Protocol
Forsigtig: Uidentificerede bakterier fra alle miljøer, kan være sygdomsfremkaldende og skal håndteres med forsigtighed ved anvendelse af passende biosikkerhed protokoller. Arbejde med levende kulturer skal udføres i en klasse II biosikkerhed kabinet hjælp Biologisk sikkerhed Niveau 2 (BSL-2) procedurer. Mere information om BSL-2 procedurer gives i CDC / NIH manual med titlen, "biosikkerhed i mikrobiologiske og Biomedicinske Laboratories," sider 33-38. Dokumentet er tilgængelig online på http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Egnede personlige værnemidler (PV), herunder kitler / kjoler, sikkerhedsbriller og nitril eller latex handsker, skal anvendes. Standard mikrobiologiske fremgangsmåder og forholdsregler skal følges, og biologisk farligt affald skal bortskaffes på passende vis.
Bakterier, der anvendes i denne demonstration blev isoleret fra Kartchner Caverns,AZ, USA, fra fire miljøer, herunder tør speleothem, flow sten, fugtig speleothem og stalactite drop (tabel 1). Alle isolater blev identificeret ved 16S rDNA-sekventering og holdt ved -80 ° C i 25% glycerol-R 2 B medium. Alle eksperimenter blev gennemført ved stuetemperatur.
Bemærk: Det anbefales at bruge den samme prøve forberedelse metode til at erhverve massespektre for database byggeri og masse spektre af ubekendte. Prøveforberedelse metode er tidligere blevet vist at påvirke spektrum kvalitet og reproducerbarhed 3. Brug af en anden prøve fremstillingsmetode kan medføre forkert identifikation af ubekendte, især når højere systematisk opløsning (fx på stammen niveau) ønskes.
1. Deposition på MALDI Target
Forsigtig: Flere protokoller for at opnå proteinekstrakter kræver brug af syrer og organiske opløsningsmidler, der skal anvendes i overensstemmelse med guidElines og oplysninger i deres respektive materialer sikkerhedsdatablade (MSDS). Passende PV skal slidt og vil variere baseret på typen og mængden af anvendte kemikalier (f.eks kitler / kjoler, handsker, sikkerhedsbriller og åndedrætsværn skal anvendes, når der arbejdes med betydelige mængder af giftige, antændelige opløsningsmidler, såsom acetonitril, og ætsende syrer, såsom myresyre og trifluoreddikesyre).
- Depositum 1 pi proteinekstrakt ikke indeholder levedygtige celler (opnået ved hjælp af passende, tidligere beskrevne protokoller 11-13) på en rustfri MALDI måltavle og lad det tørre. Overlay tørret proteinekstrakt med 1 pi matrixopløsning (α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre opløsning), og lade det tørre.
- For hver biologisk gentagelse, spot et passende antal tekniske gentagelser (5 til 20 tekniske gentagelser). Her spot 10 tekniske replikater for hver biologisk replikere og 3 biologiske replikater were forberedt.
Bemærk: Det anbefales at bruge en poleret MALDI mål stålplade, når du bruger proteinekstraktion prøveforberedelse metode. Brug af jorden stål målplader kan forårsage spredning og uforsætlig sammenblanding af de forskellige prøver uden for individuelle prøvebrønde. - Depositum 1 pi kalibrant standard på måltavle og lad det tørre. Overlay med 1 pi matrixopløsning og lad det tørre.
- Deposit 2 pi matrix opløsning på målpladen som en negativ kontrol.
2. Mass Spectra Acquisition
- Brug en MALDI-TOF massespektrometer udstyret med et nitrogen laser (λ = 337 nm) og drives ved hjælp af Bruker FlexControl software.
- Saml hver massespektrum i positiv lineær tilstand ved ophobning af 500 laser skud i intervaller 100 skud. Indstil ionkilden 1 spænding til 20 kV; ionkilde 2 spænding til 18.15 kV; og objektivet spænding til 9,05 kV. Bemærk, at disse parametre er instrument-speciFIC og kan kræve justering af andre instrumenter for at opnå optimale resultater.
- Sæt masse-til-charge sortiment til automatiseret spektrum evaluering fra 2 til 20 kDa per opladning. Brug centroid topdetektion algoritme. Indstil minimum opløsning tærskel på 100 Da. Sæt signal til støjforhold (S: N) tærskel på 2. Indstil den minimale intensitet tærskel på 100.
3. Database Byggeri
- Database design
- Opret en ny database i BioNumerics 7.1 ved hjælp af "Ny database guiden".
- Opret et spektrum eksperiment type, f.eks, Maldi, brug af kommandoer i "Eksperiment Types" panel.
- Opret niveauer ved hjælp af "Database design panel". Tilføj nye niveauer ved hjælp af "niveau> Tilføj nyt niveau ..." kommando i "Database" menuen. Her skabe "Art" niveau, "Biologisk replikere" niveau "og" teknisk gentagelse "niveau, respektively.
- Import og forbehandling rå massespektrer
- Eksporter rå massespektre som .txt filer ved hjælp FlexAnalysis ved at klikke på "Export> Mass spektrum" kommando i menuen "Filer".
- Importer rå massespektre (.txt-filer) i databasen i niveauet for de tekniske gentagelser.
- Forbehandl rå massespektre.
- Import og Resample (ved hjælp af en kvadratisk fitting algoritme).
- Udfør en baseline subtraktion (med en rullende disk med en størrelse på 50 point).
- Beregn støj [Kontinuerlig Wavelet Transformation (CWT)], glat (Kaiser vindue med et vindue størrelse på 20 point og beta af 10 point), og udføre en anden baseline subtraktion (rullende disk med størrelse på 200 point).
- Detect toppe [CWT med et minimum signal støjforhold (S: N) 10].
- Efter forbehandling, spare karakteristiske mønstre af hver massespektrum, såsom peak lister med topstørrelser, topintensiteter, S: N, etc., i databasen.
- Oprettelse sammensatte massespektre
- Opret sammensatte spektre fra forbehandlede spektre ved hjælp af "Opsummer ..." kommando i "Analyse" -menuen. Vælg "Biologisk replikere" som målniveau.
- Her kombinere massespektre 10 tekniske replikater af samme koloni til opnåelse af et sammensat massespektrum for denne koloni, hvilket resulterer i tre sammensatte massespektre for at isolere på "Biologisk replikat" niveau.
- Her opsummere de tre sammensatte spektre til at skabe en sammensat frekvenser til at isolere på niveauet "Art".
Bemærk: Den sammensatte spektrum er det punkt-for-punkt gennemsnit af de tekniske replikater. Gentagelser med en lighed (Pearson korrelation) til gennemsnittet af mindre end 95% (standardindstilling) er udelukket fra komposit. Peaks på sammensatte spektre kun kaldes, hvis de er til stede i 75% (standardindstilling) af de inkluderede gentagelser. For de biologiske replikater disse indstillinger var 90 og 60% henholdsvis.
4. Massespektrum Dataanalyse
- Vælg de poster i databasen og skabe en sammenligning ved at klikke på "Opret ny sammenligning" kommando i "Sammenligninger" panel.
- Her skal du bruge massespektre ved "teknisk replikat" og / eller "biologisk replikat" niveauer for at vise sammenligninger og analyser.
- Lighed baseret cluster analyse og multi-dimensional skalering (MDS)
- Opret grupper med farver. Vælg tre biologiske sammensatte massespektre og klik på "Opret ny gruppe fra valg" kommando i "grupper" menu til at oprette en gruppe for den tilsvarende isolat. Udpeg en farve automatisk brugt til disse tre massespektre.
- Alternativt definerer marken stater med tilsvarende farver ved hjælp af kommandoerne i "Database poster "panel, således at enhver sammenslutning baseret på dette definerede felt bruger den samme farve defineret for denne gruppe.
- Udfør klyngeanalyse. Klik på "Beregn klyngeanalyse" kommandoen i "klynger" menuen. Vælge "Pearson korrelation" på sammenligningen indstillinger Side 1, og lade andre parametre som standard. På side 2 skal du vælge "UPGMA",. Klik derefter på "Finish".
- Få en MDS plot ved hjælp af "Multi-dimensional skalering ..." kommando i "Statistics" menuen.
- Peak matching
- Klik på spektret type "Maldi" i "Eksperimenter" panel. Vælg derefter "Layout> Vis billede". Spektre er vist som gel bands.
- Udfør peak matching ved hjælp af "Do peak matching" kommandoen i "Spectra" menuen.
- Identifikation af peak klasser
- Udfør principal komponent analyse (PCA). Fremhæv "Maldi "eksperiment type i" Experimental "panel og bruge" hovedkomponenter Analyse ... "kommando i" statistiske "menu til PCA.
- Udfør to-vejs klyngedannelse. Klik på "Statistik> Matrix minedrift" ... i "Sammenligning" vinduet. Intensiteten af toppene matchet til peak klasser er repræsenteret ved hjælp af forskellige farver (varme kort).
5. Bakterier Identifikation med en brugerdefineret database
- Ligheden koefficient-baserede metode
- Opret en sammenligning og generere en dendrogram baseret på massespektre ved "teknisk replikat" niveau som beskrevet i trin 4.3.3. Gem dendrogram til sammenligning af lighed.
- Vælg en ukendt massespektrum, og klik på "Analyse> Identificer udvalgte poster". Identifikationen vises dialogboksen.
- Vælg "Sammenligning baserede" klassificeringen type (eller en gemt classifIER) og klik på "næste". På næste side skal du vælge den gemte dendrogram som reference sammenligning og klik derefter på "Næste".
- Vælg "Basic lighed" som identifikationsmetode og klik derefter på "Næste".
- Vælg "Maximum lighed" som helt metode. Indtast relevante tærskelværdier og mindste forskel værdier for hver parameter, og klik derefter på "Næste".
- Når beregningerne er afsluttet, vises vinduet identifikation. I "Results" panel, er medlemmerne af databasen, der bedst matcher det ukendte opført.
- Gem identifikation projektet og validere identifikationen ved hjælp af "analyse krydsvalidering" kommando i "Identification projektet" panel.
- Potentielle biomarkør-baserede metode
- Definer peak klasser. I "Matrix Mining" vinduet, skal du vælge sæt toppe med fælles karakteristika og definere disse toppe som speciFIC peak klasser (potentielle biomarkører) ved hjælp af "Spectra> Administrer peak klasse typer ..." i "Sammenligning vindue".
- Her definerer peak klasser specifikke for hvert isolat for alle de 15 isolater.
- Vælg massespektre ubekendte og matche toppene af disse spektre til de definerede peak klasser som tidligere beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Databaserne bygget i denne demonstration havde fire niveauer, fra højeste til laveste niveau, herunder "alle niveauer", "Art", "Biologisk replikere" og "Teknisk gentagelse", (figur 1A). Den "teknisk replikere" niveau indeholdt alle de forbehandlede spektre af tekniske gentagelser. Den "Biologisk replikere" og "sort" niveauer indeholdt sammensatte (resumé) spektre. "Alle niveauer" indeholdt alle de tekniske replikere spektre samt alle de sammensatte spektre.
Spectrum sammendrag procedurer er vist i figur 1 under anvendelse af repræsentative toppe. Hvert medlem massespektrum vises som en tynd grå linje. Den sammensatte spektrum er repræsenteret som en linie farvet røde. Tilstødende toppe er markeret med en anden farve for at tillade lettere visuel inspektion (figur 1B).
tabel 1. Den højeste reproducerbarhed var 98,0 ± 1,4 for Bacillus arter B, og den laveste reproducerbarhed var 89,4 ± 7,8 for Curvibacter arter (tabel 1).
Cluster analyse på biologiske replikat niveau fremmes visualisering af den hierarkiske struktur i de komplekse massespektre data. Som vist i figur 2, biologiske replikater grupperet sammen, og 15 arter af bakterier dannede 15 klynger. Nært beslægtede arter, for eksempel B. sp. A, B, D og E, tendens til at klynge sammen. Imidlertid outliers for eksempel B. sp. C og F, blev også observeret. MDS plots baseret på massespektre på "Tekniske og biologiske" niveauer er vist i figur 3. MDS ppartier gav en klar, 3-D visualisering af lighederne mellem spektre af disse bakterier. Både tekniske gentagelser og biologiske replikater viste en lignende gruppe (Figur 3 A og B).
Peak matching blev anvendt til at skelne mellem sæt af toppe i massespektret. Peak matchende parametre, herunder konstant tolerance (punkter på x-aksen), lineær tolerance (ppm) og peak opdagelse sats skal angives af brugeren. Konstant tolerance og lineær tolerance er de faktorer, der anvendes til at beregne positionen tolerance af toppene ved hjælp af ligningen: position tolerance = konstant tolerance + lineær tolerance × m / z. Med stigende m / z, betydningen af konstant tolerance mindskes. Peak opdagelse sats betyder, at kun hvis en top findes på denne position i mere end den definerede hastighed af spektrene er en top klasse foretaget. En top på en eller flere mønstre repræsenterer en top klasse. For eksempel, hvis topdetektion rate EQUAls 10%, kan en top klasse kun ske, hvis mere end 10% af spektrene har toppe ved positionen. Dette udelukker lav prævalens toppe (som regel støjhændelser) i et sæt med tekniske gentagelser. Hvis apparatet er baseret på det sammensatte spektre af biologiske replikater, kan dette nummer skal være lavere, da lav prævalens toppe allerede er blevet filtreret ud under oprettelsen af den sammensatte spektre. I denne demonstration blev peak matching udført under anvendelse massespektre ved "teknisk replikat" niveau, og værdierne af disse parametre var 1,9, 550 og 10% hhv. Baseret på udvalgte parametre, blev toppe betragtet som matcher eller ikke matcher, hvilket resulterer i forskellige peak grupper. Et eksempel på peak matchende resultater er vist i figur 4 ved hjælp af 30 gentagelser af et enkelt isolat (Bacillus arter A). De matchende resultater blev visualiseret som en tabel, hvor de rå intensiteter er til stede som farver. Blå angiver lav intensitet og rød indikerer høj intensity. Baseret på peak matchende resultater, kan brugerne definere peak klasser som letter opfølgning analyser.
Både principal komponent analyse (PCA) (Supplerende figur 1) og to-vejs klyngedannelse kan anvendes til at analysere komplekse peak klasser. Et repræsentativt tovejs clustering resultat med massespektre på "teknisk replikat" niveau er vist i figur 5. To dendrograms er vist. Den ene er ved siden af m / z-værdier og den anden er over bakterier poster (figur 5). Peak intensitet var repræsenteret ved farver, hvor grøn angiver lav intensitet og rød indikerer høj intensitet. For eksempel B. sp. A og F deler meget få peak klasser med B. sp. B og D (figur 5). En nærmere undersøgelse viste, at B. sp. B og D har også sæt af artsspecifikke peak klasser (figur 5). Disse resultater indikerer, at specifikke peak sæt dele cert ain egenskaber kan defineres som arter niveau potentielle biomarkører. For eksempel tretten peak sæt tilhører B. sp. D blev udvalgt og defineret som peak klasser (potentielle biomarkører) af B. sp. D, herunder 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, og 7849,1 (Tabel 2). Peak klasser af forskellige isolater kan vises i forskellige farver (Supplerende figur 2). Peak klasser specifikke for hvert isolat blev tabuleret i tabel 2. Definerede peak klasser blev yderligere manuelt kontrolleres for at sikre, at de optrådte i alle tekniske replikater med et minimum intensitet på 100 au Desuden kan delmængder af peak klasser også lagres at lette karakterisering af bakterier på underarter og / eller stamme niveauer, for eksempel, at skelne patogene stammer fra ikke-patogene stammer og / eller at undersøge antibiotikaresistens / følsomhed.
ent "> Med hensyn til identifikation, blev massespektre af blinde-kodede isolater indsamlet og forbehandles på samme måde som reference massespektre i databaserne. Til identifikation baseret på sammenligning af lighed koefficienter blev parameterværdier er angivet, herunder den maksimale lighed på 95,0%, og den gennemsnitlige lighed på 87%. Minimum lighed ikke er angivet (dvs. ikke gøres noget). De mindste forskel værdierne blev sat som 5 for både den maksimale lighed og gennemsnitlig lighed. muligvis optimeres yderligere for at øge Disse værdier satsen for korrekt identifikation. Figur 6 viser identifikation resultater baseret på sammenligninger af lighed koefficienter (figur 6). Den matchende resultat foreslået, at denne blinde-kodede bakterie var sandsynligvis B. sp. A. Denne identifikation projekt baseret på en sammenligning af lighed koefficient blev yderligere bekræftet af krydsvalidering (Supplerende figur 3 (Supplerende figur 3). Interessant, krydsvalidering til identifikation projekter baseret på en sammenligning af peak klasser er meget hurtigere end dem, baseret på en sammenligning af lighed koefficient.Identifikation kan også udfyldes på grundlag af top klasse matching (Supplerende figur 4). Men fejlparringer af toppe blev observeret (Supplerende figur 4). De fejlparringer kan skyldes en masseskift følge af aminosyreudskiftninger i de respektive proteiner. Toppene ikke bliver matchet kunne også være toppe, som ikke er diskriminerende på artsniveau, men er specifikke for denne stamme eller isolere. Tilsammen our resultater tyder på, at begge identifikationsmetoder - lighed koefficient og biomarkør-baserede - let kan identificere bakterier på artsniveau fra karstic miljøer ved hjælp af prøveforberedelse, erhvervelse spektrum, og dataanalyse arbejdsgang beskrives her.
Figur 1. Database konstruktion og massespektre sammendrag Struktur af databaser bygget i denne demonstration (A).; Illustration af top sammendrag hjælp toppe fra 10 tekniske gentagelser af Aminobacter arter A (B).
Figur 2. dendrogram af det sammensattemassespektre på den biologiske replikere niveau. Datasættet indeholder spektre af 15 forskellige arter med tre sammensatte spektre for hver art. Hver art er kodet med en farve.
Figur 3. Multi-dimensional skalering (MDS) repræsentationer af massespektre på det tekniske replikere niveau med 30 spektre for hver art (A) og biologisk replikere niveau med tre sammensatte spektre for hver art (B). Farver blev kodet som de samme farver som anvendt i figur 2.
Figur 4. En illustration af top matchende bord. Tabel blev genereret ud fra masse spektre af Bacillus arter A på teknisk replikat level. Værdierne af peak matchende parametre var 1,9 for konstant tolerance, 550 for lineær tolerance og 10% for peak opdagelse sats hhv. Blå angiver lav peak intensitet og rød indikerer høj peak intensitet. Venligst klik her for at se en større udgave af figuren.
Figur 5. En illustration af to-vejs klyngedannelse. Figur blev genereret ved anvendelse massespektre på teknisk replikat niveau. Colors of isolater blev kodet som de samme farver som anvendt i figur 2. Peak intensitet er repræsenteret af farver, grøn betydning lav intensitet og rød betydning høj intensitet. Venligst klik her for at se en større udgave af figuren.
Figur 6. Bakterie identifikation baseret på sammenligning af lighed koefficient hjælp brugerdefinerede database.
| ID a | Kilde | Nærmeste relative b / Række / klasse | Tiltrædelse # (nærmeste slægtning b) | % Lighed | BioNumerics nøgle | Reproducerbarhed (%) |
| D2 | Tør speleothem | Bacillus sp. E-257 / Firmicutes | FJ764776.1 | 98,8 | Bacillus-arter A | 94,9 ± 4,0 |
| D7 | Tør speleothem | Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes | FJ348039.1 | 99,0 | Bacillus-arter B | 98,0 ± 1,4 |
| F1 | Flow sten | Bacillus niacin stamme M27 / Firmicutes | KC315764.1 | 99,2 | Bacillus-arter C | 96,5 ± 2,4 |
| F4 | Flow sten | Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes | FJ348046.1 | 99,1 | Bacillus-arter D | 89.8 ± 8.8 |
| F9 | Flow sten | Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes | EU124558.1 | 99,4 | Bacillus-arter E | 96,5 ± 1,9 |
| R10 | Stalactite drop | Bacillus sp. K1 / Firmicutes | GU968734.1 99,8 | Bacillus-arter F | 95.4 ± 3.9 | |
| D11 | Tør speleothem | Brevibacillus brevis-stammen IMAU80218 / Firmicutes | GU125635.1 | 99,5 | Brevibacillus arter | 94.3 ± 5.8 |
| F14 | Flow sten | Exiguobacterium sp. ZWU0009 / Firmicutes | JX292087.1 | 99,3 | Exiguobacterium arter | 96,5 ± 2,5 |
| M7 | Fugtig speleothem | Brevibacterium sp. N78 / Aktinobakterier | HQ188605 | 97.6 | Brevibacterium arter A | 97,5 ± 2,0 |
| M14 | Fugtig speleothem | Kocuria rhizophila stammen Ag09 / Aktinobakterier | EU554435.1 | 100 | Kocuria arter | 95,2 ± 4,1 |
| M15 | Fugtig speleothem | Brevibacterium sp. MN3-3 / Aktinobakterier | JQ396535.1 | 99,5 | Brevibacterium arter B | 92,1 ± 4,9 |
| R4 | Stalactite drop | Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria | FJ711220.1 | 99,9 | Aminobacter arter A | 95.4 ± 2.7 |
| F5 | Flow sten | Comamonas testosteroni stamme NBRC 12047 / β-Proteobacteria | AB680219 | 100 | Comamonas arter | 96,4 ± 2,6 |
| R8 | Stalactite drop | Curvibacter sarte / β-Proteobacteria | AB680705 | 97.0 | Curvibacter </ em> arter | 89.4 ± 7.8 |
| F8 | Flow sten | Moraxella sp. 19,2 KSS / γ-Proteobacteria | HE575924.1 | 99,9 | Moraxella arter | 92.6 ± 4.9 |
en bakterie blev isoleret fra Kartchner Caverns, AZ, USA og identificeret ved hjælp af 16S rDNA sekventering. To primere, 27F (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') og 1492r (5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'), blev anvendt til opnåelse af næsten 1.400 bp længde 16S rRNA gensekvenser.
B baseret på en BLAST søgning i NCBI-databasen.
c Værdier indberettede de gennemsnitlige korrelationskoefficienter på 30 gentagelser (tre biologiske gentagelser med hver 10 tekniske gentagelser) ± én standardafvigelse.
Tabel 1. Bakterier isolater anvendes i demonstration.
| BioNumerics nøgle | Peak klasser / potentielle biomarkører (DA) |
| Bacillus-arter A | 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3 |
| Bacillus-arter B | 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2 |
| Bacillus-arter C | 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3 |
| Bacillus-arter D | 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1 |
| Bacillus-arter E | 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2 |
| Bacillus-arter F | 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9 |
| Brevibacillus arter | 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2 |
| Exiguobacterium arter | 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2 |
| Brevibacterium arter A | 3053,3, 6104,8, 6146,5 |
| Kocuria arter | 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7 |
| Brevibacterium arter B | 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3 |
| Aminobacter arter A | 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4 |
| Comamonas arter | 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6 |
| Curvibacter arter | 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7 |
| Moraxella arter | 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6 |
Tabel 2. Peak klasser (potentielle biomarkører) (DA), der er defineret for hver art.
Supplerende Figur 1. Princip komponent analyse (PCA) i massespektret ved the teknisk replikat niveau (A) og den maksimale klasser (B). Farver blev kodet som de samme farver, som anvendes i figur 2.
Supplerende Figur 2. En illustration af peak klasser udvalgt på grundlag af to-vejs klyngedannelse. Peak klasser med samme etiket er farvet med samme farve.
Supplerende Figur 3. krydsvalidering projektets resultater identifikation baseret på brugerdefinerede databaser i BioNumerics.
Supplerende Figur 4. Bakterie identifikation baseret på topsammenligning hjælp brugerdefinerede databaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne demonstration viste detaljerede procedurer for karakterisering og identifikation af bakterier ved hjælp af MALDI-TOF MS og en brugerdefineret database. I sammenligning med traditionelle molekylære fremgangsmåder, for eksempel, 16S rDNA-sekventering, MALDI-TOF MS-baserede fingeraftryks metoder fremme en mere hurtig identifikation af forskellige bakterier. På grund af dets robusthed, er denne teknik i vid udstrækning anvendes til at karakterisere bakterier, vira, svampe og gær fra miljøet og i kliniske indstillinger 1,14-16. Desuden har MALDI-TOF MS blevet rapporteret at give, i nogle tilfælde højere taksonomiske opløsning 1. For eksempel B. sp. A, B, D og E, selvom tendens til at klynge sammen (figur 2), var klart adskilt, og ligheden mellem spektre af forskellige B. sp. var mindre end 80% (figur 2). I modsætning hertil 16S rDNA sekvenser af disse isolater havde stor lighed, som ikke kunne anvendes til at skelne disse isolaterpå artsniveau. De 16S rDNA sekvenser af B. sp. B og D har 99% lighed baseret på flere analyser tilpasning, mens sekvenserne af B. sp. A og E viser 95% og 96% lighed henholdsvis sekvenserne af B. sp. B og D. Outliers blev også observeret. For eksempel B. sp. C og F grupperet væk fra andre B. sp. (Figur 2). Fremkomsten af outlier isolater viser, at klyngedannelse analyse af massespektre ikke nødvendigvis etablere fylogenetiske relationer. Det miljø, isolerer blev opnået kan også påvirke massespektrer klyngedannelse. For eksempel Brevibacterium arter B og Kocuria arter, der var isoleret fra fugtig speleothem og B. sp. F, som blev isoleret fra stalactite drop tendens til at klynge sammen (tabel 1, figur 2), men yderligere forskning er nødvendig for at undersøge, om dette er observeret i en større samling af isolAtes.
Dette bibliotek-baserede teknik har også nogle begrænsninger. Karakterisering er normalt baseret på databaser. Aktuelle kommercielle databaser hovedsagelig består af bakteriestammer, især patogene dem. Disse kommercielle databaser er mest nyttige i klinisk mikrobiologi lab indstillinger. For at karakterisere miljømæssige isolater samt vira, svampe og gær, skal konstrueres ved anvendelse af store strain samlinger brugerdefinerede databaser. De parametre, der anvendes i de opfølgende analyser kan også være nødvendigt at være optimeret til at øge den taksonomiske opløsning, særligt ved de underarter og stamme niveauer. For eksempel S: N anvendes til topdetektion i denne demonstration var 10. Denne værdi er passende til identifikation artsniveau, men for stamme identifikation, kan denne værdi skal sænkes. Da disse behandlinger parametre samt databehandling arbejdsgange undertiden brugerdefineret i mange softwarepakker, f.eks ClinProTools og BionumeRICS, vil en optimering af parameterværdier og udvælgelse af passende arbejdsprocesser sandsynligvis være nødvendigt at optimere dataanalyse. I denne demonstration peak matchende parametre brugt tærskelværdier i identifikation projektet og krydsvalidering alle nødvendige optimering for at forbedre korrekt identifikation satser. For at finde en fremgangsmåde og / eller fremgangsmåde til at optimere disse parametre er af stor interesse for vores laboratorium. For eksempel kunne den ene fremgangsmåde involverer statistisk faktorforsøg, som vi anvendte nylig at optimere MALDI-TOF automatiseret dataopsamling 17. Yderligere fremtidige anvendelser og forbedring af MALDI-TOF MS-baserede mikrobiel fingeraftryk omfatter opførelse af bredt tilgængelige, større databaser over miljømæssige bakterier og / eller ikke-bakterielle mikroorganismer samt karakterisering af blandede kulturer 18 og mikrobielle samfund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
- Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
- Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
- Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
- Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
- Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
- Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
- Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
- Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
- Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
- Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
- Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
- Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
- Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
- Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
