor gebruik. Bij gebruik van meerdere probes, voeg 16 pg van elke probe hetzelfde HYB + volume (16 ml).
- Met behulp van een glas transferpipet, verwijder de HYB + en gebruik een P1000 te voegen op 200 ul van de riboprobe / HYB + mengsel. Inverteer de riboprobe / HYB + cocktail juist voor gebruik en pipet op en neer eenmaal vóór toevoegen van het mengsel in elk putje. Gebruik barrière pipet tips om de riboprobe / HYB + oplossing toevoegen, dit voorkomt dat het mengsel damp uit het invoeren van de pipet.
- Incubeer de embryo riboprobe / HYB + cocktail bij 70 ° CO / N. Gebruik een zelfklevende film naar de putjes van de O / N incubatie probe en alle volgende hete wassen omvatten.
- Bereid 50% formamide / 2x SSCT, 2x SSCT, en 0,2x SSCT en pre-warm bij 70 ° CO / N.
- Met een P1000, verwijder de riboprobe / HYB + en bewaar het mengsel bij -20 ° C. Optioneel hergebruik de riboprobe / HYB + mengsel tot drie keer. Vóór elke hergebruik, voeg in 3 ug riboprobe de oorspronkelijke riboprobe / HYB + mengsel.
- Met behulp van een glazen pipet overdracht, embryo was tweemaal met 50% formamide / 2x SSCT gedurende 30 minuten bij 70 ° C. Was de embryo eenmaal met 2x SSCT gedurende 15 min bij 70 ° C. Was de embryo tweemaal met 0,2X SSCT gedurende 30 minuten bij 70 ° C. Verwijder de 0,2x SSCT en was de embryo's met MABT twee keer bij RT.
10. Anti-digoxygenine Antibody Incubation en Opsporing
- Gebruik een glazen transferpipet de MABT uit elk putje te verwijderen. Met behulp van een plastic transferpipet, voeg verse blok oplossing in elk putje. Laat de embryo incuberen in blok gedurende 4 uur bij KT. Voeg 8 ul van anti-digoxygenine antilichaam aan 40 ml blokkeeroplossing (5000-voudige verdunning).
- Met behulp van een plastic transferpipet, vervang het blok oplossing met het antilichaam / blok oplossing. Voeg genoeg antilichaam / blok oplossing volledig te bedekken de embryo's.
- Bedek de plaat met 48 putjes met aluminiumfolie, zodat geen licht door kan dringen tot het embryo. IncUbate de embryo O / N bij 4 ° C. Met behulp van een glazen pipet, verwijder het antilichaam / block-oplossing en spoel de embryo's 10 keer met MABT gedurende 5-10 minuten elk.
OPMERKING: De MABT wast kan continu worden uitgevoerd, omdat het de onderzoeker 5-10 minuten zal duren om MABT verwijderen uit elke plaat en afzien verse MABT in de putten. - Genereer twee buizen van 40 ml (80 ml totaal) pre-kleuring buffer. Voeg 180 ul van NBT (50 mg / ml) en 140 gl BCIP (50 mg / ml) in een van de bereide buizen pre-kleuring buffer om de kleuroplossing creëren.
OPMERKING: Dit kleurende oplossing zal een paars gekleurde substraat genereren. - Vervang de MABT met pre-kleuring buffer en laat de embryo incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Vervang de pre-kleuring buffer met de kleuroplossing en verlaat bij KT. Monitor de colorimetrische reactie iedere 15 min met een stereomicroscoop.
OPMERKING: Staining reacties kunnen nemen van enkele minuten tot vele uren, afhankelijk van de probe. - Repkant de kleuroplossing met 1x PBST na de kleuring reactie voltooid was en vervolgens de embryo tweemaal met 1x PBST gedurende 5 min.
- Verwijder de 1x PBST en voeg 4% PFA / PBS om de embryo's te repareren.
OPMERKING: U kunt ook het uitvoeren van een dubbele willen riboprobes voorzien van een anti-fluoresceïne antilichaam te detecteren. Als het uitvoeren van een dubbel in situ, sla het toevoegen van 4% PFA / PBS (Stap 10.9) na de 1x PBST wassen (Stap 10.8) en was de embryo tweemaal gedurende 15 min met 0,1 M glycerol, twee keer 15 minuten met MABT wast, en dan Incubeer de embryo's gedurende 30 min in blok. Voeg vervolgens op het juiste antilichaam O / N en het uitvoeren van Steps 10,3-10,9 met behulp van de juiste kleuring oplossing. Om het-fluoroscein gelabelde riboprobe detecteren, bereiden een kleurende oplossing met BCIP en INT om een rode ondergrond te observeren (zie stap 10.1).
11. Scoren de Chemical Screen Embryo Plates
- Voer visuele scoring van de resultaten met behulp van een stereomicroscoop om de embryo Sampl evaluerenes in het fenotype assay.
- Met behulp van een plastic overdracht pipet, breng de embryo's uit de 48 put platen 12 putjes voor optimale visualisatie. Label de 12 well platen, zodat ze overeenkomen met het goed plaatsen van de originele diepe 96 well plaat. Wanneer de overdracht is voltooid, te bekijken onder de stereomicroscoop.
OPMERKING: Representatieve embryo kan worden gekozen uit 12 putjes en afgebeeld op glasplaatjes onder een dekglaasje 41.
Representative Results
De handmatige benadering beschreven maakt een onderzoeker efficiënt en succesvol uitvoeren van een high-throughput klein molecuul chemische genetica screenen met het zebravis embryo model (Figuur 1). Met behulp van deze methode, is het handig voor een persoon om een scherm chemische genetica uit te voeren, zoals dat in de loop van 9 weken één persoon (zet zich in voor een 40 uur werk week) kunnen uitvoeren van een enquête van ~ 600 verbindingen (figuur 1) . Aldus kan de bank moment één persoon omzeilen de noodzaak voor high-resource veeleisende apparatuur, zoals automatische systemen. De trade-off is dat een handbediend scherm vereist een aantal weken van toegewijde inspanning. Daarentegen kan het gebruik van geautomatiseerde systemen de tijd die in 1-2 weken robotachtige tijd comprimeren, en kunnen algemeen relatief weinig inspanning onderzoeker leiden. Een manier om de efficiëntie en / of omvang van een handbediend scherm verhogen is 2-3 onderzoekers werven in totaal, waarbij screening van m zou stellenerts verbindingen variërende concentratie van de verbinding, en / of screenen gedurende een kortere periode.
De belangrijkste stappen van het protocol een chemische genetica scherm zebravisembryo's compleet met WISH uitlezing geïllustreerd als een stroomschema (Figuur 2). De experimentele taken kunnen worden onderverdeeld in twee soorten werk weken: (1) chemische blootstelling en embryo labeling, en (2) analyse en beeldvorming. In de chemische blootstelling werkweek, zijn het vaststellen van deze stappen tot de zebravis volwassenen (dag 1), het embryo, het richting geven van embryo's en behandeling met geneesmiddelen (Dag 2), het voorbereiden van embryo's voor in situ hybridisatie (dag 3), en in situ hybridisatie (Dag 4 -6). In de analyse / imaging week, de onderzoeker analyseert mRNA expressie aan embryo's en afbeeldingen bekeken (dag 7-11) te scoren.
Een cruciaal onderdeel van het uitvoeren van een scherm chemische genetica is om consequent en nauwkeurig etiketteren goed locaties. Aangezien de chemische genetica scherm process gedetailleerd hier gaat overbrengen sets van embryo's uit een putje in een plaat aan een putje in een andere plaat meerdere malen de behoefte aan nauwkeurige en duidelijke etikettering van het grootste belang, zodat wanneer een chemische treffer kan het lineair en gemakkelijk teruggevoerd haar identiteit binnen de chemische bibliotheek (Figuur 3). Een gemakkelijke manier om dit te verzekeren is om de platen label zodanig dat op elk moment de bron locatie voor een verzameling van embryo behandeld met een verbinding die rechtstreeks overeenkomt met de chemische bibliotheek drug putje plaats van de verbinding gebruikt om de embryo's te behandelen (Fig 3). Hier wordt een duale kleurcodering en numerieke labels gebruikt om de monsters, die werden toegevoegd aan de schermplaten met permanent markers (figuur 3) te organiseren.
Bij het onderzoek naar de resultaten van een high-throughput screen, er dringend behoefte aan de ontwikkeling van een werkwijze te kunnen organiseren, annoteren en mogelijke kleine molecule analyserenhits. Daarom moet er een scherm chemische genetica een grondige en heldere indeling systeem dat zorgvuldig is ontworpen en strikt te volgen hebben. Een dergelijk systeem moet gemakkelijk en volledig de belangrijke dynamiek van een verbinding te brengen en een beknopte manier om de resultaten van de afgewerkte scherm presenteren. Een manier om een dergelijk systeem construeren rang embryo gebruik van een klasse, dat algemene morfologische ernst en het vertrouwen van een hit zou verklaren. Verder zou de categorieën klasse worden gekoppeld met een (+) of (-) ofwel een expansieve of reductieve effect op de gebied (en) van belang beschrijven. Hier zijn zebravis embryo's die afzonderlijke verbindingen uit een bioactieve bibliotheek (Enzo Chemicals) 50% epiboly 24 HPF en vervolgens getest met WISH met een cocktail van drie riboprobes te nefron segmenten (Figuur 4A) detecteren. Als voorbeeld beoordelingssysteem, een goed dat een groep van embryo's die een sterk vergroot proximaal convolu had bevatted tubulus (PCT) van de pronephros de zebravis embryonale nier, zou de verbinding gebruikt voor de behandeling die zowel enkel als (klasse I), dat in dit geval het klasse geassocieerd met de meest ernstige gebrek en het hoogste zou betekenen leiden vertrouwen in het fenotype waargenomen (Figuur 4B). De verbinding zou dan geannoteerd met (PCT) en (+), het volledige notatie (Klasse I - PCT +) (Figuur 4B). Dit concept indeling een eenvoudige en snelle manier om een schat aan informatie over een klein molecuul van belang, waaronder de ernst van de verbindingen effect op het organisme te beschrijven, het gebied dat wordt beïnvloed door het geneesmiddel en de wijze waarop de regio beïnvloed (Figuur 4B).
Figuur 1. & #160;. Manual zebravis embryo chemische screen strategie Een onderzoeker gemakkelijk kunnen testen van een 96 wells plaat van chemische stoffen op de zebravis embryo's en het uitvoeren van de daaropvolgende WISH verwerking gedurende één week. Het uitvoeren van twee weken van chemische testen (Week 1 (Dag 1-6) en Week 2 (dag 7-12)) kan worden gecombineerd met een derde week gewijd aan de analyse te proeven. Ongeveer twee 96 well platen waard van het scherm monsters kunnen worden gescoord en afgebeeld Week 3 (dag 13-17). Dit scenario komt neer op de screening van ongeveer 200 verbindingen in een 3 week periode, hetgeen neerkomt op een kleine bibliotheek van ongeveer 600 verbindingen volledig afgeschermd met 9 weken. Deze handleiding strategie kan worden aangepast afhankelijk van de beschikbare middelen. Bijvoorbeeld kunnen drie onderzoekers de tijd om een scherm van ongeveer 600 verbindingen te voltooien 3 weken in vergelijking met de 9 weken zou één onderzoeker verminderen. Screening strategieën kunnen worden aangepast door aan onderzoekers specifieke aspecten van het scherm, zoals drugs traktatiement en in situ hybridisatie of aansturen onderzoekers zelfstandig uitvoeren de gehele screening op afzonderlijke delen van de chemische bibliotheek.
Figuur 2. Stroomdiagram:. Afbraak van 6 dag scherm workflow De chemische screening proces kan worden discreet opgesplitst in 6 dagen. Dag 1 bestaat het opzetten zebravis paren paren (= /> 25) embryo's te leveren voor elke plaat met 96 putjes worden gescreend. Dag 2 omvat het verzamelen van de embryo paring kamers en rangschikken ze in een diepe plaat met 96 putjes, gevolgd door een behandeling met geneesmiddelen. Op dag 3, embryo's zijn voorbereid voor WISH, waaronder dechorionation, fixatie van het weefsel, en embryo uitdroging. Tenslotte wordt WISH uitgevoerd op embryo door Day 4-6. Houd er rekening mee dat alternatieve kleuringen op vaste monsters kan gemakkelijk in substituted voor WISH.
Figuur 3. Plate overdracht etikettering schema. Zebravis embryo's worden gekleed en drugs behandeld in een 96 wells plaat vervolgens verplaatst naar een 24 wells plaat op vuil verwijdering en pronase blootstelling. De embryo's worden vervolgens verplaatst naar 48 well platen voor embryo voorbereiding, WISH, en fixatie van het weefsel. Vervolgens worden de embryo's overgebracht naar platen met 12 putjes voor het scoren, beeldvorming, en opslag. Precieze arraying van embryo wordt bereikt door het gebruik van een kleurcodering systeem dat de onderzoeker in staat stelt om bij te houden van de chemische van oorsprong voor ieder monster te houden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Voorbeeld beoordelingssysteem. Nier segmentatie WISH assay Een experiment kan de onderzoeker bepaalde celtypes gebaseerd op de identiteit van de probes die geselecteerd vlek, voor de evaluatie van veranderingen in embryo fenotypes volgens veranderingen in mRNA transcriptie locatie en / of niveaus. Als bijvoorbeeld drie segmenten van de zebravis embryonale nier, de pronephros, werden gelabeld met Screen Mix 1. Scherm Mix 1 is een cocktail van probes bestaande uit wt1b, die specifiek lokaliseert in de podocyten (P), slc20a1a dat de proximale gekronkelde markeert tubulus (PCT), en slc12a1 die de distale vroeg (DE) segment 47 etiketten. A (+) symbool naast een gebied label wordt gebruikt om de uitbreiding of positieve verplaatsing van die regio annoteren, terwijl een (-) symbool wordt de achteruitgang van een gebied bepalen. Hier, embryos geneesmiddel behandeld met 13-cis-RA hebben een vergrote proximale tubulus en een volledig verlies van de distale vroege segment met geen duidelijk effect op de podocytes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Chemische genetica in de zebravis kan een belangrijke invloed hebben op de progressie van drug discovery maken. Dit protocol biedt een handmatige high-throughput methode om chemische genetica presteren in de zebravis embryo's met een WISH uitlezing, effectief waardoor een individu of een klein team aan een klein molecuul scherm uit te voeren. Dit minimal-resource methode breidt de haalbaarheid van chemische genetica aan vele onderzoeksgroepen. Specifiek deze strategie scherm geeft een belangrijk alternatief voor het gebruik van robotachtige instrumenten, zoals zulke systemen niet breed toegankelijke over onderzoeksgroepen. Dit handbediend scherm kan één individu om een 96 wells plaat van verbindingen te testen met een WISH uitlezing in een 6 daagse werkweek. Omdat zebravis zijn ovipaar, de embryo ontwikkeling buiten de ouder, en de embryo's zijn groot genoeg om met het blote oog (tussen 1-3 mm), zijn ze vatbaar voor het hanteren met eenvoudige instrumenten en de onderzoeker kan reeks monstersmeerputjesplaten zonder gebruik van een microscoop. Aangezien verder zebravis snel ontwikkelen, kleine molecule blootstelling effectief met een enkele behandeling van een verbinding, in plaats herhaalde doses, die verder handmatige verwerking minimaliseert zijn. Zebravis embryo's zijn gemakkelijk gekweekt omdat hun dooier biedt een bron van voeding tot 5-6 dagen na de bevruchting, waarbij de complicatie van bak voeden elimineert. Bovendien is de meerderheid van de larvale organen ontwikkeld en functioneel worden tijdens deze periode, die de mogelijkheid om een breed scala van onderzoeksvragen bestuderen levert. De eenvoudige toevoeging van kleine moleculen de embryo incubatiemedium niet-invasief en kan de onderzoeker (s) te kiezen voor drug dosis, tijdstip van toevoeging en de duur van de blootstelling, waardoor strakke controle over vele variabelen en waarbij specifieke ontwikkelingsprocessen van belang om te worden bevraagd. Zoals hier beschreven, kunnen aanzienlijke onderzoeksproductiviteit in een korte timefr bereiktame met behulp van deze handleiding scherm methodologie. In onze ervaring is een hoog rendement op het ingelegde inzet, die kan worden verkregen door een bekende bioactieve chemische bibliotheek een werkwijze van belang, zoals nefron segmentatie tijdens renale ontwikkeling ervan (figuur 4; Poureetezadi en Wingert, ongepubliceerd).
De handleiding chemische scherm hier beschreven is bijzonder veelzijdig omdat het gaat om een test op vaste exemplaren zebravis. Bijvoorbeeld kan deze strategie worden herzien om verschillende platen van testverbindingen in een week en daarna embryo's score van de volgende week. Alternatieve assays op vaste zebravis monsters, zoals immunohistochemie of ander weefsel kleuring preparaten kunnen ook worden vervangen door de WISH uitlezing. Experimentele strategieën uitvoeren cellulaire assays zebravis aanpasbaar door de optische helderheid en transparantie van de vroege ontwikkelingsstadia. Verder kunnen onderzoekers remmen pigmentatie bij later stages gebruik van chemicaliën of te vermijden de complicatie van pigment ontwikkeling helemaal door het gebruik van pigment-minder genetische lijnen zoals casper of pure zebravis 13. Het is mogelijk om kleine moleculen handmatig beheren, verwerken de vlek (s) van belang, en handmatig scoren embryo's met behulp van een eenvoudige stereomicroscoop. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat geautomatiseerde beeldanalyse kan worden uitgevoerd, en kan in feite worden verlangd voor hoge resolutie fenotype analyse. Zo kan het de voorkeur om samen een geautomatiseerd systeem voor beeldanalyse met een directe test, zoals een transgene reporter, omdat dit stroomlijnt de handmatige verwerking van monsters, kwantificeert verschillen niet gemakkelijk te onderscheiden met het blote oog, en elimineert onderzoeker vooringenomenheid 15. Gelukkig is een aantal geautomatiseerde imaging systemen zijn zowel gebruiksvriendelijk en zuinig in termen van software kosten 15. Het gebruik en de mogelijkheden van andere geautomatiseerde systemen zich snel hebben ontwikkeld en kanworden gebruikt om te oriënteren organismen, beheren behandelingen met medicijnen, en zelfs te verhuizen organismen 12,15. Deze geautomatiseerde systemen hebben een nieuw technologisch tijdperk van onderzoek aangekondigd en hebben innovatieve oplossingen voorzien om grote hoeveelheden van proefpersonen te manipuleren en dus HTS voeren en HCS benaderingen in de gehele organismen 12,15. Hoewel dergelijke machines zijn onmiskenbaar handige tools, ze zijn ook zeer kostbaar en zijn buiten het bereik van vele fundamentele onderzoekslaboratoria. Zonder toegang tot deze geautomatiseerde functies het lijkt chemische schermen zijn niet mogelijk. Echter, dit protocol schetst een handleiding voor hoe je een handbediend scherm dat kan worden gebruikt om een scherm van chemische genetica te voltooien op een praktische manier over een redelijke termijn uit te voeren.
Nadelen voor zowel handmatige screening en chemische genetica in het algemeen bestaan, en moet in gedachten worden gehouden bij het overwegen van een chemische scherm. In het bijzonder, de werkwijze hier aangetoond vereist enige matevan fysieke behendigheid. Deze zorg is verminderd of geheel ondervangen door herhaling, zoals behendigheid zal verbeteren met de praktijk. Daarnaast is er een minimale ruimte voor grove fout, want er zijn slechts 10 embryo's per goed voor analyse. Kleine moleculen kunnen variëren in de penetrantie van het fenotype dat wordt opgewekt, zodat een redelijk scorende regime om verbindingen van belang moeten worden nageleefd om te identificeren. Het is van vitaal belang dat de onderzoekers met behulp van dit protocol te bedenken voldoende strenge criteria voor wat ze een hit zal overwegen. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat de aard van deze vorm van scherm een bepaald gedeelte van valse positieven die worden afgebakend door verdere chemische opwerking waarschijnlijk zal opleveren. Verder, is het essentieel om embryo nauwkeurig fase en koppelingen voor screening verzamelen kort na de bevruchting, zoals asynchrone ontwikkeling kan leiden tot complicaties in het effect van behandeling met geneesmiddelen nauwkeurig evalueren. Verder, met betrekking tot chemische screening afperimental strategie, zijn er tal van beperkingen. Verbinding oplosbaarheid en toxiciteit van dragermoleculen (bijvoorbeeld dimethylsulfoxide (DMSO)) kan ook een probleem oplevert en prohibitief in testen vele moleculen. Het chorion kan ook fungeren als barrière voor blootstelling aan het geneesmiddel. Tenslotte, terwijl zebravis is een krachtige en translationele model chemische genetica erop moet altijd bij het bepalen of een andere chemische screen strategie, bijvoorbeeld met een in vitro systeem taken zoals een cellijn, kan vervangen het gebruik van hele dieren. Niettemin is chemische behandeling het gehele zebravis systeem beschouwd voorkeur geleidende soortgelijke aanpak in zoogdieren, omdat het het voordeel van het verzamelen van de systemische effecten van de verbindingen en kunnen onderzoekers door de lijst van te onderzoeken verbindingen in een zoogdiermodel triage.
Tot op heden hebben de zebravis chemische schermen voorzien van een krachtige experimentele instrument to bakenen de mechanismen van ontwikkeling en kandidaat farmacologische middelen bepalen voor gebruik in de geneeskunde, zoals de identificatie van moleculen die in staat profylactische pathologieën. Bijvoorbeeld, een studie van Burns en collega's ontwikkelden een geautomatiseerde micro-well assay hartfrequentie transgene zebravis embryo die GFP tot expressie gebracht in het myocardium 42. Ze gebruikten deze transgene lijn om de hartslag in de ontwikkeling te analyseren en hoe het werd beïnvloed op de behandeling met geneesmiddelen 42. Een andere studie, door het testen van de bevolkingsdichtheid van hematopoietische stamcellen in het zebravis embryo, vastgesteld prostaglandine E2 regelt de HSC niche 23. Deze bevinding werd bevestigd in de muis, en werd later geïmplementeerd voor klinische tests in de menselijke navelstreng transplantaties 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Door middel van een aantal recente studies, heeft de chemische genetica bewezen nuttig bij het bestuderen van nierziekte met behulp van de zebravis te zijn
Terwijl chemische genetica onderzoek draagt substantieel verdienste, het is niet zonder bepaalde uitdagingen. Uitsluitend een chemisch genetische benadering kan het ingewikkeld om het specifieke gen of genen die worden beïnvloed door een verbinding te bepalen. Zelfs als een doel (en) wordt gevonden, een significant kloof kan tussen identificatie verbinding en het begrijpen van het mechanisme (s) van de actie waarbij het kleine molecuul gedraagt blijven. Bijvoorbeeld, kan het moeilijk zijn om het mechanisme waarin een klein molecuul optreedt omdat een enkele verbinding kan hebben een aantal verschillende effecten in een organisme te bepalen. Echter, met de komst van nieuwe technologieën en chemische genetische screens in zebravis voltooid, het probleem van het bepalen van een mechanisme krimpt. Een methode om te bepalen de moleculaire effecten van die verbindingen om een geneesmiddel bibliotheek van bekende bioactieve voor screening, waarbij eventueel mechanismen kunnen worden afgeleid uit eerder geannoteerde gegevens te selecteren. Daarnaast chemoinformatic algoritmes, zoals Discovery poort, zijn beschikbaar voor gebruik dat structurele overeenkomsten van een verbinding met een database van verbindingen kunnen vergelijken met toegeschreven mechanismen 14. Nog een andere manier om het mechanisme van een verbinding helderen zou een micr genererenoarray profiel na behandeling en ondervraag dit profiel in een compilatie van microarray geneesmiddel profielen, zoals Connectivity kaart, zoekt mechanistisch gedefinieerde verbindingen die een soortgelijk effect 14 wekken. Deze benadering kan ook worden gebruikt om genetisch mutanten met een soortgelijk effect als de verbinding van belang te identificeren. Het vinden van een verbinding tussen een verbinding en een mutant zou kunnen suggereren dat de verbinding werkt moleculair stroomopwaarts of stroomafwaarts van de bijbehorende gen, die kunnen worden afgebakend door behandeling van de mutanten met de verbinding en morpholinos. Een andere optie zou massaspectrometrie, die blijft meer geoptimaliseerd voor zebravis te worden. Deze methode kan worden gebruikt om specifieke wijzigingen eiwit of post-translationele modificaties na behandeling met geneesmiddelen bakenen. Tot slot, kleine moleculen of zelfs hele bibliotheken zijn soms gemerkt kan worden voor pull-down van bindende partners. Het is ook vermeldenswaard, dat, terwijl het mechanisme van hoe een klein molecuul functies is significante invoer, er FDA goedgekeurde geneesmiddelen waarvoor de mechanismen onbekend.
Hoewel zebravis vertonen veel overeenkomsten zoogdieren zowel genetisch en fysiologisch, er nog steeds een probleem geneesmiddel crossover 14. Een studie onderzocht de crossover vermogen van de hits van een scherm voor celcyclus inhibitoren in de zebravis embryo's 50. Het scherm resulteerde in de identificatie van 14 hits die voordien onbekend celcyclus bezitten waren. Van deze 14 verbindingen, 6 bleken celcyclus activiteit in menselijke en zebravis celkweektests, 3 werden geïnactiveerd serum in celkweek assays, 1 was alleen actief in zebravis cellen en 4 hadden geen activiteit in beide zebravis of humane celkweek assays, maar alleen in de zebravis hele organisme. Met name de verbindingen die 4 hadden alleen activiteit in de zebravis blijkt dat er verschillen tussen zebravis en zoogdieren die kunnen prohibeet de translationele vermogen van sommige verbindingen. Dit is een belangrijke overweging bewust van, maar er zijn voorbeelden van kleine moleculen, zoals PGE2 die het vermogen van HSCs om engraft menselijke ontvangers en PTBA-derivaten die de mate van renale herstel in zoogdieren te verbeteren versterkt, waardoor het bewijs te van principe dat crossover is mogelijk 23,31-33.
Ongeacht deze valkuilen, chemische genetica en deze minimal-resource benadering heeft veel aan de onderzoeksgemeenschap te bieden. Chemische genetica is vooral handig in de zebravis en blijft een cruciale rol spelen in de moleculaire route verhoor en drug discovery. Chemische schermen gebaseerd op discrete moleculaire doelen hebben in het verleden onderhevig aan een hoge percentage mislukkingen te wijten aan wat bekend staat als de constellatie van adsorptie, distributie, metabolisme, excretie en toxicologische (ADMET) eigenschappen 51. Chemische schermen gebruik te maken van zebravisgericht op een werkwijze, in plaats van een discrete doel kunnen verschillende ADMET problemen omzeilen en identificeren van verbindingen die werkzaam in de context van het gehele organisme. Met de toenemende pool van beschikbare middelen voor de zebravis onderzoek, inclusief de huidige gemuteerde stammen en de mogelijkheid om genoom bewerken gebruiken om gerichte genetische mutanten en transgene planten te creëren, zijn er vrijwel een onbeperkt aantal potentiële chemische genetische screens met behulp van de zebravis. Veel chemische bibliotheken zijn samengesteld, en overspanning collecties met bekende bioactieve, nieuwe verbindingen, structureel divers en structureel vergelijkbaar. Deze reagentia leveren een schat aan interessante mogelijkheden voor het scherm combinaties die momenteel beschikbaar zijn en zullen waarschijnlijk verder zal groeien in de komende jaren. Met deze mogelijkheden in de hand, deze handleiding en high-throughput-protocol zorgt voor een praktische en gebruiksvriendelijke manier om het vermogen van de onderzoeksgroepen aan chemische genetische screens ondernemen met behulp van zebravis verhogen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de financiering aan de Wingert onderzoekslaboratorium van het volgende: National Institutes of Health verleent K01 DK083512, DP2 OD008470, en R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar subsidieverlening # 5-FY12-75; opstarten fondsen van de University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences; en een gulle gift aan de Universiteit van Notre Dame van Elizabeth en Michael Gallagher namens de Gallagher Family te bevorderen stamcelonderzoek. De financiers had geen rol in de onderzoeksopzet, dataverzameling en analyse, besluit tot publicatie, of de bereiding van het manuscript. Wij danken Paul T. Kroeger, Jr. voor het verstrekken van kritische feedback op het manuscript. Wij danken de medewerkers van de afdeling Biologische Wetenschappen voor hun steun, en het Centrum voor zebravis Research in Notre Dame voor hun uitstekende inzet in de zorg en het welzijn van onze zebravis kolonie. Tot slot danken wij de leden van onze research lab voor hun opmerkingen, discussies en inzichten over dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 10 μl natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1x E3 | Generate using 50x E3 and DI water. | ||
| 1x PBST | Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS. | ||
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1x PBS | Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 °C. | ||
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50x E3 | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water. | ||
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 °C. |
| block solution | Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) | ||
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 μl | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 μm CA / 1 L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 μl/μl heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2 L and autoclave. | ||
| MABT | Generate 0.1% Tween-20 in MAB | ||
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 - 10 μl | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) | ||
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | Generate using 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. | ||
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
References
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
- Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D.
- Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
- Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
- Peterson, R. T., Fishman, M. C.
- Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
- Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
- Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
- Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
- Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
- Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
- Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
- Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
- Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
- Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B.
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
- Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
- Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).
