Summary
제브라 피쉬는 척추 동물의 발생 과정과 모델 인간의 질병을 연구 할 수있는 좋은 실험 유기체이다. 여기, 우리가 함께 제브라 피쉬 배아에서 수동 높은 처리량 화학 화면을 수행하는 방법에 대한 프로토콜 설명 판독을 현장 하이브리드 (WISH)에서 전체를 장착.
Abstract
제브라 피쉬 인해 인간과 유전자 보존의 자신의 상당한 정도에 널리 사용되는 모델 생물 발달 생물학의 기초 메커니즘을 조사하고 인간의 질병 병리학을 공부하게되었다. 화학 유전학은 생물학적 프로세스에 작은 분자 가지고 있다는 효과를 테스트하는 것을 수반하고 치료 화합물을 식별하기위한 인기있는 중개 연구 방법이되고있다. 제브라 피쉬는 특히 때문에 외부에서 수정 된 아르 투명 배아의 큰 클러치를 생산하는 능력의 화학 유전학에 사용할 호소하고 있습니다. 또한, 제브라 피쉬 배아 쉽게 배아 매체 화합물의 단순한 첨가에 의해 치료 약물이 될 수있다. 사용 현장 하이브리드 (WISH)에서 전체 마운트, mRNA의 발현은 명확하게 제브라 피쉬 배아에서 시각화 할 수 있습니다. 함께 화학 유전학과 WISH를 사용하여, 제브라 피쉬는 세포 및 생리를 확인하려면 강력한 전체 유기체 컨텍스트가된다작은 분자의 효과. 혁신적인 진보 그러나 이러한 옵션에 액세스 할 수없는 또는 엄청난 비용을 유지 많은 실험실을 위해, 기계 기반의 심사 절차를 활용 기술 이루어지고있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 기본 자원을 필요로하며 시간 효율적인 기간에서 한 개인 또는 소규모 팀에 의해 달성 될 수있는 수동 높은 처리량 화학 유전 화면을 실행하는 방법을 설명한다. 따라서,이 프로토콜은 발생 과정, 질병 메커니즘에 기초 통찰력을 얻는 데 유용 할 수 있고, 의학적으로 관련된 애플리케이션을 신규 한 화합물 및 신호 경로를 식별하기 위해 제브라 피쉬 화학 유전학을 수행하는 연구 그룹에 의해 구현 될 수있는 가능한 전략을 제공한다 .
Introduction
인간의 질병을 치료하는 효과적인 치료 약물의 식별은 많은 생물 의학 연구의 최종 목표입니다. 임상 적용 가능성 약리 제제의 확인 및 특성화를위한 의료 명백한 값을 갖는 동안, 중요한 문제로 남아있다. 결국, 많은 치료 화합물의 개발은 특정 세포 유형이 개발하거나 함수 어느 방법에 대한 지식으로부터 온다. 제브라 피쉬, 다니오 레 리오 (rerio)는, 발생 생물학 1의 주류 모델 생물이 된 잉어과 가족의 담수 경골입니다. Zebrafish의 유전자 과학 연구 2,3를위한 유지하고 조작하기 쉽고 다루기 쉬운 척추 동물이다. 지브라 피쉬 배아 외부 수정 된, 투명, 오직 주 2,3- 단일 성인 짝짓기로부터 수백으로 제조 할 수있다. 또한, 피쉬 주 주요 기관계 및 큰 D를 보유인간을 포함한 포유 동물 4와 유전 적 유사성의 egree. 놀랍게도, 인간 유전자의 70 %는 제브라 피쉬 orthologue 4 있습니다. 이 때문에 유사성, 제브라 피쉬는 척추 동물의 개발 및 생리학의 메커니즘을 연구 관련성이 높은 실험 시스템되었으며, 인간의 질병 5-7 다수의 요점을 되풀이하는 데 사용되어왔다. 이러한 이유는, 다른 사람의 사이에서, 유전 심문을 계속하는 제브라 피쉬의 이상적인 후보를 만든 및 생물 의학 연구 6,7에서 제브라 피쉬의 유틸리티 꾸준히 증가하고 감사 가져왔다.
지난 몇 년 동안, 유전 툴 풍부 지브라 피쉬 개발되어왔다. 제브라 피쉬의 게놈 돌연변이 유발 및 transgenesis 3 의무입니다. 지금까지, 앞으로의 과다 및 유전 연구를 역방향 9,000 돌연변이 3 세대로 이어지는 수행되었다. 또한, 다수의 유전자 변형 라인이 될 수있다EN 특정 세포 유형 3의 표시 및 격리를 활성화하는 만들었습니다. Zebrafish의 국제 자원 센터 (ZIRC) (8)를 통해 오히려 저렴한 비용으로 실험실에 액세스 할 수있는 연구 커뮤니티에 이러한 자원을 중앙 집중화하고 배포 할 수있는 중요한 지속적인 노력이 계속있다. 또한, 생물 정보 시퀀스 및 프로토콜을 모르 폴리 노하는 유전자 발현 패턴에 이르기까지 분자 도구의 광범위한 저장소, 점진적으로 Zebrafish의 정보 네트워크 (ZFIN) 9-11에 주석하고있다. 이 제브라 피쉬의 연구 인프라는 상당한 NIH 지원이 동물 모델 (8)의지지를 통해 가능하게되었다. 제브라 피쉬의 돌연변이, 유전자 변형 라인 및 관련 정보의이 캐시는 대형의 생물학 연구 커뮤니티에 뛰어난 가치가 계속됩니다. 제브라 피쉬는 이제 잘 설립과 탁월한 모델 생물 동안 그러나, 그들은 라를 나타냅니다rgely 미개발 저수지 화학 유전 스크린의 사용을 통해 발생 생물학 및 질병을 연구합니다.
화학 유전학 살아있는 시스템 (12) 내에서 생물학적 과정에 영향을 미치는 이러한 약물 또는 다른 화합물과 같은 소분자의 사용이다. 화학 유전학 에이전트에게 그 구조를 식별하거나 특정 유전 적 결함 (12)을 악화하는 등 유전자 기능의 분자 메커니즘을 이해하기 위해 구현 될 수있다. 또한, 화학 유전학은 중개 연구 (12)을 수행하는 하나의 주요 수단을 나타냅니다. 동물 모델에서 기존 앞으로 유전 스크린 질병에 특정 유전자를 연결에 대단히 강력한되었지만, 그들은 그것이 어렵거나 때로는 불가능 초기 배 발생 후 발생할 것 표현형을 관찰하고, 시간적 차원이 부족하다. 또한, 유전자 중복 해석 앞으로 유전학에서 관찰 된 결과를 어렵게 만들 수 있습니다. 또한, 화학 유전자 화면미세 시간적 제어를 허용 함과 동시에 약물 발견 (12, 13)에 대한 유용한 출발점을 제공한다.
화학 유전학은 전체 유기체로서 (예를 들면, 세포주, 단백질) 시험 관내 시스템에서 사용하거나 생체 시스템을 사용하여 수행 될 수있다. 화학 유전학에 대한 체외 시스템을 사용하면 적은 비용이 많이 드는 큰 규모에보다 쉽게 작업, 전체 유기체 시스템보다 간단하기 때문에 도움이 될, 수 시간이 덜 집중. 결과적으로, 시험 관내 시스템은 고 처리량 스크리닝 (HTS) 및 고 함량 스크리닝 (HCS) 모두 허용한다. 또한 화학 유전학 접근 할 때 고려되어야 시험 관내 시스템을 사용하는 장점의 수이지만 중요한 한계가있다. 세포주를 사용하여 하나의 주요 제한은 작은 분자는 특정 세포주에서 효능 무독성 아직 전체 유기체 내로 도입 될 때 독성이 될 수 있다는 것이다. 따라서, 핵심문제의 체외에서 시스템은 유기체의 광범위한 컨텍스트를 캡처하지 때문에 항상 정확하게 전체 유기체에서 일어나는 모방 할 수없는 점이다. 전체 유기체 시험 화합물은 이러한 문제를 회피 할 수 있지만, 포유류 전체 유기체 모델의 사용은 윤리적 물리적 제한들을 포즈. 예를 들어, 마우스에서의 약물 스크리닝은 논리적으로 적절한 샘플 크기를 테스트하는데 필요한 공간과 비용에 의해 방해된다. 또한, 발달 문제 때문에 포유류 자궁 발전한다는 사실 공부하기 어려울 수있다. 생물 의학 연구의 행위가 엄청난 사회적 가치를 가지고있는 동안 마지막으로, 그럼에도 불구하고 강렬한 연구를 제한하고 고통을 완화하고 연구에 사용되는 동물의 고통으로 동물 복지를 보호하기 위해 상당한 필요가있다. Zebrafish의 포유 동물과 같은 높은 척추 동물 작업에 가능한 대체를 제공하고, 더 많은 주제에 화학 유전학을 이용하여 공부하실 수 있습니다배아와 애벌레 단계 신경 학적 처리는 낮은 레벨 12, 13에 없거나 작동됩니다.
화합물 배달 관심 12-15의 약물을 함유하는 배지에서 배아를 침지하여 수행 할 수 있으므로 현재까지 화학 유전 스크린 무수히 특히 제브라 피쉬 배아를 사용하여 수행되었다. 또한, 화학 유전 스크린이 가능하고 16 ~ 20 관리 할 수 있도록 다수의 과학 기술 발전이 있었다. 피터슨과 그의 동료들은 2000 년에 화학 유전자 화면에 제브라 피쉬를 사용하는 첫번째이었다, 이후 2004 년은 제브라 피쉬 (21, 22)에서 대동맥 축착 돌연변이를 억제하는 화합물을 확인했다. 화학 화면은 이후 여러 개발 조직 (예를 들어, 심장, 혈액, 혈관) 23-25, 생리 기능 (예를 들어, 행동 신경 학적 기준) (26), 성인 재생 27, 28, 및 diseas을 연구하기 위해 구현 된 전자 모형 (예를 들어, 근이영양증, 암) (29, 30). 이러한 제브라 피쉬 화학 스크린 사이에서 프로스타글란딘이 조혈 줄기 세포를 조절하는 발견 "침대 옆에 탱크"이동할 수있는 능력을 보여주는, 인간의 임상 시험에 촬영되었습니다 23,31-33 (NIH 임상 Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). 이러한 임상 시험으로 이동 아직 있지만 최근 유망 후보 치료제는, 다낭성 신장 질환 (PKD) (34)과 급성 신장 손상 27,35에서 세포 병리를 재조정 신장과 같은 복잡한 장기를 위해 등장했다. 이러한 화학 유전 화면은 크게 현상 지브라 피쉬 성인 조직 기능을 심문 화학 유전학을 적용하는 능력을 테스트 작은 화합물의 유용성을 입증한다. 또한, 학술 연구 (19)에 사용할 수있는 상용 약리학 컬렉션의 성장 목록이 있습니다.
지난 몇 년 동안 ove_content는 ">, 자동화 이미지 시스템 36-38와 함께 약물 분배 및 핸들링 로봇 자동화 된 시스템의 사용을 포함하는 화학 유전자 스크리닝 기술의 현저한 진보가 있었다. 이와 같은 시스템의 가능성을 허용 화합물의 수천을 테스트하는 것은 모두 HTS 및 HCS 36-38을 달성했다. 불행하게도, 이러한 혁신적인 로봇 기업과 화학 유전자 화면의 사업은 일반적으로 상당한 자원을 필요로한다. 이러한 유형의 자원은 취득 자본이 부족한 많은 기관의 중요한 걸림돌 판을 배열하는 배아의 전송을 포함한 화학 물질 라이브러리의 로봇 취급을위한 인프라를 구축하는 동안 동작 할 수 있으며 계측을 유지한다. 많은 실험실 자동화 된 이미징 및 분석을위한 엄청난 비용이 일반적으로 더 접근 남아있다 (12). 자동화 된 이미지 검사는 정량화 할 수 형광 형질 전환 재의포터와 특정 표현형 분석 12,15을 용이하게한다.자동화 된 시스템이 유용한 기술의 진보를 대표하지만, 많은 질문은 같은 현장 하이브리드 (WISH) 판독 (39)의 전체 마운트 발달 과정에 수천 생물학적 활성 화합물의 쿼리로, 더 초점 수동 스크린에 의해 해결 될 수있다. 인화는 연구 문제를 조사하기 위해 제브라 피쉬 화학 화면을 호출 한 동안 또한, 몇 가지 노력에 도달했습니다 (있는 경우) 포화 많은 주제는 화학 유전학을 사용하여 위반 될 못하고있다. 화학 스크린은 단지 몇 야생형 또는 형질 탱크 이루어진 작은 제브라 피쉬 콜로니를 사용하여 실행될 수있다. 따라서, 유전 심문이 양식은 / 확장이 분야에 다양 화에 관심이 가장 제브라 피쉬의 연구 그룹에 의해 달성해야한다. 다양한 크기의 화학 물질 라이브러리는 상업 유통 및 / 또는 COL에서 조달 할 수있다laborators. 이러한 이유로, 화학 유전학은 열악한 자금 기후에서 경제적으로 할 수 있습니다. 예를 들어, 성공적으로 화면에 필요한 인력의 수가 함께 전용 시간 및 조립할의 분담 물리적 프로토콜 수동 프로세스 샘플 : 그러나, 이러한 스크린의 물류 측면을 계획하는 방법으로서 화학 유전학 화면을 시작으로 장애물이 존재 수천의 수백에서 해당 번호. 여기에, 우리는 세부 사항 수동 높은 처리량 프로토콜은 판독으로 소원 제브라 피쉬 배아에 화학 유전학을 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 mRNA의 성적 증명서의 리보 프로브 (riboprobe) 감지 다음 제브라 피쉬 배아의 약물 치료를 포함한다. 합리적으로 화면을 수있는이 프로토콜, 소규모 팀 또는 한 개인을 사용하여 9 주 기간에 완만 한 화학 라이브러리를 약 600 화합물을 분석 할 수 있습니다.
Protocol
여기에 설명 된 제브라 피쉬의 작업을위한 절차는 노트르담 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 제브라 피쉬에서이 매뉴얼 작은 분자 화면에 대한 연구 디자인에 대한 가이드는 (그림 1)을 제공한다. 이 프로토콜에 설명 된 방법들의 개요 흐름도 (도 2)로서 제공된다. 부품 4-10에 설명 된 배아의 처리 단계를 계획하는 예 라벨링 시스템 (그림 3)을 참조하십시오. 배아의 준비를 들어, 제브라 피쉬의 준비 시리즈 40를 참조하십시오, 및 부품 9-10에서 사용 위시 안티센스 리보 프로브의 준비를 위해, 최근 발표 된 방법 (41)을 참조하십시오.
Zebrafish의 결합 챔버 1. 준비
- 챔버 분할 O / N로 구분 성인 남성 제브라 피쉬와 결합 챔버로 성인 여성 제브라 피쉬를 놓습니다.
NOTE : 질량 교배, 이러한2-3 2-3 여성 및 남성의 것과 사용 그룹들 한 쌍의 교배에 비해 더 많은 배아를 생성 할 수 있으며, 적절한 크기의 정합 챔버로 수행 될 수있다. - 단계를 반복 1.1 제브라 피쉬 25쌍의 총 테스트됩니다 작은 분자의 모든 96 웰 플레이트에 대한 설정이되도록.
제브라 피쉬 배아 2. 컬렉션
- 다음 날, 각각의 물고기 쌍을 구분하는 칸막이를 제거하고 1 시간 후, 미세 메쉬 스트레이너를 사용하여 제브라 피쉬 배아를 수집하고 E3 배아 매체 (조리법에 대한 자료 목록을 참조)를 포함하는 페트리 접시에 놓습니다.
참고 : 1 시간은 배아가 비슷한 발달 단계에 있는지 보장 수집 배아 후. - 파편 (예를 들어, 음식과 고체 폐기물)를 제거하기 위해 플라스틱 전송 피펫을 사용합니다. 다음으로, 모든 미 수정 난자를 배아의 각 클러치를 관찰하고 제거하는 실체 현미경을 사용합니다.
- 각 디를 배치, E3 배아 매체를 가만히 따르다 신선한 E3로 교체28.5 ° C 배양기에서 배아의 SH. 2 시간 후 실체 현미경을 사용하여 배아의 각 클러치를 관찰하고 어떤 미 수정 난자를 제거합니다.
참고 : 미 수정 난자 다른 배아를 독살 할 수 있고 단일 세포 단계 또는 불투명에있는 것으로 나타납니다. - 그들이 epiboly 40 %에 도달 할 때까지 실체 현미경을 이용하여 배아의 발달 과정을 모니터하는 것을 계속한다. 40 % epiboly 단계 (40)에서 두 개의 층으로 구성 보인다 배아의 구 형태를 관찰한다.
3. 화학 희석 준비
- , -80 ° C에서 저장 부로부터 화학적 라이브러리 플레이트를 제거 알루미늄 호일로 덮어하고 RT에서 그것을 해동.
NOTE : 다른 라이브러리가 사용되는 용매에 주로 따라 다른 비율로 해동한다. 일반적으로, -80 ° C에서 냉동 화학 물질 라이브러리는 완전히 RT에서 약 3 시간에 해동됩니다. 적절한 위험 물질 표시와 안전한 장소에 보관 해동 판 (들). 착용ppropriate 안경, 실험실 코트, 장갑의 두 가지 화학 물질을 취급. - 열 96 웰 플레이트의 2-12로 E3의 99 μl를 추가하는 8 채널의 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
참고 : 우리의 경험에서, 적절한부터 약물 범위는 10 ㎛ 사이이다 - 현재의 프로토콜 (39)에 설명 된 50 μM, 또한있다. 1 mM의 화학 라이브러리 주식 판을 사용하는 경우 여기에서 우리는 10 μM 처리를 보여줍니다. - E3와 함께 각각의 웰에 각 화합물의 1 μl를 추가하는 8 채널의 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
- (여기서, 열 12) 제어 컬럼에 1 DMSO의 μL (또는 적당한 용매를) 피펫 P10를 사용합니다.
- 알루미늄 호일이 라이브러리에있는 빛에 민감한 화합물을 보호하고에 주식 화학 라이브러리 판을 반환 바와 같이, 알루미늄 호일 화학 물질 희석 플레이트를 커버 -80 저장을위한 C °.
4. 정렬을 Zebrafish의 배아
- 페트리 접시를 선택40 % epiboly 단계에서 제브라 피쉬의 배아를 포함. 전송 피펫을 사용하여 조심스럽게 (1.1 ㎖)의 각 웰 깊은 96 웰 플레이트 내부에 약 10 배아를 놓습니다. 열 깊은 96 웰 플레이트의 2-12으로 배아를 분배.
참고 : 연구원 가장 그들은 심문하고자하는 개발 프로세스에 맞게 조정 약물 중독의 평가시기를 선택해야합니다. 플라스틱 이전 피펫을 사용하면 배아의 손상을 최소화 할 수있다. 약물 치료 이전에 40 % epiboly 증가 배아 치사가 발생할 수 있기 때문에, 나중에 발달 과정이 검토되고있다 특히, 더 이상 이전의 약물 노출에 대한 배아를 개발합니다. 각 웰 이상 15 ~ 20 배아를 배치 인해 군집 피해야한다에 발달 지연을 초래할 수 있습니다. 이 배아를 함유 깊은 웰 플레이트 (96)가 화학 희석액을 96 웰 플레이트 다르다는 것을 주목하는 것이 중요하다. - 에 초과 E3 각 우물에서 초과 E3를 제거하고 추방 유리 전송 피펫을 사용하여액체 폐기물 용기.
참고 :이 프로세스는 일반적으로 연구자의 속도에 따라 30 분 1 시간 소요, 그래서 배아는 여기에 설명 된 화학 물질의 희석 또한 대상 발달 단계이다 완료, 50 %와 60 % epiboly 사이. 플레이트를 피펫의 선단이 과잉 E3을 그리는 웰의 저부에 대하여 가압 될 수 있도록 배아 웰의 바닥에 떨어질 위해 45 ° 각도로 기울어 질 수있다.
화학 처리의 5 추가
- 배열 된 제브라 피쉬의 배아를 포함하는 깊은 96 웰 플레이트에 각각의 웰에 100 μL 화학 희석을 전송하는 8 채널의 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
참고 : 화합물의 원래 잘 위치가 해당 깊은 96 웰 플레이트 (예를 들면, 화학 물질 희석 플레이트에서 B1 잘 위치가 깊은의 B1 잘 위치에 피펫됩니다에 잘 위치와 일치하는지 확인96 웰 플레이트). - 종이 타월을 적시고 96 웰 플레이트를 저장하기에 충분히 큰 빛에 민감한 용기에 넣습니다.
참고 : 젖은 종이 타월은 화학 희석의 증발을 방지하는 데 도움이됩니다. - 다음으로, 깊은 96 웰 플레이트를 밀봉 빛에 민감 컨테이너에 배치하고, 28.5 ° C에서 그것을 부화 밀봉 매트를 사용합니다.
참고 : 제브라 피쉬 배아가 다음날 아침까지 개발하자. 대안 적으로, 프로세스에 대한 적절한 발달 단계는 분석되고까지 배아 개발하자.
화학 6. 제거
- 약물 치료 우물의 각 행에 E3 300 μl를 추가하는 8 채널의 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 배출시킵니다 우물의 각 행에서 E3 / 화학 희석을 폐기합니다. E3의 300 μL와 배아 제거하는 과정을 3 회 반복한다.
참고 :이 목적으로 만 사용되는 라벨 용기에 약물 폐기물을 폐기하십시오. 세척의 용이성을 위해, 멀티 포트를 사용하기에 충분히 넓은 E3 가득 유리 분지를 사용ichannel 피펫.
7. 프로 나제 및 Zebrafish의 배아를 고정
- 네 개의 24 웰 플레이트에 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 제브라 피쉬 배아를 이동 한 후 죽은 태아를 제거합니다. 그들은 원래의 약물 아니라 위치에 대응되도록 24 웰 플레이트 레이블. 피펫의 배아를 시각화하고 배아 잘 크로스 오버를 방지하기 위해 각 웰 전송 후 어두운 배경 앞에 피펫을 놓습니다.
- 배아는 거의 액체에 잠겨되도록 E3를 그릴 플라스틱 전송 피펫을 사용합니다.
- 각 웰에 프로 나아 주식의 2 방울 (50 ㎎ / ㎖)를 추가 할 유리 피펫을 사용합니다. 배아는 우물이 융모막 떨어져 파손될하는 교반 한 후 5 분 동안 프로 나제에 품어 보자. 그들이 분석 소망 발달 단계에서되기 전에 선택적으로, 배아를 프로 나제.
- E3로 두 번 배아를 씻어 플라스틱 전송 피펫을 사용합니다.
- 배아는 분석, 빌려 원하는 단계에서 일단letely 빼다 나머지 E3를 폐기합니다.
- 각 웰에 신선한 4 % PFA / PBS를 추가하는 플라스틱 전송 피펫을 사용합니다. 4 ° CO에서 배아를 품어 / n를 해결하기 위해. 사용 갓 초기 배아를 해결하기 위해 PFA를 해동.
참고 : 관심의 화면 분석을 수행하기 위해 진행합니다. 섹션 8 ~ 10 여기에 상세한 것은 소원 스크린 판을 처리하는 절차입니다. 다른 방법은 필요에 따라, 다음 제 11로 진행하고 결과를 평가 치환 될 수있다.
8. 배아 투과성으로
- 그릴 오프에 4 % PFA / PBS를 배아에서 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 1X로 두 번 배아를 씻어 PBST (트윈과 식염수를 인산 완충). 다음 배아에서 1X PBST를 그릴, 48 웰 플레이트에 배아를 전송합니다. 깊은 96 웰 플레이트의 원래 잘 위치를 일치하는 48 웰 플레이트 레이블.
- 벗어 그리 100 %하고, 메탄올을 추가 한 다음 플라스틱 전달 피펫을 사용하여 웰을 100 % 메탄올을 첨가하여 워시배아에 다시 L.
- -20 ° C에서 배아를 놓고 적어도 20 분 동안 품어. 대안 적으로, 장기 보존에 -20 ° C에서 100 % 메탄올 배아를 유지한다.
- 100 % 메탄올을 제거하고 50 % 메탄올 / 1X PBST, 다음 30 % 메탄올 / 1X PBST로 배아를 세척하고, 마지막으로 두 번 1X PBST로.
참고 : 배아 나이가 24 시간 게시물 수정 (HPF)는 색소 침착 (39)을 제거하기 위해이 시점에서 표백 할 수 있습니다. - 단백질 분해 효소 K (5 ㎍ / ㎖) 작업 용액을 제조 1X PBST 50 ㎖에 해동 단백질 분해 효소 K 재고 (10 ㎎ / ㎖)의 15 μl를 추가합니다.
- 배아에서 1X PBST를 제거하고 단백질 분해 효소 K 작업 솔루션을 추가합니다. 4 분 후 단백질 분해 효소 K를 제거합니다.
참고 :이 실험은 배아 저하를 방지하기 위해이 단계에서 신속하게 작동합니다. 프로 테이나 제 K 농도와 잠복기 41 치료되는 배아의 연령에 따라 변화 될 필요가있다. 여기에 설명 된 매개 변수는 배아에 해당하는24 HPF됩니다. - 1X PBST와 배아를 세척 한 다음 얼음처럼 차가운 4 % PFA / PBS를 추가합니다. 배아 RT에서 20 분 동안 4 % PFA / PBS에서 부화하자.
9. 하이브리드 및 프로브 제거
- 유리 전송 피펫 사용하여 4 % PFA / PBS를 제거하고 1X PBST로 두 번 배아를 씻으십시오. HYB + 500 μL와 1X PBST를 교체하고 70 ° C에서 4 시간 동안 배아를 배양한다.
NOTE : 사전 혼성화는이 같은 몇 시간 동안 수행 될 수 있지만, 4 시간이 적합하다. 또한, 다양한 하이브리드 및 세척 온도는 65 ° C와 같은 특정 프로브에 이상적 일 수 있지만 개별적으로 테스트해야합니다. - 관심 (41)의 유전자 (들)에 해당하는 digoxygenin 표지 리보 프로브를 생성합니다.
- HYB + 16 ml의 리보 프로브 (riboprobe)의 16 μg의 추가. 사용하기 전에 적어도 20 분 동안 70 ° C에서 리보 프로브 (riboprobe) / HYB + 용액을 미리 가온. 다수의 프로브를 사용하는 경우, 동일한 H 각 프로브의 16 μg의 추가YB의 + 용적 (16 ㎖).
- 유리 전송 피펫을 사용하여 HYB +를 제거하고 리보 프로브 (riboprobe) / HYB + 혼합물의 200 μL에 추가 P1000을 사용합니다. 사용하고 최대 피펫 직전에 아래로 한 번 잘 각각에 혼합물을 추가하기 전에 리보 프로브 (riboprobe) / HYB + 칵테일 전환. 리보 프로브 (riboprobe) / HYB + 솔루션을 추가 할 장벽 피펫 팁을 사용하여,이 피펫 들어가는 혼합물 증기를 방지 할 수 있습니다.
- 70 ° CO / N에서 리보 프로브 (riboprobe) / HYB + 칵테일의 배아를 품어. O / N 프로브와 인큐베이션 다음 뜨거운 세척 모두를위한 플레이트 웰을 덮도록 접착 필름을 사용한다.
- 70 ° CO / N에서 50 % 포름 아미드 / 배 SSCT, 배 SSCT 및 0.2 배씩 SSCT 및 사전 따뜻한을 준비합니다.
- P1000을 사용하여, 리보 프로브 (riboprobe) / HYB +를 제거하고 -20 ℃에서 혼합물을 저장합니다. 선택적으로, 최대 3 번까지 리보 프로브 (riboprobe) / HYB + 혼합물을 다시 사용합니다. 각 재사용하기 전에, 원래 ribopr 리보 프로브 (riboprobe)에 3㎍을 추가로OBE / HYB + 혼합물.
- 유리 전송 피펫을 사용하여, 70 ° C에서 30 분 동안 50 % 포름 아미드 / 배 SSCT 배아 회 씻는다. 70 ° C에서 15 분 동안 2 배 SSCT 한 번 배아를 씻으십시오. 70 ° C에서 30 분 동안 0.2 배씩 SSCT 두 번 배아를 씻으십시오. 0.2 배씩 SSCT를 제거하고 RT에서 두 번 MABT와 배아를 씻으십시오.
10. 안티 digoxygenin 항체 배양 및 검출
- 각 우물에서 MABT을 제거하기 위해 유리 전송 피펫을 사용합니다. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 각 웰에 신선한 블록 솔루션을 추가합니다. 배아는 실온에서 4 시간 동안 블록에 품어 보자. 블록 솔루션 (5,000 배 희석)의 40 ml의 항 digoxygenin 항체의 8 μl를 추가합니다.
- 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 항체 / 차단 솔루션 블록 솔루션을 교체합니다. 완전히 배아를 커버하기에 충분한 항체 / 차단 솔루션을 추가합니다.
- 더 빛이 배아를 통해 침투 할 수 없도록 알루미늄 호일로 48 웰 플레이트를 커버. Inc의4 ° C에서 배아 O / N을 ubate. 유리 피펫을 사용하여, 항체 / 차단 솔루션을 제거하고 5 ~ 10 분 각각의 배아에게 MABT 10 회 반복한다.
참고 :이 우물에 신선한 MABT 각 판에서 MABT를 제거하고 분배하는 연구원 5 ~ 10 분 소요됩니다로 MABT 세척이 연속적으로 수행 할 수 있습니다. - 미리 염색 버퍼의 40 ㎖ (80 ml의 합계)의 두 개의 튜브를 생성합니다. 염색 액을 만들기 위해 사전 염색 완충액 준비된 튜브 중 하나에 NBT 180 μL (50 ㎎ / ㎖) 및 BCIP 140 μL (50 ㎎ / ㎖)를 첨가.
참고 :이 염색 액은 보라색 컬러 기판을 생성합니다. - 미리 염색 버퍼 MABT를 교체하고 배아가 5 분 동안 실온에서 배양 할 수 있습니다.
- 염색 액에 미리 염색 버퍼를 교체하고 RT에 둡니다. 비색 반응을 실체 현미경을 사용하여 15 분마다 모니터.
참고 : 염색 반응은 프로브에 따라 많은 시간이 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 대표염색 반응이 완료된 후, 5 분 동안 1x를 PBST로 두번 세척 한 후 배아 1X PBST로 염색 액 레이스.
- 1X PBST를 제거하고 배아를 해결하기 위해 4 % PFA / PBS를 추가합니다.
NOTE : 또는 항 - 형광 항체로 표지 된 리보 프로브를 검출하는 이중 WISH을 수행한다. 현장에서 두 번을 수행하는 경우, 1X PBST 세척한다 (단계 10.8) 이후 4 % PFA / PBS (단계 10.9)를 추가 건너 뛰고 MABT 세척으로 15 분 동안 두 번, 0.1 M 글리세롤로 15 분 동안 두 번 배아를 세척하고, 블록의 30 분의 배아를 배양한다. 그런 다음 올바른 염색 액을 사용하는 단계 10.3-10.9을 올바른 항체 O / N에 추가하고 수행합니다. , fluoroscein 표지 된 리보 프로브 (riboprobe)를 검출 적색 기판을 관찰하고 BCIP INT와 염색 액을 제조 (단계 10.1 참조).
11. 점수 화학 화면 배아 플레이트
- 배아 SAMPL을 평가하기 위해 실체 현미경을 사용하여 결과를 시각적으로 채점을 수행표현형 분석에서 말이지.
- 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 최적의 시각화 12 잘 접시에 48 잘 접시에서 배아를 전송합니다. 그들은 원래 깊은 96 웰 플레이트에서 잘 위치에 대응되도록 12 웰 플레이트 레이블. 전송이 완료되면, 입체 현미경 볼.
NOTE : 주제 배아 12 웰 플레이트로부터 선택과 커버 슬립 (41) 아래의 유리 슬라이드 상에 이미징 될 수있다.
Representative Results
여기에 설명 된 수동 접근법 효율적 성공적 소분자 화학 유전학 지브라 피쉬 배아 모델 (도 1)를 사용하여 화면 높은 처리량을 수행하는 단일 연구원 허용한다. 한 사람은 화학 유전학 화면을 수행하기 위해이 방법을 사용하면, 9 주에 걸쳐 한 사람 (40 시간 근무제에 최선을 다하고) ~ (600) 화합물의 설문 조사를 수행 할 수 있음을, 같은 실용적이다 (그림 1) . 따라서, 한 사람의 벤치 타임 높은 리소스 요구 장비 같은 자동화 된 시스템에 대한 필요성을 우회 할 수있다. 트레이드 오프는 수동 화면 전용 노력의 몇 주를 필요로한다는 것이다. 대조적으로, 자동화 된 시스템의 사용은 로봇 시간 1-2주에 필요한 시간을 압축 할 수 있으며, 상대적으로 최소의 전체 연구 노력을 수반 할 수있다. 수동 스크린의 효율 및 / 또는 범위를 증가시킬 수있는 한 가지 방법은 m의 스크리닝을 가능하게하는 것, 총 2-3 연구자 참여하는광석 화합물은 다양한 화합물 농도, 및 / 또는 더 짧은 시간 동안 스크리닝.
위시 판독와 제브라 피쉬 배아에서 화학 유전학 화면을 완성하는 데 프로토콜에 관련된 주요 단계는 플로우 차트 (그림 2)로 설명된다. (1) 화학 노광 및 배아 라벨링, 및 (2)와 촬상 분석 : 실험적인 작업은 작업 주의 두 종류로 나눌 수있다. 화학 물질 노출 작업 주에서 다음 단계는 4 일 ((3 일) 현장 하이브리드에있어 배아를 준비, 제브라 피쉬 성인 (1 일), 배아 수집으로 배열 배아 및 약물 치료 (2 일)을 설정하고, 현장 하이브리드에 포함 -6). 분석 / 영상 주에서, 연구원은 배아 및 이미지 안타 (일 7-11) 점수 mRNA 발현을 분석한다.
화학 유전학 화면을 수행의 중요한 부분은 일관되고 정확하게 잘 위치에 라벨을하는 것입니다. 화학 유전학 화면 피로서rocess는 상이한 플레이트에 웰에 하나의 플레이트에 웰로부터 여러 번 배아의 세트를 전송 포함 화학 히트 얻었 될 때 선형 쉽게 다시 추적 될 수 있도록, 정확하고 명확한 라벨에 대한 필요성이 최우선 여기 자세히 화학 라이브러리 내의 정체성 (그림 3)에. 이를 보장하기 쉬운 방법 언제든지 화합물로 처리 된 배아의 세트의 잘 위치가 직접 그 배아를 치료하는 데 사용되는 화합물의 화학적 라이브러리 약물 플레이트 웰 위치와 일치하는 방식으로 플레이트에 라벨 (그림 3). 여기서, 컬러 코딩 및 수치 레이블의 이중 시스템은 영구 마커 (도 3)를 사용하여 스크린 플레이트에 첨가하고 샘플을 정리하기 위해 이용된다.
높은 처리량 스크린의 결과를 분석하는 동안, 방법은 정확하게 정리 개발 주석, 잠재적 인 작은 분자를 분석하는 중요한 필요성이있다안타. 따라서, 화학 유전학 화면은 신중하게 설계하고 엄격하게 준수하는 철저하고 명확한 등급을 매기는 시스템이 있어야합니다. 이러한 시스템은 쉽고 완전 화합물의 중요한 역학을 전달하고 완성 된 스크린의 결과를 제시하는 간결한 방법을 제공한다. 이러한 시스템을 구축하기위한 하나의 방법은 전반적으로 형태학의 심각성과 히트의 신뢰를 설명 할 클래스 시스템을 이용하는 등급 배아이다. 또한, 클래스 분류가 결합 될 수있는 (+) 또는 (-)의 관심 영역 (들)의 팽창성 또는 환원 효과를 설명한다. 여기에, 제브라 피쉬 배아는 24 HPF에 50 % epiboly에서 생리 활성 라이브러리 (엔조 화학)에서 개별 화합물을 실시하고 네프론 세그먼트 (그림 4A)를 감지하는 세 리보 프로브의 칵테일을 사용 위시하여 분석 하였다. 예 그레이딩 시스템 대폭 확대 근위 convolu 있었다 배아기를 함유 아니라pronephros의 테드 세관 (PCT), 제브라 피쉬 배아 신장, 즉이 경우에도 가장 심각한 결함과 연관된 클래스의 최고 수준을 나타낼 것이다 (등급 I)로 분류되는 치료에 사용되는 화합물을 야기 (그림 4B) 관찰 된 표현형에 대한 자신감. (그림 4B) - 화합물은 다음 (PCT)와 (+) 인 완전한 표기법 (PCT의 + 클래스 I) 주석이 될 것이다. 분류 개념은, 약물 및 영역이되는 방식에 의해 영향을받는 영역을 유기체에 화합물의 효과의 정도를 포함하여 관심 소분자에 관한 정보의 수집 물을 설명하기 위해 간단하고 빠른 방법을 제공한다 영향 (그림 4B).
그림 1. & #(160);. 수동 제브라 피쉬 배아 화학 스크린 전략 연구원은 실행 가능하게 제브라 피쉬 배아에 화학 물질의 96 웰 플레이트를 테스트하고 한 주 동안 다음 위시 처리를 수행 할 수 있습니다. 화학 시험 (1 주 (주 1-6)과 2 주 (7-12 일)) 2 주를 수행하는 분석을 샘플링하기 위해 최선을 다하고 셋째 주와 페어링 할 수 있습니다. 약 화면 샘플의 가치가 두 개의 96 웰 플레이트는 3 주 (13 ~ 17 일) 득점 이미지를 만들 수 있습니다. 이 시나리오는 완전히 구주 의해 스크리닝 600 화합물의 작은 라이브러리 동일시, 3 주 기간 동안 약 200 화합물의 스크리닝에 달한다. 이 설명서 전략은 가능한 자원에 따라 변경 될 수있다. 예를 들어, 세 연구자들은 하나 연구원으로 수행하게 구주 비교 3주 약 600 화합물의 화면을 완성하는 시간을 줄일 수있다. 선별 전략 등의 약물 치료로 화면의 특정 측면, 연구자를 지정하여 적용 할 수 있습니다, 표준 및 계내 혼성화 또는 연구자 연출 독립적 화학 라이브러리의 분리 된 부분에 전체 스크리닝 프로세스를 수행한다.
그림 2. 순서도 :. 육일 화면 워크 플로우의 고장 화학 심사 이산 육일로 분류 할 수있다. 1 일 각 96 웰 플레이트를 상영하는 배아를 공급하는 제브라 피쉬의 짝짓기 쌍 (= /> 25) 설정으로 구성되어 있습니다. 제 2 일 약물 처리를 수행함으로써, 정합 챔버로부터 배아를 수집하고 96 딥 웰 플레이트에 배열들을 포함한다. 3 일에, 배아는 dechorionation, 조직 고정 및 배아 탈수를 포함 WISH에 대한 준비가되어 있습니다. 마지막으로, WISH는 4-6 일을 통해 배아에서 수행됩니다. S 쉽게 할 수 있습니다 고정 표본에 그 대안 염색 절차를주의하십시오소원 ubstituted.
그림 3. 플레이트 전송 라벨 회로도. Zebrafish의 배아가 배열되는 약물은 96 웰 플레이트에서 처리 후 이물질 제거 및 프로 나아 노출 24 웰 플레이트로 옮겼다. 배아는 배아 준비, 위시, 및 조직 고정 용 48 웰 플레이트로 이동됩니다. 다음, 배아 득점, 이미징 및 저장을위한 12 잘 접시로 전송됩니다. 배아의 정확한 정렬을 각 시료에 대한 기원의 화학 물질을 추적하는 연구를 할 수있는 컬러 코딩 시스템을 사용하여 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 실시 예 등급제 :. 신장 세그멘테이션 분석법 WISH 실험은 mRNA의 전사 위치의 변화에 따른 배아 표현형의 변화의 평가를 허용 선택되는 프로브의 신원에 기초하여 특정 세포 유형 얼룩이 연구원을 가능하게하고 / 또는 수준. 예로서, 제브라 피쉬 배아 신장의 세 부분은 pronephros는, 스크린 믹스 1. 스크린 믹스 한 특별히 족 세포 (P)에 편재 wt1b 이루어진 프로브 칵테일이다 사용 컨볼 루션 근위 마크 slc20a1a 표지 된 말초 초기 (DE) 세그먼트 47 레이블 가느 다란 관 (PCT) 및 slc12a1. (-) 기호 지역의 경감,을 지시하는 데 사용되는이 동안 (+) 기호는 지역 라벨 옆에, 확장 또는 해당 지역의 긍정적 인 변화를 주석하는 데 사용됩니다. 여기에, 그들을13 시스 RA 치료 bryos 약물이 확대 근위 세뇨관와 족 세포에 뚜렷한 효과와 말초 초기 세그먼트의 전체 손실이있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
제브라 피쉬의 화학 유전학은 신약 개발의 진행에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 효과적으로 소분자 화면을 수행하는 개인 또는 소규모 팀을 가능 WISH 독출하여 제브라 피쉬 배아 화학 유전학을 수행하기 위해 수동 높은 처리량 방법을 제공한다. 이 최소한의-자원의 방법은 많은 연구 그룹에 화학 유전학의 가능성을 확장합니다. 이러한 시스템은 광범위하게 연구 부서에서 액세스 할 수없는 구체적으로,이 화면이 전략은 로봇 장비의 사용에 중요한 대안을 제공합니다. 이 매뉴얼 화면은 한 개인이 6 일 근무 주에 소원 판독과 화합물의 한 96 웰 플레이트를 테스트 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 때문에 배아는 부모 이외의 개발과 함께, 난생이며, 배아, 그들은 수동 간단한 악기 취급 및 연구원 수 배열 샘플에 대한 의무가 있습니다 (1-3mm 사이) 육안으로 볼 수있을만큼 큰현미경을 사용하지 않고 멀티 웰 플레이트. 지브라 피쉬가 신속하게 개발하기 때문에, 소분자 노광 추가 수동 처리를 최소화 화합물의 단일 치료보다는 반복 투여와 효과적 일 수있다. 자신의 노른자 먹이 튀김의 합병증을 제거 5-6일 포스트 수정에 영양까지의 소스를 제공하기 때문에 제브라 피쉬 배아는 쉽게 배양한다. 또한 유생 기관의 대부분은 개발 연구 질문의 광범위한 연구 할 기회를 제공하고이 기간 동안 작용 될 수있다. 배아 배양 미디어에 작은 분자의 간단한 추가는 비 침습적이며, 연구원 (들) 약물 투여에 대한 선택, 또한 시간 및 기간을 허용 노출 - 따라서 많은 변수를 통해 엄격한 제어를 제공하고 특정 발달 과정을 가능하게 관심을 조회 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 바와 같이, 상당한 연구 생산성 짧은 timefr 실현할 수있다이 설명서 화면 방법론을 사용하여 좀 보자. (;, 게시되지 않은 Poureetezadi 및 Wingert 그림 4) 우리의 경험에 의하면, 이러한 신장 개발하는 동안 네프론 세분화와 같은 관심의 과정을 분석 알려진 생리 활성 화학 물질 라이브러리를 사용하여 강조 할 수있는 투자 노력에 높은 수익이있다.
그것은 고정 된 제브라 피쉬의 표본에 분석을 포함하기 때문에 여기에 설명 된 매뉴얼 화학 화면은 매우 다양합니다. 예를 들어,이 전략은 1 주일 화합물의 여러 판을 테스트하기 위해 개정 될 수 있으며, 다음 주에 배아를 점수. 이러한 또는 다른 면역 조직 염색 제제 같은 고정 지브라 피쉬의 샘플들에 대안 분석은,도 WISH 판독 대체 될 수있다. 실험 전략은 제브라 피쉬의 세포 분석에 의한 초기 발달 단계의 광학적 선명도와 투명도에 적용 할 수 있습니다 수행 할 수 있습니다. 또한, 연구진은 나중에 역에 색소 침착을 억제 할 수GES는 화학 물질을 사용하거나 아예 캐스퍼 또는 깎아 지른듯한 제브라 피쉬 (13) 등의 색소가없는 유전 라인의 사용을 통해 안료 개발의 합병증을 피할 수 있습니다. 그것은 수동으로 작은 분자를 관리 가능하다 관심의 얼룩 (들)을 처리하고에 수동으로 간단한 입체 현미경을 사용하여 배아를 점수. 그러나, 자동 이미지 분석을 수행 할 수 있다는 것을 명심하는 것이 중요하다, 실제로 고해상도의 표현형 분석을 위해 요구 될 수있다. 이 샘플의 수동 처리를 간소화 육안으로 쉽게 식별 할 수없는 차이를 정량화하고, 연구원 바이어스 (15)을 제거 같이 예를 들어, 그것은, 예컨대 트랜스 제닉 리포터로서 파트너 직접 분석법과 자동 화상 분석 시스템에 바람직 할 수있다. 다행히도, 몇몇 자동화 된 이미징 시스템은 사용자 친화적 모두 소프트웨어 비용 (15)의 측면에서 경제적이다. 사용 및 기타 자동화 시스템의 기능은 빠른 속도로 진화 할 수있다생물 12,15 위치를 변경하는 경우에도 약물 치료를 관리하고, 동양의 유기체로 사용합니다. 이러한 자동화 시스템은 연구의 새로운 기술 시대를 예고하고 시험 대상의 대량 조작 때문에 HTS를 수행하기 위해 혁신적인 솔루션을 제공하고 HCS는 전체 생물 12,15에 접근한다. 그런 기계는 부정 할 수없는 유용한 도구이지만, 그들은 또한 매우 비용이 많이 드는 많은 기초 연구 실험실의 손이 닿지입니다. 이러한 자동화 된 기능에 액세스하지 않고는 화학 스크린 수없는 것으로 보일 수 있습니다. 그러나이 프로토콜은 적절한 기간에 걸쳐 실질적인 방식으로 화학 유전학 화면을 완성하기 위해 사용될 수있는 수동 화면을 수행하는 방법에 대한 가이드를 설명.
일반적으로 모두 수동 검사 및 화학 유전학 단점이 존재하고, 화학 화면을 고려할 때 염두에 두어야한다. 특히, 여기에서 입증 방법은 중등도을 필요물리적 손재주의. 손재주가 연습을 개선하므로 이러한 우려는 감소 또는 전체 반복을 통해 없어진다. 분석을 위해 잘 당 10 배아가있는 한 또한, 총 오류에 대한 최소한의 공간이있다. 합리적인 득점식이 요법을 준수해야 관심의 화합물을 식별 할 수 있도록 작은 분자, 유도 표현형의 투과도에 따라 다를 수 있습니다. 그것은이 프로토콜을 사용하는 연구자들이 히트를 고려할 것입니다 무엇에 대한 적절한 엄격한 기준을 마련하는 것이 중요합니다. 이 화면이 형태의 자연이 가장 가능성이 더 화학 작업 업을 통해 묘사 될 수 오탐 (false positive)의 일정 부분을 보장 할 것을 명심하는 것이 중요하다. 또한, 정확하게 배아를 무대 비동기 개발 정확하게 약물 치료의 효과를 평가하는 합병증을 초래할 수 있으므로, 수정 직후 스크리닝 클러치를 수집하는 것이 중요하다. 또한, 전 화학 검사에 관해서perimental 전략은 많은 제한이있다. 화합물 용해도 및 담체 분자의 독성 (예, 디메틸 술폭 시드 (DMSO))은 또한 문제를 제시 할 수 많은 분자를 테스트 금지 될 수있다. 융모막은 약물 노출에 대한 장벽 역할을 할 수 있습니다. 마지막으로, 제브라 피쉬 화학 유전학 강력 및 병진 모델이더라도, 케어 항상 같은 세포주로 시험 관내 시스템을 사용하여, 예를 들면, 대안 화학 스크린 전략 여부를 결정주의해야 전체의 사용을 대체 할 수 동물. 이 화합물의 전신적 효과를 수집하는 장점을 제공하며, 포유 동물 모델에서 시험 될 화합물의 목록을 선별 연구자 사용할 수 그럼에도 불구하고, 전체 제브라 피쉬 시스템의 화학적 처리는, 포유 동물에서와 유사한 방법을 수행하는 것이 고려된다.
현재까지, 제브라 피쉬 화학 스크린은 강력한 실험 도구 (T)를 제공하고 있습니다오 발전의 메커니즘을 묘사하고 이러한 질병 병리를 방지 할 수있는 분자의 식별로, 의약품에 사용되는 약물 후보를 확인하기 위해. 예를 들어, 화상 및 동료의 연구는 심근 (42)에 GFP를 표현 형질 전환 제브라 피쉬 배아를 사용하여 심장 박동에 대한 자동화 된 마이크로 웰의 분석을 개발했다. 이들은 개발 심박수를 분석이 형질 전환 라인을 사용하고 약물 치료 42에 어떻게 영향을 받았다. 또 다른 연구는, 제브라 피쉬 배아의 조혈 줄기 세포의 인구 밀도를 테스트함으로써, 프로스타글란딘 E2가 HSC 틈새 (23)을 조절하는 것을 확인 하였다. 이 발견은 마우스에서 검증되었고, 나중에 인간 제대혈 이식 23,31-33 (NIH 임상 Trials.gov, NCT00890500, NCT01627314)에서 임상 시험을 위해 구현되었습니다. 몇몇 최근의 연구를 통해, 화학 유전학은 제브라 피쉬를 이용한 신장 질환을 연구하는데 유용한 것으로 입증
화학 유전학 연구는 실질적인 장점을 맺는 동안, 특정 과제가없는 것은 아니다. 단독으로는 화합물에 의해 영향을 받고있는 특정 유전자 또는 유전자를 결정하기 위해 복잡하게 만들 수 화학 유전학 방식을 사용. 타겟 (들)가 발견하더라도, 실리콘gnificant 갭은 화합물 식별 및 작은 분자가 동작하는 작용 메커니즘 (들) 사이에 이해 남아있을 수있다. 예를 들면, 하나의 화합물이 생체 내에서 다양한 효과의 범위를 가질 수 있기 때문에 작은 분자가 작용하는기구를 결정하기 어려울 수있다. 신기술 이상의 화학적 유전 스크린의 출현이 제브라 피쉬에 완료되면서 그러나,기구를 결정하는 문제는 줄어들고있다. 확인 된 화합물의 분자 효과를 결정하는 데 도움이하는 한 가지 방법은 메커니즘이 잠재적으로 이전에 주석 데이터에서 추론 할 수있는 검사, 알려진 생체 활성제의 약물 라이브러리를 선택하는 것입니다. 또한, chemoinformatic 알고리즘, 검색 게이트처럼, 관찰 작용 메커니즘 (14) 화합물의 데이터베이스에 대해 화합물의 구조적 유사성을 비교할 수 있습니다 사용할 수 있습니다. 그러나 화합물의 메커니즘을 해명하기위한 또 다른 방법은 MICR를 생성하는 것oarray 치료 후 프로파일 다음 비슷한 효과 (14)을 유도 기계적으로 정의 된 화합물을 찾고, 이러한 연결지도와 같은 마이크로 어레이 약물 프로필의 편집이 프로필을 조회. 이 접근법은 또한 관심있는 화합물과 유사한 효과가 유전자 돌연변이를 식별하는데 사용될 수있다. 화합물 및 돌연변이 간의 연결을 찾는 것은 화합물이 분자 상류 또는 화합물과 함께 morpholinos 돌연변이 처리로 구분 될 수있는 관련 유전자의 하류 작동 제안 것이다. 또 다른 옵션은 제브라 더 최적화 될 계속 질량 분석 될 것이다. 이 방법은 약물 치료 후에 특정 단백질 변화 또는 번역 후 변형을 묘사하기 위해 사용될 수있다. 마지막으로, 작은 분자 또는 전체 라이브러리를 결합 파트너의 풀다운으로 태그되는 때때로 할 수있다. 그것은 또한 주목할 가치가 그 동안 얼마나 소분자 기능기구 전상당한 수입들, 메커니즘 알 수없는 남아있는 FDA 승인 약물이 있습니다.
제브라 피쉬는 모두 유전 및 생리 학적으로 포유 동물에 많은 유사점을 전시 있지만, 여전히 약물 크로스 오버 (14)의 문제가 있습니다. 한 연구는 제브라 피쉬 배아 50 세포주기 억제제 화면에서 히트 크로스 오버 기능을 조사 하였다. 스크린은 세포주기 활성을 갖는하기 이전에 알려져 있지 14 히트의 식별 결과. 이들 14의 화합물 중에서, (6) 모두 인간 및 지브라 피쉬 세포 배양 분석에서 세포주기 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다, (3)은, 1 만 제브라 피쉬 세포에서 활성화 된 세포 배양 분석법에서 혈청 불활 것으로 도시하고, (4)에 아무런 활동이 없었다 어느 제브라 피쉬 또는 인간 세포 배양 분석 있지만 제브라 피쉬 전체 유기체. 특히, 단지 지브라 피쉬의 활성이 있었다 (4) 화합물 prohi있다 지브라 피쉬와 포유류 사이의 차이가 있음을 입증특정 화합물의 병진 전위 비트. 그러나 이는 포유 동물에서 신장 회복 속도를 개선 인간 수신자와 PTBA 유도체에 생착하는 조혈 모세포의 능력을 증폭 PGE 2 이에 증거를 제공 같은 작은 분자의 예는, 거기 염두하는 중요한 고려 원칙의 크로스 오버 23,31-33 가능하다.
에 관계없이 이러한 함정, 화학 유전학이 최소 - 자원 접근 방법의 연구 커뮤니티를 제공하는 많은있다. 화학 유전학은 제브라 피쉬에 특히 유용 및 분자 경로 심문 및 신약 개발에 중요한 역할을 할 것입니다. 개별 분자 표적에 따라 화학 화면은 역사적으로 인해 흡착, 분포, 대사, 배설 및 독성 (ADMET) 속성 (51)의 별자리로 알려진에 높은 실패율의 대상이되고있다. 에 제브라 피쉬를 이용한 화학 화면오히려 이산 목표보다는 여러 ADMET 문제를 회피하고, 전체 유기체의 맥락에서 효능이있는 화합물을 식별 할 수 있고, 프로세스에 초점. 현재의 돌연변이 균주와 표적 유전자 돌연변이 형질을 만들 게놈 편집을 사용하는 기능을 포함하여 제브라 피쉬 연구에 사용할 자원의 증가 수영장, 제브라 피쉬를 사용하여 잠재적 인 화학 유전 스크린의 무한한 수는 거의있다. 많은 화학 물질 라이브러리는 기획 및 알려진 생체 활성제, 구조적으로 다양하고 구조적으로 유사한 신규 화합물과 스팬 컬렉션되었습니다. 이 시약은 현재 사용할 수있는 더욱 앞으로 성장 가능성이 화면 조합에 대한 흥미로운 기회를 풍부하게 제공합니다. 손 이러한 가능성과 함께,이 설명서 및 높은 처리량 프로토콜 지브라 피쉬를 이용한 화학 유전자 스크린을 수행하는 연구 그룹의 능력을 증가시키는 실질적이고 사용자 친화적 인 방법을 제공한다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 다음에서 Wingert 연구소에 자금에 의해 지원되었다 : 건강의 국립 연구소는 K01 DK083512, DP2 OD008470 및 R01 DK100237을 부여; 다임 바질 오코너 초보 학술 보조금 수상 # 5 - FY12-75 년 3 월; 과학 생물 과학학과의 노트르담 대학의 대학에서 기금을 시작; 그리고 갤러거 가족 대신에 엘리자베스와 마이클 갤러거의 노트르담 대학에 관대 한 선물은 줄기 세포 연구를 촉진한다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에서 어떤 역할을 없었다. 우리는 원고에 중요한 피드백을 제공하기 위해 폴 T. 크로 거, 주니어 감사합니다. 우리는 그들의 지원을 위해 생물 과학의 부서의 직원을 감사하고, 우리의 제브라 피쉬 식민지의 보호와 복지에 뛰어난 헌신 노트르담 Zebrafish의 연구 센터. 마지막으로, 우리는 우리의 resear의 구성원을 감사이 작품에 대한 자신의 의견, 토론과 통찰력 채널 실험실.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 10 μl natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
| 1x E3 | Generate using 50x E3 and DI water. | ||
| 1x PBST | Generate 0.1% Tween-20 in 1x PBS. | ||
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| 24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
| 4% PFA/1x PBS | Generate 4% PFA (w/v) in 1x PBS - boil then freeze and store at -20 °C. | ||
| 48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| 50x E3 | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl, and 8.5 mM KCl in DI water. | ||
| 96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
| 96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
| anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/ml using 100% DMF - freeze then store at -20 °C. |
| block solution | Generate 50 ml using 10 ml BSA (10%), 5 ml FCS, and 35 ml MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) | ||
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| epT.I.P.S 20-300 μl | Eppendorf | 22492284 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50 ml of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
| filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 μm CA / 1 L volume |
| fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
| flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
| glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
| glass pipette | VWR | 14673-010 | |
| glass vial | Wheaton | 225012 | |
| glycerol | Sigma | G7893 | |
| glycine | Sigma | G8898 | |
| glycogen | Roche | 10901393001 | |
| HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml yeast torula RNA, and 50 μl/μl heparin | ||
| INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55 mg/ml using 70% DMF and 30% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 ml of 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2 L and autoclave. | ||
| MABT | Generate 0.1% Tween-20 in MAB | ||
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| multi 8-channel pipette 0.5 - 10 μl | Eppendorf | 3122000.019 | |
| multi 8-channel pipette 30 - 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50 mg/ml using 70% DMF and 20% H2O - freeze then store at -20 °C. |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
| plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
| pre-staining buffer | Generate 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) | ||
| Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50 mg/ml using E3, freeze then store at -20 °C. |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10 mg/ml in DI water then freeze and store at -20 °C. |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
| staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. |
| staining solution-red | Generate using 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP for every 10 ml needed in pre-staining buffer. | ||
| stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |
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