Protocol
Dikkat: Herhangi bir ortamdan kimliği belirsiz bakteriler patojenik olabilir ve uygun biyogüvenlik protokollerini kullanarak dikkatle ele alınması gerekir. Canlı kültürlerle çalışmak Biyolojik Güvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) prosedürler kullanılarak Sınıf II biyogüvenlik kabini yapılmalıdır. BSL-2 prosedürleri hakkında daha fazla bilgi sayfaları 33-38 "Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlar, Biyogüvenlik" CDC / NIH başlıklı el kitabında, mevcuttur. Belge online kullanılabilir http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Laboratuar kat / önlük, gözlük, ve nitril veya lateks eldiven dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE), giyilmelidir. Standart mikrobiyolojik uygulamalar ve önlemler takip edilmelidir, ve biyolojik tehlikeli atıklar uygun atılmalıdır.
Bu tasvirde kullanılan bakteriler Kartchner Caverns izole edilmiştir,AZ, ABD, kuru speleothem, akış taş, nemli speleothem ve sarkıt damla (Tablo 1) olmak üzere dört ortamlarda, gelen. Tüm izolatlar 16S rDNA sekanslama ile tanımlanır ve% 25 gliserol-R2 B ortamında -80 ° C 'de muhafaza edilmiştir. Bütün deneyler, oda sıcaklığında tamamlanmıştır.
Not: Biz veritabanı inşaat ve bilinmeyenler kütle spektrumları için kütle spektrumları elde etmek aynı numune hazırlama yöntemi kullanmanızı öneririz. Numune hazırlama yöntemi, spektrum kalitesi ve tekrarlanabilirlik 3 etkiler, daha önce gösterilmiştir. Farklı bir örnek hazırlama yöntemi kullanılarak istenen (soy düzeyinde, örneğin,) bilinmeyenler yanlış kimlik, özellikle yüksek taksonomik çözünürlük neden olabilir.
MALDI Hedef 1. Biriktirme
Dikkat: Birçok protokol protein ekstreleri guid uygun olarak kullanılabilir olması gerekir asitler ve organik çözücülerin kullanımını gerektirmez elde etmek üzerekendi Malzemeler Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) yer alan rehber ilkeleriniz ve bilgi. Uygun KKD giyilmelidir ve kullanılan kimyasalların türüne ve hacmine bağlı olarak değişiklik olacaktır (örn, asetonitril gibi zehirli, yanıcı solventler önemli miktarlarda, çalışırken / önlük, eldiven, koruyucu gözlük ve solunum koruma kullanılması gerekir laboratuvar mont, ve formik ve triflüoroasetik asitler gibi aşındırıcı asitler).
- Paslanmaz çelik MALDI hedef plaka üzerine ve kurumasına izin (uygun, daha önce açıklanan protokolleri 11-13 kullanılarak elde edilen) hiçbir canlı hücreleri içeren protein ekstresi ul Mevduat 1. 1 ul matris solüsyonuna (α-siyano-4-hidroksi-sinnamik asit çözeltisi) ile kurutuldu, bir protein ekstresi Yerleşimi ve kurutun.
- Her biyolojik tekrarında için, teknik çoğaltır (5 ila 20 teknik çoğaltır) uygun sayıda nokta. Burada, her bir biyolojik tekrarında için 10 teknik çoğaltır ve 3 biyolojik çoğaltır w noktaere hazırladı.
Not: Protein ekstraksiyon numune hazırlama yöntemi kullanırken bir cilalı MALDI çelik hedef plaka kullanmanızı öneririz. Zemin çelik hedef plakaları kullanılarak yayılan ve bireysel örnek kuyuların dışında farklı örneklerinin kasıtsız karıştırma neden olabilir. - Depozito 1 ul kalibrant hedef plakası üzerine standart ve kurumaya bırakın. 1 ul matris çözümü ile Yerleşimi ve kurumaya bırakın.
- Bir negatif kontrol olarak, hedef plaka üzerinde birikmesine 2 ul matris çözeltisi.
2. Kütle Spektrumu Toplama
- Bir azot lazer (λ = 337 nm) ile donatılmış bir MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanarak ve Bruker FlexControl yazılımı kullanılarak işletilmektedir.
- 100 atış artışlarla 500 lazer çekim birikimi ile pozitif doğrusal modda her kitle spektrumu toplayın. 20 kV iyon kaynağı 1 gerilim ayarlayın; iyon kaynağı 2 gerilimi 18.15 kV; ve 9.05 kV objektif gerilimi. Bu parametreler enstrüman-spesifik olduğunu unutmayınve fic optimum sonuçlar elde etmek için, diğer araçlara ayarlama gerektirebilir.
- Şarj başına 2 ila 20 kDa gelen otomatik spektrum değerlendirilmesi için kütle-ücret aralığını ayarlayın. Sentroid pik algılama algoritması kullanın. 100 Da minimum çözünürlük eşiğini ayarlayın. 100 minimum yoğunluk eşiği ayarlayın 2 de eşik: gürültü oranı (N S) sinyali ayarlayın.
3. Veritabanı İnşaat
- Veritabanı tasarımı
- "Yeni veritabanı sihirbazını" kullanarak BioNumerics 7.1 yeni bir veritabanı oluşturun.
- "Deney Türleri" panelinde komutlarını kullanarak bir spektrum deney türü, örneğin, MALDI oluşturun.
- "Veritabanı tasarım paneli" kullanarak seviyeleri oluşturun. Kullanarak yeni seviyeleri ekle "Veritabanı" menüsünden komutu "Seviye> yeni bir seviyeye Ekle ...". Burada, "Türler" seviye "Biyolojik çoğaltmak" düzeyi "ve" Teknik çoğaltmak "seviye, respectiv oluşturmakely.
- İthalat ve ham kitle spektrumları önişleme
- "Dosya" menüsünden "Export> Kütle spektrumu" komutunu tıklayarak FlexAnalysis kullanarak txt dosyaları gibi ham kitle spektrumları verin.
- Teknik çoğaltır düzeyinde veritabanına ham kütle spektrumları (.txt dosyaları) İthalat.
- Ham kütle spektrumları preprocess.
- İthalat ve yeniden örnekleme (bir kuadratik uydurma algoritması kullanarak).
- (50 puan arasında bir boyutu olan bir dönme diski ile birlikte), bir taban çıkarır.
- (Bir pencere 20 puan büyüklüğü ve 10 puan beta Kaiser Pencere) gürültü [Sürekli Dalgacık Dönüşümü (CVVT)], pürüzsüz hesaplayınız, ve ikinci bir temel çıkarma (200 puan boyutu diski haddeleme) gerçekleştirin.
- [: 10 (N S) gürültü oranı minimum sinyal ile CWT] doruklarına algılar.
- Ön işleme sonra, böyle bir zirveye içeren pik listeleri gibi her kitle spektrum karakteristik desenler, kaydetmekboyutları, tepe yoğunlukları, S: veri tabanında bulunan, N, vb.
- Kompozit kitle spektrumları oluşturma
- "Analiz" menüsünden "... özetler" komutunu kullanarak ön işlenmiş spektrumları kompozit spektrumları oluşturun. Hedef seviye olarak "Biyolojik çoğaltmak" seçiniz.
- Burada, "Biyolojik çoğaltmak" düzeyde olduğu izolat için üç kompozit kütle spektrumları sonuçlanan, o koloni için bir kompozit kütle spektrumu elde etmek üzere aynı koloninin 10 teknik çoğaltır kütle spektrumları birleştirir.
- Burada, bu "Türler" düzeyinde izole için bir kompozit spektrumu oluşturmak için üç kompozit spektrumları özetler.
Not: Kompozit spektrum teknik çoğaltır noktası-by-noktaya ortalamasıdır. Daha düşük% 95 (varsayılan ayar) ortalama bir benzerlik (Pearson korelasyon) ile çoğaltır kompozit dışındadır. Bunlar (% 75 mevcutsa, bileşik spektrumları zirveleri sadece adlandırılırdahil çoğaltır varsayılan ayar). Biyolojik çoğaltır için, bu ayarlar sırasıyla, 90 ve% 60 idi.
4. Kütle Spektrumu Veri Analizi
- Veritabanında girdileri seçin ve "Karşılaştırmalar" panelinde "Yeni bir karşılaştırma oluştur" komutunu tıklayarak bir karşılaştırma oluşturmak.
- Burada, karşılaştırmalar ve analizler göstermek için "Teknik tekrarında" ve / veya "Biyolojik çoğaltmak" seviyelerde kütle spektrumları kullanın.
- Benzerlik tabanlı küme analizi ve çok boyutlu ölçekleme (MDS)
- Renklerle grupları oluşturun. Üç biyolojik kompozit kitle spektrumları seçin ve ilgili izolat için bir grup oluşturmak için "Gruplar" menüsünden komut "seçim Oluştur yeni grup" tıklayın. Otomatik olarak bu üç kütle spektrumları için kullanılan bir renk belirleyin.
- Alternatif olarak, komutları kullanarak gelen renkler ile saha durumlarını tanımlamak "Bu tanımlanmış alana dayalı herhangi bir gruplaşma, bu grup için belirlenmiş aynı renk kullanan şekilde Veritabanı girişleri "paneli.
- Küme analizi yapın. "Kümelenme" menüsünden "küme analizi Hesapla" komutunu tıklayın. Karşılaştırma ayarları Page 1 tarihinde, "Pearson korelasyon" seçin ve varsayılan olarak diğer parametreleri bırakın. 2. sayfada, "UPGMA" seçeneğini seçin. Ardından "Finish" tıklayınız.
- "İstatistik" menüsünde bir MDS kullanarak komplo "Çok boyutlu ölçekleme ..." komutunu edinin.
- Tepe eşleştirme
- "Deneyler" panelinde spektrum türü "Maldi" üzerine tıklayın. Ardından "Düzen> Show görüntü" seçeneğini seçin. Spectra jel bantlar olarak gösterilmektedir.
- "Spectra" menüsünden "zirve eşleştirme yapın" komutunu kullanarak pik eşleştirme gerçekleştirin.
- Pik sınıfların tanımlanması
- Temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin. Vurgulayın "Maldi Deneysel "deney tip" "paneli ve kullanımı" PCA gerçekleştirmek için İstatistiksel "menüsünden" komutu "Temel Bileşenler Analizi ....
- İki yönlü kümeleme gerçekleştirin. "Karşılaştırma" penceresinde "İstatistik> Matrix madencilik" ... tıklayınız. pik sınıflara eşleşen piklerin yoğunluğu farklı renkler (ısı haritası) kullanılarak temsil edilir.
Özel bir veritabanı ile 5. Bakteri Tanımlama
- Benzerlik katsayısı tabanlı yöntem
- Bir karşılaştırma oluşturun ve adım 4.3.3 açıklandığı gibi "Teknik çoğaltmak" düzeyinde kütle spektrumları dayalı bir dendrogram oluşturur. Benzerlik karşılaştırma için dendrogram kaydedin.
- "Seçili girdileri tanımlamak> Analizi" bilinmeyen bir kitle spektrumu seçin ve tıklatın. kimlik iletişim kutusu görüntülenir.
- "Karşılaştırma merkezli" sınıflandırıcı türü (veya depolanmış Klasmanı seçinier) ve "sonraki" butonuna tıklayınız. Bir sonraki sayfada, bir referans karşılaştırma olarak kaydedilir dendrogram seçin ve ardından "next" tıklayın.
- Bir tanımlama yöntemi olarak "Temel benzerlik" seçin ve sonra "next" butonuna tıklayınız.
- Skorlama yöntemi olarak "Maksimum benzerlik" seçiniz. Her parametre için uygun eşik değerleri ve minimum fark değerlerini yazın ve ardından "sonraki" butonuna tıklayınız.
- Hesaplamalar tamamlandıktan sonra, kimlik penceresi görüntülenir. "Sonuçlar" panelinde, iyi bilinmeyen maç veritabanının üyeleri listelenir.
- Kimlik Projeyi kaydedin ve "Kimlik projesi" panelinde "çapraz-doğrulama analizi" komutunu kullanarak kimlik doğrulamak.
- Potansiyel biyobelirtecin-tabanlı yöntem
- Pik sınıfları tanımlar. "Matrix Madencilik" penceresinde, ortak özelliklere paylaşan piklerin setleri seçmek ve speci olarak bu zirveleri tanımlamakfic zirve sınıfları (olası belirteçler) kullanarak "Spectra> zirve sınıf türleri ... Yönet" "Karşılaştırma penceresinde" de.
- Burada, 15 izolatın için izole her biri için özel zirve sınıfları tanımlar.
- Bilinmeyenlerin kütle spektrumları seçin ve daha önce tarif edildiği gibi tanımlanan tepe sınıflar bu spektrumları tepe eşleşir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu gösteriye inşa veritabanları "Türler", "Biyolojik tekrarında" ve "Teknik tekrarında", sırasıyla (Şekil 1A), olmak üzere "Tüm seviyeler" en yüksekten en düşük seviyesine dört düzeyleri, vardı. "Teknik tekrarlanan" düzey teknik çoğaltır tüm ön işlenmiş spektrumları içeriyordu. "Biyolojik tekrarlanan" ve "Türler" düzeyleri kompozit (özet) spektrumları içeriyordu. "Tüm seviyeler" tüm teknik çoğaltmak spektrumları yanı sıra tüm kompozit spektrumları içeriyordu.
Spektrum, özetleme işlemleri temsil eden tepe kullanılarak, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Her üye kütle spektrumu ince gri bir çizgi olarak görünür. bileşik spektrumu kırmızı renkli bir çizgi olarak gösterilmiştir. Bitişik zirveleri kolay görsel denetim (Şekil 1B) izin vermek, farklı bir renk ile işaretlenmiştir.
Tablo 1'de gösterilmiştir. En yüksek tekrarlanabilirlik Bacillus türleri B 98.0 ± 1.4 idi, ve en düşük tekrarlanabilirliği Curvibacter türleri (Tablo 1) 89.4 ± 7.8 idi.
Karmaşık kütle spektrumları verileri hiyerarşik yapının biyolojik tekrarlanan seviyesi kolaylaştırdı görselleştirme de küme analizi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, biyolojik çoğaltır gruplaşmıştır, ve bakteriler 15 türü 15 kümeleri oluşturmuştur. Yakından ilgili türleri, örneğin, B. sp. A, B, D ve E birlikte dönme eğiliminde olmuştur. Bununla birlikte, aşırı değerlerin, örneğin B. sp. C ve F, de gözlenmiştir. "Teknik ve Biyolojik" düzeyde kütle spektrumları dayalı MDS araziler Şekil 3. MDS p gösterilmiştirlotu bu bakteri spektrumları arasındaki benzerlikler açık, 3-D görselleştirme vermiştir. Hem teknik çoğaltır ve biyolojik çoğaltır benzer gruplandırma (Şekil 3 A ve B) gösterdi.
Tepe uygun kütle spektrumları piklerin kümelerini ayırmak için kullanıldı. Sabit hoşgörü (x-ekseni üzerinde puan), doğrusal tolerans (ppm) ve pik algılama hızı da dahil olmak üzere Zirve uygun parametreleri, kullanıcı tarafından belirlenen gerekir. M / z × pozisyon toleransı = sabit hoşgörü + lineer toleransı: Sabit hoşgörü ve tolerans lineer denklem kullanılarak piklerin pozisyonu toleransını hesaplamak için kullanılan faktörlerdir. Artan m / z, sürekli hoşgörü önemi azalır. Tepe bulma oranı doruk spektrumları tanımlanan orandan daha fazla bilgi için bu pozisyonda bulunduğunda sadece bir tepe sınıfı yapılmış olur. Bir veya daha fazla desen üzerinde bir tepe tepe sınıfını temsil eder. Örneğin, eğer zirve bulma oranı equaspektrumları% 10'dan daha fazla pozisyonunda tepe noktaları ise% 10 mi, bir tepe sınıfı yalnızca yapılabilir. Bu teknik çoğaltır ile bir dizi düşük yaygınlık zirveleri (genellikle gürültü zirveleri) dışlar. Set biyolojik çoğaltır kompozit spektrumları dayalı ise düşük yaygınlık zirveleri zaten kompozit spektrumları oluşturulması sırasında filtre edilmiş olarak, bu sayı daha düşük olması gerekebilir. Bu gösteri, tepe eşleştirme "Teknik çoğaltmak" düzeyinde kütle spektrumları kullanılarak yapıldı ve bu parametrelerin değerleri sırasıyla, 1.9, 550 ve% 10 idi. Seçilen parametrelere dayalı olarak, tepe farklı pik gruplarında elde edilen, eşleşen ya da uygun olmayan şekilde kabul edilmiştir. Tepe uygun sonuçlarının bir örneği, bir tek izolatı 30 çoğaltır (Bacillus türleri A) ile Şekil 4 'de gösterilmiştir. uygun sonuçlar ham yoğunlukları renk olarak mevcut olan bir tablo olarak görselleştirilmiştir. Mavi düşük yoğunluğunu gösteren ve kırmızı yüksek i gösterirntensity. Tepe eşleştirme sonuçlarına dayanarak, kullanıcıların takip analizleri kolaylaştırmak tepe sınıfları tanımlayabilirsiniz.
Her iki temel bileşen analizi (PCA) (Ek Şekil 1) ve iki yönlü kümeleme karmaşık pik sınıfları analiz etmek için kullanılabilir. "Teknik tekrarlanan" düzeyinde kütle spektrumları kullanılarak bir temsilci iki yönlü kümeleme sonucu Şekil 5'te gösterilmiştir. İki dendrogramlar gösterilir. Bir m / z değerleri yanında ve diğer bakteri girişleri üzerinde (Şekil 5). Tepe yoğunluğu yeşil düşük yoğunluğunu gösterir ve kırmızı yüksek yoğunluğunu gösterir renkler ile temsil edildi. Örneğin, B sp. A ve F B sp ile çok az pik sınıfları paylaşıyoruz. B ve D (Şekil 5). Yakın muayene B. sp olduğunu gösterdi. B ve D, aynı zamanda, türe spesifik piklerin sınıflarına (Şekil 5) kümelerini sahiptir. Bu sonuçlar, spesifik piklerin setleri sertifika dövme göstermektedir ain özellikleri türler düzeyinde potansiyel biyolojik belirteçler olarak tanımlanabilir. Örneğin, on üç tepe setleri B. sp ait. D seçilebilir ve B. sp zirve sınıfları (olası belirteçler) olarak tanımlandı. (Tablo 2), 3420,8, 2894,9, 2152,5 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1 ve 7849,1 dahil olmak üzere D. Farklı izolatların Tepe sınıfları farklı renklerde (Ek Şekil 2) gösterilebilir. Her biri için özel sınıflar Tepe Tablo 2'de izolatın. Tanımlı tepe sınıfları daha ileri manuel onlar Ayrıca 100 au minimum yoğunluğu ile tüm teknik çoğaltır çıktı emin olmak için kontrol edildi, pik sınıfların alt kümeleri de bakteri karakterizasyonu kolaylaştırmak için depolanmış olabilir alttür ve / veya gerilme seviyelerinde, örneğin, patojenik olmayan suşlar patojenik suşları ayırt etmek için ve / veya antibiyotik direnci / duyarlılık incelemek.
kimlik ile ilgili olarak ent ">, kör kodlanmış izolatların kütle spektrumları toplandı ve veri tabanları referans kütle spektrumları olarak aynı şekilde ön-işlenmiş edildi. benzerlik katsayıları mukayesesine dayalı tanımlanması için parametre değerleri, maksimum benzerlik de dahil olmak üzere belirtilmiş Asgari benzerlik belirtilmedi 95.0 ve% 87% ortalama benzerlik de. (yani, kontrolsüz sol). Minimum fark değerleri maksimum benzerlik ve ortalama benzerlik hem de 5 olarak belirlenmiştir. Bu değerler daha da artması için optimize edilmesi gerekebilir Doğru tanımlama oranı. 6 Şekil benzerlik katsayıları (Şekil 6) karşılaştırmalar dayalı kimlik sonuçlarını gösterir. eşleştirme sonucu bu kör-kodlu bakteri büyük olasılıkla B. sp olduğunu ileri sürdü. A. Bu tanımlama projesi karşılaştırılmasına dayalı benzerlik katsayısı daha da çapraz doğrulama (Ek Şekil 3 tarafından doğrulandı (Ek Şekil 3) var. İlginçtir, pik sınıfların karşılaştırılmasına dayalı kimlik projeleri için çapraz doğrulama benzerlik katsayısı karşılaştırılmasına dayalı çok daha hızlıdır.Kimlik da zirve sınıf eşleştirme (Ek Şekil 4) dayalı tamamlanabilir. Piklerin uyumsuzluklar (Ek Şekil 4) gözlendi Ancak. uyumsuzlukları, ilgili proteinlerin amino asit değişimi elde edilen bir kütle kaymasına bağlı olabilir. değil eşleştiği zirveleri de tür düzeyinde ayırt edici değildir ama bu gerginlik özgüdür veya izole zirveleri olabilir. O, birlikte ele alındığındabenzerlik katsayısı ve biyolojik belirteç tabanlı - - hazır karstik numune hazırlama kullanarak ortamlarda, spektrum alımından tür düzeyinde bakterileri tespit edebilir ve veri analizi iş akışı burada anlatılan ur sonuçları hem tanımlama yöntemleri öneririz.
Şekil 1. Veritabanı inşaat ve kütle spektrumları özetleme Bu gösteri (A) inşa veritabanlarının yapısı.; Aminobacter türleri A (B) 10 teknik çoğaltır gelen doruklarına kullanarak pik özetleme İllüstrasyon.
Kompozitin Şekil 2 dendrogramBiyolojik tekrarlanan düzeyinde kütle spektrumları. veri seti, her tür için üç kompozit spektrumları ile 15 farklı türlerin spektrumları içerir. Her tür bir renkle kodlanmış.
Çok boyutlu ölçekleme (MDS) 30 Her tür için spektrumu (A) ve her tür için üç kompozit spektrumu (B) biyolojik çoğaltmak düzeyi ile teknik çoğaltmak seviyesinde kütle spektrumları temsilleri. Renkler aynı renklerde olarak kodlanmış 3. Şekil Şekil 2'de kullanıldığı haliyle.
Şekil 4. zirve eşleştirme tablosunun bir örneği. Tablo teknik çoğaltmak leve Bacillus türleri A kütle spektrumları dayalı üretildil. zirve uygun parametrelerin değerleri sırasıyla doğrusal hoşgörü için sürekli hoşgörü için 1.9, 550 ve pik algılama oranı% 10 idi. Mavi düşük pik yoğunluğunu gösterir ve kırmızı yüksek tepe yoğunluğunu gösterir. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 5. İki yönlü kümeleme bir örnek. Şekil teknik çoğaltmak seviyesinde kütle spektrumları kullanılarak oluşturulmuştur. Şekil 2'de kullanılan izolatların renkler aynı renkleri olarak kodlanmıştır. Tepe yoğunluğu renkleri, yeşil anlamı düşük yoğunluk ve kırmızı anlam yüksek yoğunlukta tarafından temsil edilmektedir. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Özel veritabanı kullanarak benzerlik katsayısı karşılaştırılmasına dayanan Şekil 6. Bakteri tanımlama.
| ID | Kaynak | En yakın akraba b / Filum / Sınıf | Katılım # (yakın akrabası b) | % Benzerlik | BioNumerics anahtarı | Tekrarlanabilirlik (%) |
| D2 | Kuru speleothem | Bacillus sp. E-257 / Firmicutes | FJ764776.1 | 98.8 | Bacillus türleri bir | 94.9 ± 4.0 |
| D7 | Kuru speleotkenar | Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes | FJ348039.1 | 99.0 | Bacillus türleri B | 98.0 ± 1.4 |
| F1 | Akış taş | Bacillus niasin M27 / Firmicutes zorlanma | KC315764.1 | 99.2 | Bacillus türleri C | 96.5 ± 2.4 |
| F4 | Akış taş | Bacillus sp. GGC'den P5A1 / Firmicutes | FJ348046.1 | 99.1 | Bacillus türleri D | 89.8 ± 8.8 |
| F9 | Akış taş | Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes | EU124558.1 | 99.4 | Bacillus türleri E | 96.5 ± 1.9 |
| R10 | Mukarnas damla | Bacillus sp. K1 / Firmicutes | GU968734.1 99.8 | Bacillus türleri F | 95.4 ± 3.9 | |
| D11 | Kuru speleothem | Brevibacillus brevis suşu IMAU80218 / Firmicutes | GU125635.1 | 99.5 | Brevibacillus türler | 94.3 ± 5.8 |
| F14 | Akış taş | Exiguobacterium sp. ZWU0009 / Firmicutes | JX292087.1 | 99.3 | Exiguobacterium türler | 96.5 ± 2.5 |
| M7 | Nemli speleothem | Brevibacterium sp. N78 / Actinobacteria'lar | HQ188605 | 97.6 | Brevibacterium türleri bir | 97.5 ± 2.0 |
| M14 | Nemli speleothem | Kocuria rhizophila suşu Ag09 / Actinobacteria'lar | EU554435.1 | 100 | Kocuria türleri | 95.2 ± 4.1 |
| M15 | Nemli speleothem | Brevibacterium sp. MN3-3 / Actinobacteria'lar | JQ396535.1 | 99.5 | Brevibacterium türleri B | 92.1 ± 4.9 |
| R4 | Mukarnas damla | Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria | FJ711220.1 | 99.9 | Türleri A Aminobacter | 95.4 ± 2.7 |
| F5 | Akış taş | Comamonas testosteroni suşu NBRC 12047 / β-Proteobacteria | AB680219 | 100 | Comamonas türleri | 96.4 ± 2.6 |
| R8 | Mukarnas damla | Curvibacter narin / β-Proteobacteria | AB680705 | 97.0 | Curvibacter </ Em> türler | 89.4 ± 7.8 |
| F8 | Akış taş | Moraxella sp. 19.2 KSS / γ-Proteobacteria | HE575924.1 | 99.9 | Moraxella türleri | 92.6 ± 4.9 |
bir bakteri Kartchner Caverns, AZ, ABD izole edilmiş ve 16S rDNA dizilemesi kullanılarak tespit edilmiştir. İki primer, 27f (5 'AGA GTT TGA TCC TGG AG CTC 3') ve 1492r (5 'TAC GGT CTT TAC GTT ACG ACT T 3'), yaklaşık 1400 bp uzunlukta 16S rRNA gen sekansları elde etmek için kullanılmıştır.
b NCBI veritabanının bir ŞOK arama dayanarak.
c bildirilen değerler bir standart sapma ± 30 çoğaltır (üç biyolojik çoğaltır 10 teknik çoğaltır her) ortalama korelasyon katsayıları vardır.
Tablo 1. Bakteriler gösteri kullanılır edilmemiştir.
| BioNumerics anahtarı | Tepe sınıfları / Potansiyel biyomarkerler (Da) |
| Bacillus türleri bir | 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3 |
| Bacillus türleri B | 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2 |
| Bacillus türleri C | 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3 |
| Bacillus türleri D | 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1 |
| Bacillus türleri E | 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2 |
| Bacillus türleri F | 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9 |
| Brevibacillus türler | 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2 |
| Exiguobacterium türler | 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2 |
| Brevibacterium türleri bir | 3053,3, 6104,8, 6146,5 |
| Kocuria türleri | 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7 |
| Brevibacterium türleri B | 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3 |
| Türleri A Aminobacter | 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4 |
| Comamonas türleri | 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6 |
| Curvibacter türler | 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7 |
| Moraxella türleri | 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6 |
Her tür için tanımlanmış Tablo 2. Tepe sınıfları (Potansiyel biyomarkerler) (Da).
Ek Şekil 1. inci kitle spektrumları İlke bileşen analizi (PCA)Şekil 2'de kullanılan e teknik çoğaltmak seviyesi (A) ve pik sınıfları (B). Renkler aynı renklerde olarak kodlanmıştır.
Ek Şekil 2. İki yönlü kümeleme dayalı seçilen tepe sınıfların bir örneği. Aynı etiketi olan Tepe sınıflar aynı renkte boyanmaktadır.
Ek Şekil BioNumerics özel veritabanları dayalı kimlik projesinin 3. Çapraz doğrulama sonuçları.
Özel veritabanları kullanılarak pik eşleştirme dayalı Ek Şekil 4. Bakteri tanımlama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu gösteri karakterizasyonu ve MALDI-TOF MS ve özel veritabanı kullanılarak bakterilerin tanımlanması detaylı prosedürler gösterdi. Örneğin, geleneksel moleküler yöntemler ile karşılaştırıldığında, 16S rDNA dizileme, MALDI-TOF MS tabanlı parmak yöntemleri, çeşitli bakterilerin daha hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Nedeniyle sağlamlığı nedeniyle bu teknik yaygın ortamdan ve klinik 1,14-16 bakteriler, virüsler, mantarlar ve maya karakterize etmek için kullanılır. Ayrıca, MALDI-TOF, MS, bazı durumlarda, daha yüksek bir taksonomik çözünürlüğü 1 elde bildirilmiştir. Örneğin, B sp. A, B, D ve E birlikte kümelenmeye (Şekil 2) eğilimi de, açık bir şekilde ayrılmış ve farklı B sp spektrumları arasındaki benzerlik. (Şekil 2)% 80'den az oldu. Buna karşılık, bu izolatların 16S rDNA sekansları, bu izolatı ayırt etmek için kullanılabilir olabilir yüksek benzerlik vardıtürler düzeyinde. B. sp 16S rDNA sekansları. B ve D, çoklu hizalama analizine dayalı% 99 oranında benzerliğe sahip B sp dizileri ise. A ve E B sp dizileri, sırasıyla,% 95 ve% 96 benzerlik gösterir. B ve D Aykırı de gözlenmiştir. Örneğin, B sp. C ve F uzak diğer B. sp gruplandırılmış. (Şekil 2). Aykırı izolatların görünümü kütle spektrumları kümeleme analizi mutlaka filogenetik ilişkiler kurmak olmadığını gösterir. izolatlardan ortamı da kütle spektrumları kümelenme etkileyebilir elde edilmiştir. Örneğin, Brevibacterium türleri B, nemli speleothem ve B sp izole edildi Kocuria türleri. Sarkıt damla izole edilmiş F birlikte (Tablo 1, Şekil 2) küme eğiliminde, ancak daha ileri araştırmalar bu isol büyük bir koleksiyon gözlenen olup olmadığını incelemek için gerekli olanates.
Bu kütüphane-tabanlı tekniği de bazı sınırlamalar vardır. Karakterizasyonu genellikle veritabanları dayanmaktadır. Mevcut ticari veritabanları özellikle bakteriyel suşlar, özellikle patojen olanlardan oluşur. Bu ticari veritabanları klinik mikrobiyoloji laboratuvar ortamlarında en yararlıdır. Çevre izolatları ve aynı zamanda virüslerin, mantar ve maya karakterize etmek için, özel veri tabanları büyük gerilme koleksiyonları kullanılarak inşa edilmesi gerekmektedir. takip analizlerde kullanılan parametreler de özellikle alttür ve gerilme seviyelerinde, taksonomik çözünürlüğü artırmak için optimize edilmesi gerekebilir. Örneğin, S: Bu gösteriye zirve tespiti için kullanılan N Bu değer tür düzeyinde tanımlanması için uygun olduğunu, ancak suş düzeyinde tanımlanması için, bu değer indirdi gerekebilir 10. oldu. Bu işlem parametreleri yanı sıra iş akışlarını işleme veri yana, bazen, örneğin, ClinProTools ve Bionume için, birçok yazılım paketleri kullanıcı tanımlı olankumaşlar-, parametre değerleri ve uygun iş akışlarının seçimi bir optimizasyon olasılıkla veri analizi optimize etmek için gerekli olacaktır. Bu gösteri, tepe uygun parametreleri, eşik değerleri tanımlama projede kullanılan ve çapraz doğrulama hepsi doğru tanımlama oranlarını artırmak için optimizasyon gerekli. Bu parametrelerini optimize etmek için bir yöntem ve / veya prosedürü bulmak için laboratuarımızda büyük ilgi olduğunu. Örneğin, bir yaklaşımı MALDI-TOF veri toplama 17 otomatik optimize etmek için son zamanlarda kullanılan istatistiksel faktöryel tasarım, gerektirebilir. Ek gelecek uygulamalar ve MALDI-TOF MS üzerinde tabanlı mikrobiyal parmak izi arttırılması yaygın olarak kullanılan inşaat çevre bakteriler ve / veya bakteriyel olmayan mikroorganizmaların yanı sıra karışık kültürler 18 ve mikrobiyal toplulukların karakterizasyonu büyük veri tabanları bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
- Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
- Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
- Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
- Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
- Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
- Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
- Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
- Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
- Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
- Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
- Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
- Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
- Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
- Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
