Summary
Den zebrafisk är ett utmärkt experimentell organism att studera ryggradsdjur utvecklingsprocesser och modell mänsklig sjukdom. Här beskriver vi ett protokoll om hur man utför en manuell hög genomströmning kemisk skärmen i zebrafiskembryon med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) avläsning.
Abstract
Zebrafisk har blivit en allmänt använd modellorganism för att undersöka de mekanismer som ligger bakom utvecklingsbiologi samt studera mänskliga sjukdomar patologi på grund av deras betydande grad av genetisk bevarande med människor. Kemisk genetik innebär testa effekten att små molekyler har en biologisk process, och har blivit en populär translationell forskning metod för att identifiera terapeutiska föreningar. Zebrafisk är speciellt tilltalande att använda för kemisk genetik på grund av deras förmåga att producera stora kopplingar av transparenta embryon, som utvändigt är befruktade. Vidare kan zebrafiskembryon enkelt vara drog behandlas genom den enkla tillsatsen av en förening till embryot medier. Att använda hela montera in situ hybridisering (WISH), kan mRNA-uttryck tydligt visualiseras inom zebrafiskembryon. Tillsammans, med hjälp av kemisk genetik och önskar blir zebrafisk en potent hel organism sammanhang som att bestämma den cellulära och fysiologiskaeffekter av små molekyler. Innovativa framsteg har gjorts i fråga om teknik som utnyttjar maskinbaserade procedurer, men för många laboratorier sådana alternativ inte är tillgängliga eller fortfarande kostsamt. Protokollet som beskrivs här förklarar hur man ska utföra en manuell hög genomströmning kemisk genetisk skärm som kräver grundläggande resurser och kan utföras av en enda individ eller en liten grupp på ett effektivt tidsperiod. Således ger detta protokoll en genomförbar strategi som kan genomföras av forskargrupper för att utföra kemisk genetik i zebrafisk, vilket kan vara användbart för att få grundläggande insikter i utvecklingsprocesser, sjukdomsmekanismer, samt att identifiera nya föreningar och signalvägar som har medicinskt relevanta tillämpningar .
Introduction
Identifieringen av effektiva terapeutiska läkemedel för att behandla ohälsa är slutspelet för många biomedicinska forskare. Medan identifiering och karakterisering av potentiella farmakologiska medel för kliniska tillämpningar har uppenbara värde för sjukvården, har det varit en stor utmaning. Ytterst kommer utvecklingen av många terapeutiska ämnen från kunskap om hur specifika celltyper antingen utveckla eller funktion. Den zebrafisk, Danio rerio, är en sötvattens teleost av familjen Cyprinidae som har blivit en mainstream modellorganism i utvecklingsbiologi 1. Zebrafisk är genetiskt lätthanterliga ryggradsdjur som är lätta att underhålla och manipulera för vetenskapliga studier 2,3. Den zebrafisk embryot är transparent, externt befruktade, och kan produceras i hundratal från en enda vuxen parning par i bara en vecka 2,3. Dessutom zebrafisk aktie större organsystem och besitter en stor degree av genetisk likhet med däggdjur, inklusive människor 4. Påfallande, 70% av människans gener har en zebrafisk ortolog 4. På grund av denna likhet, har zebrafisk varit en mycket relevant experimentellt system för att studera mekanismerna för ryggradsdjur utveckling och fysiologi, och har använts för att sammanfatta en mängd mänskliga sjukdomar 5-7. Dessa skäl, bland andra, har gjort zebrafisk en idealisk kandidat för fortsatta genetiska förhör och har resulterat i ett stadigt ökande uppskattning för nyttan av zebrafisk i biomedicinsk forskning 6,7.
Under de senaste decennierna har ett överflöd av genetiska verktyg utvecklats i zebrafisk. Den zebrafisk genomet är mottaglig för mutagenes och transgenes 3. Hittills har en uppsjö av framåt och bakåt genetiska studier utförts, vilket leder till uppkomsten av över 9000 mutanter 3. Dessutom, många transgena linjer har varasv skapas, vilket har gjort det möjligt för märkning och isolering av specifika celltyper 3. Det har skett betydande pågående insatser för att centralisera och distribuera dessa resurser till forskarsamhället, som är tillgängliga för laboratorier på en relativt låg kostnad genom Zebrafish International Resource Center (Zirc) 8. Vidare har ett omfattande arkiv med biologisk information och molekylära verktyg, allt från genexpressionsmönster att morfolino sekvenser och protokoll, har successivt kommenterad på Zebrafish Information Network (ZFIN) 9-11. Dessa zebrafisk forskningsinfrastruktur har möjliggjorts genom betydande NIH stöd och förespråkande av denna djurmodell 8. Denna cache av zebrafisk mutanter, transgena linjer och relevant information fortsätter att vara ett exceptionellt värde för den biologiska forskarvärlden i allmänhet. Men medan zebrafisk är nu en väl etablerad och dominerande modellorganism, representerar de en largely outnyttjad reservoar för att studera utvecklingsbiologi och sjukdomar genom användning av kemiska genetiska skärmar.
Kemisk genetik är användningen av små molekyler, såsom läkemedel eller andra föreningar, för att påverka en biologisk process i ett levande system 12. Kemisk genetik kan genomföras för att förstå de molekylära mekanismer geners funktion, såsom att identifiera ämnen som räddnings- eller förvärra en specifik genetisk defekt 12. Vidare, kemisk genetik utgör en viktig väg att bedriva translationell forskning 12. Medan traditionella framåt genetiska skärmar i djurmodeller har varit oerhört kraftfull i att koppla specifika gener för sjukdomar, de saknar en tidsdimension, vilket gör det svårt eller ibland omöjligt att observera fenotyper som skulle uppstå efter tidig embryogenes. Dessutom kan gen redundans göra resultaten som observerats vid termins genetik svåra att tolka. Alternativt, kemiska genetiska skärmarmöjliggöra fin temporal kontroll och samtidigt ge en värdefull utgångspunkt för läkemedelsutveckling 12,13.
Kemisk genetik kan utföras med användning in vitro-system (t.ex., cellinjer, proteiner) eller med användning av ett in vivo-system, såsom en hel organism. Med användning av ett in vitro-system för kemisk genetik kan vara fördelaktigt eftersom det är enklare än en hel organism systemet, lättare att arbeta med i stor skala, mindre kostsam och mindre tidskrävande. Som ett resultat av in vitro-system tillåta både för high-throughput screening (HTS) och hög halt screening (HCS). Det finns ett antal fördelar med att använda ett in vitro-system som bör beaktas när man närmar kemisk genetik, men också betydande begränsningar. En stor begränsning med att använda en cellinje är att små molekyler kan vara effektiva och icke-toxiska i en specifik cellinje, och ändå bli giftiga när de införs i en hel organism. Således, den springande punktenav emissionen är att in vitro-system inte fånga den breda ramen för en organism och därför inte alltid möjlighet att exakt efterlikna vad som händer i en hel organism. Medan förening testning i hela organismer kan kringgå dessa frågor, användning av däggdjurs hela organismen modeller innebär ett antal fysiska och etiska begränsningar. Till exempel är drogscreening i musen logistisk hindras av det utrymme och kostnader som krävs för att testa ett adekvat antal prov. Dessutom kan utvecklingsmässiga frågor vara svåra att studera på grund av det faktum att däggdjur utvecklas i livmodern. Slutligen, medan genomförandet av den biomedicinska forskningen har stor samhällsnytta, finns det ändå stora behov för att skydda djurens välbefinnande genom att begränsa intensiva studier och lindra smärta och lidande för djur som används för forskning. Zebrafish ger en livskraftig substitut att arbeta med högre ryggradsdjur som däggdjur, och dessutom kan många ämnen studeras med kemisk genetik vidde embryonala och larvstadier när neurologisk behandling är frånvarande eller operativ på en låg nivå 12,13.
Hittills har en myriad av kemiska genetiska skärmar utförts med hjälp av zebrafisk embryon i synnerhet, eftersom förening leverans kan åstadkommas genom att sänka ner embryon i media innehållande drogen av intresse 12-15. Vidare har ett stort antal vetenskapliga och tekniska framsteg för att göra kemiska genetiska skärmar möjligt och hanterbart 16-20. Peterson och kollegor var de första att använda zebrafisk i en kemisk genetisk skärm under 2000, och senare under 2004 identifierat en förening som undertryckte en aorta coarctation mutation i zebrafisk 21,22. Kemiska skärmar har sedan genomförts för att studera flera utvecklings vävnader (t.ex., hjärta, blod, fartyg) 23-25, fysiologiska funktioner (t.ex. neurologisk grund för beteende) 26, vuxen regenere 27,28, och diseas e modeller (t.ex. muskeldystrofi och cancer) 29,30. Bland dessa zebrafisk kemiska skärmar, har upptäckten att prostaglandiner reglerar hematopoetiska stamceller förts till kliniska prövningar på människa, vilket visar kraften att gå från "tanken till säng" 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). På senare tid har lovande läkemedel uppstått för komplexa organ såsom njurarna, vilket sanera cellulär patologi i polycystisk njursjukdom (PKD) 34 och akut njurskada 27,35, även om dessa har ännu inte flytta till kliniska prövningar. Dessa kemiska genetiska skärmar visar i stort sett nyttan av att testa små föreningar i utvecklingszebrafisk och förmåga att tillämpa kemisk genetik att förhöra vuxen vävnad funktion. Dessutom finns det en växande lista av kommersiellt tillgängliga farmakologiska samlingar som är tillgängliga för akademiska studier 19.
ove_content "> Under de senaste åren har det funnits framstående framsteg inom kemisk genetisk screening teknik, inklusive användning av automatiserade system av robotar för läkemedelsdispensering och hantering, tillsammans med automatiska bildsystem 36-38. Sådana system medger möjlighet till testa tusentals av föreningar för att uppnå både HTS och HCS 36-38. Tyvärr, företaget av kemiska genetiska skärmar med dessa innovativa robotföretag kräver vanligen stora resurser. Dessa typer av resurser är ett betydande hinder för många institutioner som saknar kapital för att förvärva , driva och underhålla ett sådant instrument. Samtidigt som inrättandet av infrastruktur för robot hantering av kemiska bibliotek, inklusive överföring av embryon för att ställa i ordning tallrikar, förblir kostnads oöverkomliga för många laboratorier, automatiserad bildbehandling och analys är i allmänhet mer tillgänglig 12. Automatiserad bild screening möjliggör kvantifiering av fluorescerande transgen rebärare och underlättar specifik fenotypisk analys 12,15.Även automatiserade system utgör användbara tekniska framsteg, kan många frågor lösas genom mer fokuserade manuella skärmar, till exempel frågan om flera tusen biologiskt aktiva föreningar i en utvecklingsprocess med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) avläsning 39. Vidare, medan allt fler laboratorier har åberopat zebrafisk kemiska skärmar för att undersöka en forskningsfråga, få (om någon) ansträngningar har nått mättnad och många ämnen har ännu inte brutit med hjälp av kemisk genetik. Kemiska skärmar kan utföras med hjälp av en liten zebrafisk koloni bestående av endast ett fåtal vildtyp eller transgena tankar. Därför bör denna form av genetisk förhör kunna uppnås av de flesta zebrafisk forskargrupper som är intresserade av att expandera / diversifiera in i denna arena. Kemiska bibliotek av varierande storlek kan tas tillvara från en kommersiell distributör och / eller collaborators. Av dessa skäl, kan kemisk genetik vara ekonomiskt genomförbart även i svåra finansieringsklimat. Men det finns hinder att börja en kemisk genetik skärmen, till exempel hur man planerar logistiska aspekterna av skärmen: t.ex. antalet personal som behövs för en lyckad skärm, Tilldelning av hängivna tid och sätter ihop en fysisk protokoll till manuellt processprover det nummer från hundratals till flera tusen. Här, vi detalj en manuell hög genomströmning protokoll för att utföra kemisk genetik i zebrafisk embryo med WISH som en utläsning. Denna metod innebär läkemedelsbehandling av zebrafiskembryon, följt av riboprob detektion av mRNA-transkript. Med hjälp av detta protokoll, en liten grupp eller en individ kan rimligen sålla och analysera en blygsam kemiskt bibliotek cirka 600 föreningar inom loppet av 9 veckor.
Protocol
Förfarandena för att arbeta med zebrafisk beskrivs här godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame. En guide till forskningsdesign för denna handbok liten molekyl skärmen i zebrafisk tillhandahålls (figur 1). En översikt av de metoder som beskrivs i detta protokoll är anordnat såsom ett flödesschema (figur 2). Se exemplet märkningssystemet (figur 3) för att planera behandlingsstegen embryo som beskrivs i delarna 4-10. För iscensättningen av embryon, se zebrafisk staging serie 40, och för beredning av WISH antisense riboprober används i delarna 9-10, se nyligen publicerade metoder 41.
1. Beredning av Zebrafish Parning Chambers
- Placera en vuxen man zebrafisk och en vuxen hona zebrafisk i en passande kammare, åtskilda av kammaravde O / N.
OBS: Mass parningar, en sådans de som använder grupper om 2-3 honor och 2-3 hanar kan generera fler embryon än enstaka parade parningar, och kan utföras med lämpligt dimensionerade parningskammare. - Upprepa steg 1.1, så att totalt 25 par av zebrafisk är set-up för varje platta med 96 brunnar av små molekyler som kommer att testas.
2. Insamling av Zebrafish embryon
- Nästa dag, ta bort avdelaren som separerar varje fisk paret och efter 1 timme, samla zebrafisk embryon med hjälp av ett finmaskigt filter och placera dem i en petriskål med E3 embryo medium (se materiallista för recept).
OBS: Samla embryon efter 1 tim ser till att embryon är vid liknande utvecklingsstadier. - Använd en plast överföringspipett att avlägsna skräp (t.ex. livsmedel och fast avfall). Sedan använder ett stereomikroskop att observera varje koppling av embryon och ta bort eventuella obefruktade ägg.
- Häll E3 embryo media och ersätta med färsk E3, sedan placera varje dish av embryon i ett 28,5 ° C inkubator. Efter 2 timmar observera varje koppling av embryon med hjälp av ett stereomikroskop och ta bort eventuella obefruktade ägg.
OBS: obefruktade ägg kan förgifta andra embryon, och ser ut att vara vid den enda cellstadiet eller ogenomskinlig. - Fortsätta att övervaka utvecklings utvecklingen av embryona med hjälp av ett stereomikroskop tills de når 40% epiboly. Observera sfär formen av embryot som ser ut att bestå av två separata skikt på 40% epiboly etapp 40.
3. Kemisk Späd Förberedelse
- Avlägsna kemiskt bibliotek plattan från lagring vid -80 ° C, täck den med aluminiumfolie och tina den på RT.
OBS: Olika bibliotek kommer att tina i olika takt beroende främst på lösningsmedel som används. Typiskt kommer ett kemiskt bibliotek frystes vid -80 ° C vara helt upptinad i cirka 3 h vid RT. Store upptining skylt (ar) på en säker plats med lämplig hazmat märkning. Använd enppropriate glasögon, en laboratorierock, och två uppsättningar av handskar vid hantering av kemikalier. - Använd en 8 kanals multikanalpipett för att lägga 99 ul av E3 i kolumnerna 2-12 i en 96-brunnsplatta.
OBS: Från vår erfarenhet, är en lämplig början drog intervall mellan 10 pM - 50 ^ M, och även som beskrivs i löpande protokoll 39. Här visar vi en 10 iM behandling om du använder en 1 mM kemisk biblioteket platta. - Använd en 8 kanals multikanalpipett att lägga en fil av varje förening till sin respektive brunn med E3.
- Använd en P10 att pipettera 1 l av DMSO (eller lämpligt lösningsmedel) i styrkolonn (här, kolumn 12).
- Täck den kemiska utspädningsplatta med aluminiumfolie, såsom aluminiumfolien skyddar eventuella ljuskänsliga föreningar i biblioteket, och returnera lager kemiskt bibliotek plattan till -80 ° C för lagring.
4. grupperande Zebrafish embryon
- Välj en petriskålinnehåller zebrafisk embryon vid 40% epiboly skede. Med hjälp av en pipett, försiktigt placera ca 10 embryon inuti varje brunn i en (1,1 ml) djup 96 brunnar. Fördela embryon i kolumnerna 2-12 i den djupa 96 brunnar.
OBS: Forskaren bör välja tidpunkt för drogberoende som är bäst anpassad till utvecklingsprocessen de vill förhöra. Användning av en plastöverförings pipett kan minimera embryo skador. Eftersom läkemedelsbehandling före 40% epiboly kan leda till ökad embryoletalitet, utveckla embryon för längre innan läkemedelsexponering, speciellt när senare utvecklingsprocesserna granskas. Placering mer än 15-20 embryon i varje brunn kan leda till försenad utveckling på grund av trängsel och bör undvikas. Det är viktigt att notera att den djupa 96-brunnsplatta innehållande embryona är annorlunda än den kemiska utspädning 96-brunnsplatta. - Använd en glas överföringspipett att avlägsna överskott E3 från varje brunn, och utvisa överskottet E3 inen behållare av flytande avfall.
OBS: Denna process tar normalt 30 minuter till 1 timme, beroende på forskarens hastighet, så embryona är mellan 50% och 60% epiboly av fullbordan, vilket är målet utvecklingsstadiet för tillsättning av den kemiska späd beskrivs här. Plåten kan lutas med en 45 ° vinkel för att orsaka de embryon som faller till botten av brunnen, så att kan pressas spetsen av pipetten mot botten av brunnen för att dra bort överskottet E3.
5. Tillsats av kemiska behandlingar
- Använd en 8 kanals multikanalpipett att överföra 100 ^ kemiska späd till sina respektive brunnar i den djupa 96 brunnar innehåller grupperade zebrafiskembryon.
OBS: Se till att det ursprungliga borrplats för föreningen matchar med bra läge i motsvarande djup 96 brunnar (t.ex., är B1 väl plats i den kemiska utspädningsplattan pipetteras i B1 väl plats i den djupa96 brunnar). - Våt en pappershandduk och placera den i en ljuskänslig behållare tillräckligt stor för att hålla en 96-brunnsplatta.
OBS: Den våta pappershandduk hjälper till att förhindra avdunstning av kemiska utspädning. - Använd sedan en tätningsmatta för att täta den djupa 96 brunnar, placera den i den ljuskänsliga behållare, och inkubera det vid 28,5 ° C.
OBS: Låt zebrafisk embryon utvecklas till nästa morgon. Alternativt låt embryona utvecklas tills lämplig utvecklingsstadiet för processen som analyseras.
6. Borttagning av kemikalier
- Använd en 8 kanals flerkanalspipett lägga 300 pl E3 till varje rad av läkemedelsbehandlade brunnar. Rita av och kassera E3 / kemiska utspädning från varje rad av brunnar. Tvätta embryona tre gånger med 300 | il av E3.
OBS: Släng läkemedelsavfall i en märkt behållare som används endast för detta ändamål. För att underlätta tvättar, använd en glas bassäng fylld med E3 tillräckligt brett för att använda multichannel pipett.
7. Pronase och Fixing Zebrafish embryon
- Överför zebrafisk embryon med hjälp av en plast överföringspipett i fyra 24-hålsplattor, ta sedan bort eventuella döda embryon. Märk plattor med 24 brunnar så att de motsvarar de ursprungliga läkemedels väl platser. Placera pipetten framför en mörk bakgrund efter varje brunn överföring att visualisera embryon i pipetten och förhindra crossover embryo väl.
- Använd en plast överföringspipett att dra av E3 så att embryona knappt nedsänkta i vätska.
- Använd en glaspipett att lägga till 2 droppar pronas lager (50 mg / ml) till varje brunn. Låt embryon inkubera i pronas för 5 minuter och därefter agitera brunnarna för att orsaka chorion att bryta isär. Alternativt pronas embryon innan de är vid önskad utvecklingsstadiet för analys.
- Använd en plast överföringspipett att tvätta embryona två gånger med E3.
- När embryona vid önskad skede av analysen, completely tappa upp och kasta de återstående E3.
- Använd en plast överföringspipett att tillsätta färsk 4% PFA / PBS i varje brunn. Inkubera embryon vid 4 ° CO / N att fixa. Använd färskt tinade PFA för att initialt fastställa embryon.
OBS: Fortsätt att göra din skärm analys av intresse. Detaljerad här i avsnitten 8-10 är ett förfarande för att bearbeta silplåtarna med WISH. Alternativa metoder kan ersättas enligt önskemål, sedan vidare till avsnitt 11 och utvärdera resultaten.
8. Embryo Permeabilization
- Använd en plast överföringspipett att dra-off den 4% PFA / PBS från embryona och tvätta embryona två gånger med 1x (fosfatbuffrad saltlösning med Tween) PBST. Överför embryon till 48 hålsplattor, sedan dra bort 1x PBST från embryon. Märk 48-hålsplattor för att matcha de ursprungliga samt placeringen av den djupa 96 brunnar.
- Tvätta genom att lägga till 100% metanol till brunnarna med en plast överföringspipett sedan dra bort det och lägg till 100% methanol igen för embryona.
- Placera embryona vid -20 ° C och inkubera under åtminstone 20 min. Alternativt hålla embryona i 100% metanol vid -20 ° C för långtidsförvaring.
- Ta bort 100% metanol och tvätta embryon med 50% MeOH / 1x PBST, sedan 30% MeOH / 1x PBST, och slutligen två gånger med 1x PBST.
OBS: Embryon äldre än 24 h efter befruktning (HPF) kan blekas vid denna punkt för att ta bort pigmente 39. - Addera 15 pl av tinade proteinas K lager (10 mg / ml) till 50 ml 1x PBST för att framställa en proteinas K (5 | ig / ml) arbetslösning.
- Ta ut 1x PBST från embryon och tillsätt proteinas K arbetslösning. Ta bort proteinas K efter 4 min.
OBS: Försöksledaren ska arbeta snabbt under detta steg för att förhindra embryo nedbrytning. Proteinas K koncentration och inkubationstid behöva varieras beroende på ålder av embryona som skall behandlas 41. De parametrar som beskrivs här avser embryonsom är 24 HPF. - Tvätta embryon med 1x PBST, tillsätt sedan iskall 4% PFA / PBS. Låt embryona inkubera i 4% PFA / PBS under 20 min vid RT.
9. Hybridisering och Probe Removal
- Med hjälp av en glas överföringspipett bort 4% PFA / PBS och tvätta embryona två gånger med 1x PBST. Ersätt 1x PBST med 500 | il av HYB + och inkubera embryona för 4 h vid 70 ° C.
NOTERA: För-hybridisering kan utföras för så få som 2 h, men 4 timmar är idealiskt. Dessutom kan olika hybridisering och tvättemperaturer vara perfekt för vissa sönder, såsom 65 ° C, men bör testas individuellt. - Generera digoxigenin-märkta riboprober motsvarande den gen (er) av intresse 41.
- Lägg 16 pg av riboprob till 16 ml HYB +. Pre-värma riboproben / HYB + lösning vid 70 ° C i minst 20 minuter innan du använder. Om du använder flera sonder, tillsätt 16 g av varje sond till samma HYB + volym (16 ml).
- Med hjälp av en glas överföringspipett, ta bort HYB + och använda en P1000 för att lägga på 200 ìl av riboprobe / HYB + blandning. Invertera riboprob / HYB + cocktail strax före användning och pipettera upp och ner en gång före tillsats av blandningen till varje brunn. Använd skydds pipettspetsar att lägga till riboprobe / HYB + lösning förhindrar detta blandningen ångan kommer in i pipetten.
- Inkubera embryona i riboprobe / HYB + cocktail vid 70 ° CO / N. Använda en adhesiv film för att täcka plattbrunnar för O / N sond inkubation och alla följande heta tvättar.
- Förbered 50% formamid / 2x SSCT, 2x SSCT och 0,2x SSCT och pre-varm vid 70 ° CO / N.
- Med hjälp av en P1000, ta bort riboprobe / HYB + och förvara blandningen vid -20 ° C. Eventuellt återanvända riboproben / HYB + blandning upp till tre gånger. Inför varje återanvändning, lägg i 3 pg av riboprob till den ursprungliga riboprobe / HYB + blandningen.
- Med användning av en glas överföringspipett, tvätta embryona två gånger med 50% formamid / 2x SSCT för 30 min vid 70 ° C. Tvätta embryona gång med 2x SSCT under 15 minuter vid 70 ° C. Tvätta embryona två gånger med 0,2x SSCT i 30 minuter vid 70 ° C. Avlägsna 0,2x SSCT och tvätta embryon med MABT två gånger på RT.
10. Anti-digoxigenin antikropp Inkubation och Detection
- Använda ett glas överföringspipett att avlägsna MABT från varje brunn. Med användning av en plast överföringspipett, tillsätt färskt blocket lösning till varje brunn. Låt embryona inkubera i block för 4 h vid RT. Lägg 8 | il av anti-digoxigenin-antikropp för att 40 ml av blockningslösning (5000-faldig utspädning).
- Med hjälp av en plast överföringspipett, byt blocklösningen med antikroppen / blocket lösning. Tillsätt tillräckligt med antikropp / blockningslösning för att fullständigt täcka de embryon.
- Täcka 48 brunnars platta med aluminiumfolie, så att inget ljus kan tränga igenom till embryona. IncUbate embryona O / N vid 4 ° C. Med hjälp av en glaspipett, ta bort antikropp / blocket lösning och tvätta embryona 10 gånger med MABT i 5-10 min vardera.
OBS: De MABT tvättar kan utföras kontinuerligt, eftersom det kommer att ta forskaren 5-10 min för att avlägsna MABT från varje platta och dispensera färsk MABT i brunnarna. - Generera två rör med 40 ml (80 ml totalt) av pre-färgning buffert. Lägg 180 | il NBT (50 mg / ml) och 140 pl BCIP (50 mg / ml) till en av de preparerade rör av pre-färgning buffert för att skapa färglösningen.
OBS: Denna färgningslösning kommer att generera en lila färgad substrat. - Ersätt MABT med pre-färgningsbuffert och låt embryona inkubera vid RT i 5 min.
- Byt före färgning buffert med färglösningen och låt stå i rumstemperatur. Övervaka den kolorimetriska reaktionen varje 15 min med användning av ett stereomikroskop.
OBS: färgreaktioner som kan ta från några minuter till flera timmar beroende på sonden. - Repsnöra färgningslösningen med 1x PBST efter färgningsreaktionen är fullständig och sedan tvätta embryona två gånger med 1 x PBST under 5 min.
- Ta ut 1x PBST och tillsätt 4% PFA / PBS att fixa embryona.
OBS: Du kan också göra en dubbel önskan att upptäcka riboprober märkta med en anti-fluorescein-antikropp. Om du utför en dubbel på plats, hoppa sätta 4% PFA / PBS (steg 10,9) efter 1x PBST tvätt (steg 10,8) och tvätta embryona två gånger under 15 minuter med 0,1 M glycerol, två gånger i 15 min med MABT tvättar, och sedan Inkubera embryon för 30 min i blocket. Lägg sedan på rätt antikropps O / N och utför steg från 10,3 till 10,9 med rätt färglösningen. För att detektera fluoroscein märkta riboprobe, förbereda en färgningslösning med BCIP och INT för att observera en röd substrat (se steg 10,1).
11. Poäng de kemiska Skärm Embryo Plattor
- Utför visuell poängsättning av resultaten med hjälp av ett stereomikroskop för att utvärdera embryot samples i fenotypen analysen.
- Med hjälp av en plast överföringspipett, överföra embryon från 48-hålsplattor till plattor med 12 brunnar för optimal visualisering. Märk plattor med 12 brunnar så att de motsvarar de väl platser från den ursprungliga djup 96 brunnar. När överföringen är klar, se under stereomikroskop.
OBSERVERA: Representativa embryon kan väljas från 12-brunnsplattor och avbildas på objektglas under ett täckglas 41.
Representative Results
Den manuella metod som beskrivs här tillåter samma forskare att effektivt och framgångsrikt genomföra en hög genomströmning små molekyler kemisk genetik skärmen med hjälp av zebrafisk embryot modellen (figur 1). Med hjälp av denna metod är det praktiskt för en enda person att utföra en kemisk genetik skärmen, så att under loppet av 9 veckor en person (förbundit sig att en 40 tim arbetsvecka) kan göra en undersökning av ~ 600 föreningar (figur 1) . Således kan bänken tiden för en person kringgå behovet av hög resurskrävande utrustning, såsom automatiserade system. Avvägningen är att en manuell skärm kräver flera veckor av dedikerad satsning. Däremot kan användningen av automatiserade system komprimera tiden inblandade i 1-2 veckor av robot tid, och kan innebära relativt minimal forskare ansträngning totalt. Ett sätt att öka effektiviteten och / eller omfattningen av en manuell skärm är att värva 2-3 forskare totalt, vilket skulle möjliggöra screening av mmalmföreningar, varierande förening koncentration och / eller screening under en kortare tidsperiod.
De primära stegen i protokollet att slutföra en kemisk genetik skärm i zebrafiskembryon med en önskan visning illustreras som ett flödesschema (figur 2). De experimentella uppgifter kan delas in i två typer av arbetsveckor: (1) kemisk exponering och embryo märkning, och (2) analys- och avbildnings. I kemisk exponering arbetsvecka omfattar dessa steg inrätta zebrafisk vuxna (dag 1), embryosamlings, arraying embryon och läkemedelsbehandling (dag 2), förbereder embryon för in situ hybridisering (Dag 3) och in situ hybridisering (Dag 4 -6). I analysen / bild vecka, analyserar forskaren mRNA-uttryck att göra mål embryon och bild hits (dag 7-11).
En viktig del i att utföra en kemisk genetik skärm är att konsekvent och korrekt märka väl platser. Som kemisk genetik skärmen process beskrivs här innebär överföring av uppsättningar av embryon från en brunn i en platta till en brunn i en annan platta flera gånger, är av största vikt att det behövs noggrann och tydlig märkning, så att när en kemisk träff görs det kan vara linjärt och enkelt spåras tillbaka till dess identitet inom den kemiska bibliotek (Figur 3). Ett enkelt sätt att säkerställa detta är att märka plattorna på ett sådant sätt att när som helst den väl läge för en uppsättning av embryon som behandlats med en förening som direkt motsvarar den kemiska bibliotek drogplatta väl läget för den förening som används för att behandla dessa embryon (figur 3). Här är ett dubbelt system för färgkodning och numeriska etiketter används för att organisera proven, som lades till skärmplåtarna med permanenta markörer (Figur 3).
Medan analys av resultaten av en hög genomströmning skärmen, finns det ett stort behov att utveckla en metod för att korrekt organisera, kommentera och analysera potentiella liten molekylhits. Därför måste en kemisk genetik skärmen har en grundlig och tydlig betygssystem som är omsorgsfullt utformad och strikt. Ett sådant system skulle enkelt och helt förmedla viktiga dynamiken i en förening och ger ett koncist sätt att presentera resultaten av den färdiga skärmen. Ett sätt att konstruera ett sådant system är att gradera embryon som använder ett klassystem, vilket skulle förklara övergripande morfologiska svårighetsgrad och förtroende av en träff. Vidare kan de kategorier klass kopplas med en (+) eller (-) för att beskriva antingen en expansiv eller reducerande effekt på regionen (er) av intresse. Här var zebrafiskembryon kastades individuella föreningar från ett bioaktivt bibliotek (Enzo Chemicals) från 50% epiboly till 24 HPF, och analyserades sedan genom WISH med användning av en cocktail av tre riboprober att detektera Nephron segment (Figur 4A). Som ett exempel betygssystemet, en brunn som innehåller en grupp av embryon som hade en dramatiskt förstorad proximal convoluted tubuli (PCT) av pronephros, zebrafisk embryonala njuren, skulle orsaka den förening som används för att behandla det väl kategoriseras som (klass I), vilket i detta fall skulle representera klassen i samband med den allvarligaste defekten och den högsta nivån av förtroende för fenotypen observerades (Figur 4B). Föreningen skulle då förses med (PCT) och en (+), den fullständiga beteckningssätt är (klass I - PCT +) (Figur 4B). Detta koncept av klassificeringen erbjuder ett enkelt och snabbt sätt för att beskriva ett gruva av information beträffande en liten molekyl av intresse, inklusive svårighetsgraden av föreningarna effekt på organismen, den region som påverkas av läkemedlet och det sätt på vilket regionen är påverkas (Figur 4B).
Figur 1. & #160;. Manuell zebrafisk embryo kemisk skärmen strategi En forskare det är möjligt att testa en 96 brunnar av kemikalier på zebrafiskembryon och utföra efterföljande WISH bearbetning under en och samma vecka. Utföra två veckors kemiska tester (Vecka 1 (dag 1-6) och Vecka 2 (Dag 7-12)) kan paras ihop med en tredje vecka tillägnad provanalys. Ungefär två 96-hålsplattor till ett värde av skärmprover kan görs och avbildas Vecka 3 (dag 13-17). Detta scenario uppgår till screening av cirka 200 föreningar i en 3 veckors period, vilket motsvarar ett litet bibliotek med cirka 600 föreningar helt avskärmade från 9 veckor. Denna handbok strategi kan ändras beroende på vilka resurser som finns tillgängliga. Exempelvis kan tre forskare minska tiden för att slutföra en skärm på cirka 600 föreningar till 3 veckor jämfört med 9 veckor det skulle ta med en forskare. Screening strategier kan anpassas genom att tilldela forskare till specifika aspekter av skärmen, såsom narkotika behandlaning och in situ hybridisering eller styra forskare att självständigt utföra hela screeningprocessen på separata delar av kemiskt bibliotek.
Figur 2. Flödesschema:. Uppdelning av 6 dagars skärm arbetsflöde Den kemiska screening process kan diskret delas upp i 6 dagar. Dag 1 består av att inrätta zebrafisk parning par (= /> 25) för att leverera embryon för varje platta med 96 brunnar som ska screenas. Dag 2 skall hämtas embryon från parningskammare och grupperings dem i en djup 96 brunnar, följt av läkemedelsbehandling. Dag 3, embryon är förberedda för WISH, inklusive dechorionation, vävnadsfixering och embryo uttorkning. Slutligen är WISH på embryona genom Dag 4-6. Observera att alternativa färgningsprocedurer på fasta prover kan vara lätt substituted för WISH.
Figur 3. Platta överföringsmärkning schema. Zebrafish embryon är grupperade och narkotika behandlas i en platta med 96 brunnar flyttade sedan till en 24 brunnar för skräp borttagning och pronas exponering. Embryona flyttas sedan till 48-hålsplattor för beredning embryo, WISH och vävnadsfixering. Därefter embryon överförs till plattor med 12 brunnar för att göra poäng, bildbehandling och lagring. Exakt grupperings av embryon åstadkoms genom användning av ett färgkodningssystem som gör det möjligt för forskaren att hålla reda på den kemiska ursprung för varje prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Exempel betygssystem. Njure segmenteanalys En WISH experiment kan forskaren att färga specifika celltyper som bygger på identiteten av sonderna som är markerade, vilket gör att bedömningen av förändringar i embryo fenotyper efter förändringar i mRNA transkription läge och / eller nivåer. Som ett exempel, tre segment av den zebrafisk embryonal njure, de pronephros, märktes med användning av Screen Mix 1. Display Mix 1 är en cocktail av prober bestående av wt1b, som specifikt lokaliserar i podocyter (P), slc20a1a som markerar proximal convoluted tubuli (PCT), och slc12a1 vilka etiketter distala tidigt (DE) segmentet 47. A (+) symbolen bredvid en region etikett används för att göra anteckningar i expansion eller positiv förändring i den regionen, medan ett (-) symbol används för att diktera försvagning i en region. Här embryos läkemedelsbehandlade med 13-cis RA har en förstorad proximal tubuli och en total förlust av det distala tidiga segmentet med någon uppenbar effekt på podocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kemisk genetik i zebrafisk kan göra en avgörande inverkan på utvecklingen av nya läkemedel. Detta protokoll ger en manuell hög genomströmning metod för att utföra kemisk genetik i zebrafiskembryon med WISH avläsning, effektivt att en enskild person eller en liten grupp att genomföra en liten molekyl skärmen. Denna minimala-resurs-metoden utökar möjligheten att kemisk genetik till många forskargrupper. Specifikt ger den här skärmen strategi ett viktigt alternativ till användningen av robot instrumentering, eftersom sådana system inte är brett tillgänglig över forskningsavdelningar. Denna handbok skärmen gör att en enskild individ att testa en 96 brunnar av föreningar med en WISH avläsning i en 6 dagars arbetsvecka. Sedan zebrafisk är oviparous, med embryona utvecklas utanför förälder, och embryona är stora nog att se med blotta ögat (mellan 1-3 mm), är de lämpade för manuell hantering med enkla instrument och forskaren kan array prover iflerbrunnsplattor utan användning av ett mikroskop. Vidare, eftersom zebrafisk utvecklas snabbt, kan små molekyler exponering vara effektivt med en enda behandling av en förening, i stället för upprepade doser, vilket minimerar ytterligare manuell hantering. Zebrafisk embryon är lätt odlas eftersom deras äggula ger en näringskälla upp till 5-6 dagar efter befruktningen, vilket eliminerar komplikation av yngel utfodring. Dessutom har de flesta av de larv organ utvecklas och bli funktionell under denna period, vilket ger möjlighet att studera ett brett spektrum av forskningsfrågor. Den enkla tillsatsen av små molekyler till embryot inkubationsmediet är icke-invasiv och tillåter forskaren (er) för att selektera för läkemedelsdosen, tid för tillsats, och varaktigheten av exponeringen-vilket ger god kontroll över många variabler och ge utrymme för specifika utvecklingsprocesser intressant som ska kontaktas. Som beskrivs här, kan betydande forskningsproduktivitet uppnås på kort timeframe att använda denna manual skärmen metodik. Enligt vår erfarenhet finns det en hög avkastning på det investerade ansträngning, vilket kan accentueras genom att använda en känd bioaktiva kemiskt bibliotek för att analysera en process av intresse, såsom nephron segmente under njur utveckling (Figur 4; Poureetezadi och Wingert, opublicerad).
Den manuella kemiska skärm som beskrivs här är exceptionellt mångsidig eftersom den inbegriper en analys på fasta zebrafisk prover. Till exempel kan denna strategi ses över för att testa flera plattor av föreningar i en vecka och sedan göra mål embryon följande vecka. Alternativa analyser på fasta zebrafisk prover, såsom immunohistokemi eller annan vävnad färgningsberedningar, kan också användas i stället för WISH utläsning. Experimentella strategier för att utföra cellulära analyser i zebrafisk kan anpassas på grund av optisk klarhet och insyn i tidiga utvecklingsstadier. Vidare kan forskare hämma pigmente vid senare staGES använda kemikalier eller undvika komplikation av pigment utveckling helt och hållet genom användning av pigment mindre genetiska rader som Casper eller ren zebrafisk 13. Det är möjligt att manuellt administrera små molekyler, bearbeta fläcken (er) av intresse, och för att manuellt göra mål embryon med hjälp av ett enkelt stereomikroskop. Emellertid är det viktigt att hålla i minnet att automatiserad bildanalys skulle kunna utföras, och kan i själva verket krävs för högupplöst fenotyp-analys. Exempelvis kan det vara föredraget att partnern ett automatiserat system för bildanalys med en direkt analys, såsom en transgen reporter, eftersom detta förenklar den manuella behandlingen av prover, kvantifierar skillnaderna inte lätt urskiljbara för blotta ögat, och eliminerar forskaren förspänna 15. Lyckligtvis vissa automatiserade bildsystem är både användarvänlig och ekonomiskt i termer av programvarukostnader 15. Användningen och kapacitet andra automatiserade system har snabbt utvecklats och kananvändas för inriktning av organismer, administrera läkemedelsbehandlingar, och till och med att flytta organismer 12,15. Dessa automatiserade system har inlett en ny teknologisk ålder forskning och har levererat innovativa lösningar för att manipulera stora mängder försökspersoner och på så sätt utföra HTS och HCS metoder i hela organismer 12,15. Även om sådana maskiner är onekligen användbara verktyg, de är också mycket kostsamma och är utom räckhåll för många grundläggande forskningslaboratorier. Utan tillgång till dessa automatiserade funktionerna kan det tyckas att kemiska skärmar är inte möjliga. Men detta protokoll beskriver en guide för hur man genomför en manuell skärm som kan användas för att fylla i en kemisk genetik skärmen på ett praktiskt sätt under en rimlig tidsperiod.
Nackdelar för både manuella screening och kemisk genetik i allmänhet finns, och bör hållas i åtanke när man överväger en kemisk skärmen. I synnerhet, metoden demonstreras här nödvändiggör en måttlig gradav fysisk skicklighet. Denna oro är minskad eller helt undviks genom repetition, eftersom fingerfärdighet kommer att förbättras med träning. Dessutom finns minimalt utrymme för grova fel, som det finns endast 10 embryon per brunn för analys. Små molekyler kan variera i penetrans av fenotypen som induceras, så en rimlig poäng regim för att identifiera föreningar av intresse måste följas. Det är viktigt att forskarna använder detta protokoll utforma lämpliga stränga kriterier för vad de kommer att överväga en träff. Det är också viktigt att komma ihåg att denna typ av form av skärmen troligen kommer att ge en viss del av falskt positiva, vilket kan avgränsade genom ytterligare kemisk upparbetning. Vidare är det viktigt att scenen embryon exakt och för att samla in kopplingar för screening strax efter befruktningen, som asynkron utveckling kan leda till komplikationer i noggrant utvärderar effekten av läkemedelsbehandlingar. Vidare, när det gäller kemisk screening som ett experimental strategi, det finns en mängd begränsningar. Föreningens löslighet och toxicitet av bärarmolekyler (t.ex., dimetylsulfoxid (DMSO)) kan också utgöras av ett problem och kan vara oöverkomlig i att testa många molekyler. Chorion kan också fungera som barriär mot läkemedelsexponering. Slutligen, även om zebrafisk är en kraftfull och translationell modell för kemisk genetik, man bör alltid tas vid bedömningen av om ett alternativt kemiskt skärmen strategi, t ex med hjälp av ett in vitro-system, såsom en cellinje, kan ersätta användningen av hela djur. Ändå är kemisk behandling i hela zebrafisk systemet anses bättre att genomföra liknande tillvägagångssätt i däggdjur, eftersom det ger fördelen att samla systemiska effekter av föreningarna och kan göra det möjligt för forskare att triage listan över föreningar som skall testas i en däggdjursmodell.
Hittills har zebrafisk kemiska skärmar ett kraftfullt experimentella verktyg to beskriva mekanismerna för utveckling och för att fastställa kandidat farmakologiska medel för användning inom medicinen, såsom identifiering av molekyler som kan förhindra sjukdoms patologier. Till exempel, en studie av Burns och kollegor utvecklat en automatiserad mikro bra test för hjärtfrekvensen med hjälp av transgena zebrafisk embryon som uttryckte GFP i myokardiet 42. De använde denna transgen linje att analysera pulsen i utvecklingen och hur den påverkades vid läkemedelsbehandling 42. En annan studie, genom att testa befolkningstäthet av hematopoetiska stamceller i zebrafisk embryot, identifierat att prostaglandin E2 reglerar HSC nisch 23. Detta fynd validerades i musen, och sedan implementerades för klinisk testning i humana navelsträngs transplantationer 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Genom flera nya studier har kemisk genetik visat sig vara användbar för att studera njursjukdom hjälp av zebrafisk
Medan kemisk genetik forskning bär betydande meriter, är det inte utan vissa problem. Enbart med hjälp av en kemisk genetik tillvägagångssätt kan göra det komplicerat att avgöra den specifika genen eller generna som påverkas av en förening. Även om ett mål (en) hittas, en significant gap kan kvarstå mellan förening identifiering och förstå mekanismen (s) handlings där lilla molekylen fungerar. Till exempel kan det vara svårt att bestämma den mekanism i vilken en liten molekyl agerar därför att en enda förening kan ha en rad olika effekter inom en organism. Men med tillkomsten av ny teknik och fler kemiska genetiska skärmar slutförs i zebrafisk, är problemet att om en mekanism krymper. En metod för att fastställa de molekylära effekterna av identifierade föreningar är att välja en läkemedels bibliotek av kända bioaktiva substanser för screening, där mekanismer kan eventuellt härledas från tidigare kommenterade uppgifterna. Dessutom chemoinformatic algoritmer, som Discovery gate, finns tillgängliga för användning som kan jämföra strukturella likheter mellan en förening mot en databas av föreningar med skrivs mekanismer 14. Ytterligare ett annat sätt att belysa mekanismen av en förening skulle vara att generera en MICRoarray profil efter behandling och sedan fråga den här profil på en sammanställning av microarray läkemedelsprofiler, såsom Connectivity Map, söker mekanistiskt definierade föreningar som framkallar en liknande effekt 14. Kan också användas för detta tillvägagångssätt för att identifiera genetiska mutanter som har en liknande effekt som föreningen av intresse. Att hitta en koppling mellan en förening och en mutant kan tyda på att föreningen fungerar molekylärt uppströms eller nedströms tillhörande genen, som kan avgränsas genom behandling av mutanter med föreningen och morpholinos. Ett annat alternativ skulle vara masspektrometri, som fortsätter att bli mer optimerad för zebrafisk. Denna metod kan användas för att beskriva specifika proteinförändringar eller posttranslationella modifieringar efter läkemedelsbehandling. Slutligen, små molekyler eller till och med hela bibliotek är ibland kunna taggade för pull-down av bindningspartners. Det är också värt att notera, att medan mekanismen för hur en liten molekyl fungerar is av betydande import, finns det FDA-godkända läkemedel för vilka mekanismerna är fortfarande okända.
Även om zebrafisk uppvisar många likheter med däggdjur, både genetiskt och fysiologiskt, finns det fortfarande en fråga om crossover drog 14. En studie undersökte crossover förmåga träffarna från en skärm för cellcykelinhibitorer i zebrafisk embryon 50. Skärmen resulterade i identifieringen av 14 träffar som tidigare var okända för att ha cellcykelaktivitet. Av dessa 14 föreningar har 6 visat sig ha cellcykelaktivitet i både mänskliga och zebrafisk cellodlingsanalyser, 3 visade sig vara serum inaktiv i cellodlingsanalyser, 1 var aktiv endast i zebrafisk celler och 4 hade någon aktivitet i antingen zebrafisk eller humana cellkulturanalyser, men bara i zebrafisk hela organismen. Noterbart är de 4 föreningar som endast haft verksamhet i zebrafisk visar att det finns skillnader mellan zebrafisk och däggdjur som kan prohibet translationell potential vissa föreningar. Detta är en viktig faktor att vara uppmärksam på, men det finns exempel på små molekyler, såsom PGE2 som förstärker förmågan hos HSCs att inympa i mänskliga mottagare och PTBA-derivat som förbättrar graden av njur återhämtning i däggdjur, vilket ger bevis av principen att crossover är möjlig 23,31-33.
Oavsett dessa fallgropar, kemisk genetik och denna minimala resurs tillvägagångssätt har mycket att erbjuda forskarsamhället. Kemisk genetik är särskilt användbar i zebrafisk och kommer att fortsätta att spela en avgörande roll för molekylär väg förhör och läkemedelsutveckling. Kemiska skärmar baserade på diskreta molekylära mål har historiskt varit föremål för en hög felfrekvens på grund av det som kallas konstellationen av adsorption, distribution, metabolism, utsöndring och toxikologiska (ADMET) egenskaper 51. Kemiska skärmar som utnyttjar zebrafisk tillinrikta sig på en process, snarare än en diskret mål, kan kringgå flera ADMET problem och identifiera föreningar som är effektiva i samband med hela organismen. Med den ökande pool av tillgängliga resurser för zebrafisk forskning, inklusive aktuella muterade stammar och förmågan att använda genomet redigering för att skapa riktade genetiska mutanter och transgena, det finns nästan ett obegränsat antal potentiella kemiska genetiska skärmar använder zebrafisk. Många kemiska bibliotek har kurator, och spänn samlingar med kända bioaktiva substanser, nya föreningar, strukturellt olika och strukturellt liknande. Dessa reagens ger en mängd spännande möjligheter för skärmkombinationer som finns idag och som sannolikt kommer att ytterligare öka under de kommande åren. Med dessa möjligheter i handen, ger denna handbok och hög genomströmning protokoll ett praktiskt och användarvänligt sätt att öka möjligheterna för forskargrupper att göra kemikalie genetiska skärmar använder zebrafisk.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering till Wingert forskningslaboratoriet från följande: National Institutes of Health bidrag K01 DK083512, DP2 OD008470 och R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Startat Scholar beviljande av bidrag # 5-FY12-75; starta medel från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences; och en generös gåva till University of Notre Dame från Elizabeth och Michael Gallagher på uppdrag av Gallagher familj att främja stamcellsforskning. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar Paul T. Kroeger, Jr för att ge kritisk feedback på manuskriptet. Vi tackar personalen vid Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning vid Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg av våra zebrafisk koloni. Slutligen, vi tackar medlemmarna i vår research labb för sina kommentarer, diskussioner och insikter om detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 10 μl natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1x E3 | Generate using 50x E3 and DI water. | ||
| 1x PBST | Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS. | ||
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1x PBS | Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 °C. | ||
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50x E3 | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water. | ||
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 °C. |
| block solution | Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) | ||
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 μl | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 μm CA / 1 L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 μl/μl heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2 L and autoclave. | ||
| MABT | Generate 0.1% Tween-20 in MAB | ||
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 - 10 μl | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) | ||
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | Generate using 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. | ||
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
References
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish—emergence of a new model vertebrate. Nat. Rev. Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Dahm, R., Geisler, R. Learning from small fry: the zebrafish as a genetic model organism for aquaculture fish species. Mar. Biotechnol. (NY). 8 (4), 329-345 (2006).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view). Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Hsu, C. H., Wen, Z. H., Lin, C. S., Chakraborty, C. The zebrafish model: use in studying cellular mechanisms for a spectrum of clinical disease entities. Curr. Neurovasc. Res. 4 (2), 111-120 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. , (2012).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J. Clin. Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Henken, D. B., Rasooly, R. S., Javois, L., Hewitt, A. T. The National Institutes of Health and the growth of the zebrafish as an experimental model organism. Zebrafish. 1 (2), 105-110 (2004).
- Sprague, J., et al. The Zebrafish Information Network: the zebrafish model organism database provides expanded support for genotypes and phenotypes. Nucleic Acids Res. 36, (2008).
- Bradford, Y., et al. ZFIN: enhancements and updates to the Zebrafish Model Organism Database. Nucleic Acids Res. 39, (2011).
- Howe, D. G., et al. ZFIN, the Zebrafish Model Organism Database: increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93 (3), 268-280 (2011).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163 (2), 65-78 (2014).
- Peal, D. S., Peterson, R. T., Milan, D.
- Tsang, M. Zebrafish: a tool for chemical screens. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (3), 185-192 (2010).
- Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31 (2), 171-179 (2009).
- Peterson, R. T., Fishman, M. C.
- Tan, J. L., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods Cell Biol. 105, 493-516 (2011).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med. Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (3), 459-468 (2012).
- Peterson, R. T., et al. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Peterson, R. T., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat. Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
- Kalev-Zylinska, M. L., et al. Runx1 is required for zebrafish blood and vessel development and expression of a human RUNX1-CBF2T1 transgene advances a model for studies of leukemogenesis. Development. 129 (8), 2015-2030 (2002).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
- Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (6), 943-953 (2013).
- Oppendal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- White, R. M., et al. DHODH modulates transcriptional elongation in the neural crest and melanoma. Nature. 471 (7339), 518-522 (2011).
- Lord, A. M., North, T. E., Zon, L. I. Prostaglandin E2: Making more of your marrow. Cell Cycle. 6 (24), 3054-3057 (2007).
- Goessling, W., North, T. E. Hematopoietic stem cell development: Using the zebrafish to identify the signaling networks and physical forces regulating hematopoiesis. Methods Cell Biol. 105, 117-136 (2011).
- Cutler, C., et al. Prostaglandin-modulated umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 122 (17), 3074-3081 (2013).
- Cao, Y., et al. Chemical modifier screen identifies HDAC inhibitors as suppressors of PKD models. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (51), 21819-21824 (2009).
- Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 794-802 (2010).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238 (3), 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), (2010).
- Tran, T. C., et al. Automated, quantitative screening assay for antiangiogenic compounds using transgenic zebrafish. Cancer Res. 67 (23), 11386-11392 (2007).
- Jing, L., Durand, E. M., Ezzio, C., Pagliuca, S. M., Zon, L. I. In situ hybridization assay-based small molecule screening in zebrafish. Curr. Protoc. Chem. Biol. 4, 2 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. B.
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of fixed zebrafish embryo specimens. J. Vis. Exp. , (2014).
- Burns, C. G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat. Chem. Biol. 1 (5), 263-264 (2005).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and Acute Kidney Disease: Translational Research Insights from Zebrafish Chemical Genetics. General Med. 1, 112 (2013).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: Insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospect., & challenges. Clin. Transl. Med. 2 (1), 11 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem. J. 444 (2), 153-168 (2012).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev. Dyn. 240 (8), 2011-2027 (2011).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and notch signaling. Dev. Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
- Murphey, R. D., Stern, H. M., Straub, C. T., Zon, L. I. A chemical genetic screen for cell cycle inhibitors in zebrafish embryos. Chem. Biol. Drug Des. 68 (4), 213-219 (2006).
- Williams, C. H., Hong, C. C. Multi-step usage of in vivo models during rational drug design and discovery. Int. J. Mol. Sci. 12 (4), 2262-2274 (2011).
