Protocol
Precaución: las bacterias no identificados de cualquier entorno pueden ser patógenos y deben ser manejados con precaución el uso de protocolos de bioseguridad adecuadas. Trabaja con cultivos vivos debe realizarse en una cabina de seguridad biológica Clase II utilizando procedimientos de seguridad biológica de nivel 2 (BSL-2). Más información acerca de BSL-2 procedimientos está disponible en el manual CDC / NIH titulado, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos", páginas 33-38. El documento está disponible en línea en http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Equipos de protección personal (PPE), incluyendo batas de laboratorio / batas, gafas de seguridad y guantes de nitrilo o látex, se debe usar. Prácticas y precauciones análisis microbiológico de base deben seguir, y residuos biológicos peligrosos deben desecharse adecuadamente.
Las bacterias utilizadas en esta demostración se aislaron de las Cavernas Kartchner,AZ, EE.UU., a partir de cuatro ambientes, incluyendo espeleotema seco, piedra flujo, espeleotemas húmedo y goteo estalactita (Tabla 1). Todos los aislamientos fueron identificados por secuenciación de 16S rDNA y se mantuvieron a -80 ° C en 25% de glicerol-R medio 2 B. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente.
Nota: Se recomienda utilizar el mismo método de preparación de muestras para adquirir espectros de masas para la construcción de bases de datos y los espectros de masas de incógnitas. Método de preparación de la muestra se ha demostrado previamente para afectar a la calidad del espectro y reproducibilidad 3. Utilizando un método de preparación de la muestra diferente puede causar una incorrecta identificación de incógnitas, especialmente cuando mayor resolución taxonómica (por ejemplo, a nivel de cepa) que se desea.
1. Deposición en el Target MALDI
Precaución: Varios protocolos para obtener extractos de proteínas requieren el uso de ácidos y disolventes orgánicos que deben utilizarse de acuerdo con GUIDElines y la información contenida en sus respectivas Hojas de Datos de Seguridad de Materiales (MSDS). Apropiada PPE debe usar y puede variar en función del tipo y volumen de los productos químicos utilizados (por ejemplo, batas de laboratorio / batas, guantes, gafas de seguridad y de protección respiratoria deben ser usados cuando se trabaja con cantidades significativas de disolventes inflamables, tóxicos, tales como acetonitrilo, y ácidos corrosivos, tales como ácidos fórmico y trifluoroacético).
- Depósito 1 l extracto de proteína que no contiene células viables (obtenidos mediante su caso, los protocolos descritos anteriormente 11-13) en una placa de MALDI objetivo acero inoxidable y permitir que se seque. Superposición del extracto de proteína seca con solución de matriz 1 l (α-ciano-4-hidroxi-cinámico solución de ácido), y deje que se seque.
- Para cada biológica replicar, detectar un número apropiado de repeticiones técnica (de 5 a 20 repeticiones técnicos). Aquí, detectar 10 repeticiones técnica para cada biológica replicar y 3 repeticiones biológica were preparado.
Nota: Se recomienda el uso de una placa de acero objetivo MALDI pulido cuando se utiliza el método de preparación de la muestra de extracción de proteínas. El uso de placas de puntería de acero de tierra puede causar la difusión y mezcla involuntaria de las diferentes muestras fuera de pocillos de muestras individuales. - Depósito 1 l estándar de calibrador en el plato blanco y deje que se seque. Superposición con solución de matriz 1 l y deje que se seque.
- Depósito de solución de matriz 2 l en la placa del objetivo como un control negativo.
2. Los espectros de masas Adquisición
- Utilice un espectrómetro de masas MALDI-TOF equipado con un láser de nitrógeno (λ = 337 nm) y operado utilizando software Bruker FlexControl.
- Recoge cada espectro de masas en modo lineal positiva por acumulación de 500 disparos de láser en incrementos de 100 tiro. Ajuste el voltaje de la fuente de iones de 1 a 20 kV; fuente de iones 2 voltaje a 18.15 kV; y la tensión de la lente a 9.05 kV. Tenga en cuenta que estos parámetros son instrumento específic y podría requerir un ajuste en otros instrumentos para obtener resultados óptimos.
- Ajuste el rango de masa-carga para la evaluación automatizada del espectro de 2 a 20 kDa por carga. Utilice el algoritmo de detección de pico centroide. Ajuste el umbral mínimo de resolución de 100 Da. Establecer la relación señal a ruido (S: N) umbral en 2. Establezca el umbral mínimo de intensidad a 100.
3. Base de datos de construcción
- Diseño de base de datos
- Crear una nueva base de datos en BioNumerics 7.1 utilizando el "Asistente para nueva base de datos".
- Cree un tipo de experimento espectro, por ejemplo, Maldi, mediante los comandos del "Tipos de experimentos" del panel.
- Crear los niveles utilizando el "panel de diseño de base de datos". Añadir nuevos niveles utilizando el "Nivel> Añadir nuevo nivel ..." comando en el menú "Base de datos". Aquí, crear "especies" de nivel, el nivel de "réplica biológica" "y" técnica de reproducir "nivel, respectively.
- Importación y procesamiento previo de los espectros de masa cruda
- Exportación de los espectros de masa cruda como archivos .txt utilizando FlexAnalysis haciendo clic en el "Exportar> Espectro de masas" comando en el menú "Archivo".
- Importar los espectros de masa cruda (archivos .txt) en la base de datos en el nivel de los técnicos repeticiones.
- Preproceso los espectros de masa cruda.
- Importación y volver a muestrear (utilizando un algoritmo de ajuste cuadrática).
- Realice una sustracción de línea de base (con un disco de rodadura con un tamaño de 50 puntos).
- Calcule el ruido [continua transformación Wavelet (CWT)], lisa (Kaiser ventana con un tamaño de ventana de 20 puntos y beta de 10 puntos), y llevar a cabo una segunda base de referencia resta (disco rodando con tamaño de 200 puntos).
- Detectar picos [CWT con un mínimo de señal a ruido (S: N) de 10].
- Después de preprocesamiento, guardar patrones característicos de cada espectro de masas, como las listas de pico que contienen picotamaños pico de intensidad, S: N, etc., en la base de datos.
- Creación de los espectros de masas de material compuesto
- Crear espectros compuesto a partir de espectros previamente con el comando "Resumir ..." en el menú "Análisis". Elija la opción "réplica biológica" como nivel objetivo.
- Aquí, se combinan los espectros de masas de 10 repeticiones técnica de la misma colonia para producir un espectro de masas de material compuesto para esa colonia, resultando en tres espectros de masas de material compuesto para que aíslan en el nivel "biológica replicar".
- Aquí, un resumen de los tres espectros compuesto para crear un espectro compuesto para que aíslan a nivel "Especies".
Nota: El espectro compuesto es el medio punto por punto de los técnicos repeticiones. Replica con una similitud (correlación de Pearson) con la media de inferior al 95% (ajuste predeterminado), se excluyen del compuesto. Picos en los espectros de material compuesto sólo se llaman si están presentes en el 75% (ajuste por defecto) de las réplicas incluidos. Para las réplicas biológicas, estos valores fueron 90 y 60%, respectivamente.
Análisis 4. Espectro de masas de datos
- Seleccione las entradas de la base de datos y crear una comparación haciendo clic en el comando "Crear nueva comparación" en el "comparaciones" del panel.
- En este caso, utilizar los espectros de masas en la "técnica de reproducir" y / o niveles "biológica replicar" para mostrar comparaciones y análisis.
- Análisis cluster basado en la similitud y escalamiento multidimensional (MDS)
- Crear grupos con colores. Seleccione los tres biológica espectros de masas compuesto y haga clic en "Crear nuevo grupo de selección" comando en el menú "Grupos" para crear un grupo para el aislamiento correspondiente. Designar un color que se utiliza automáticamente para estos tres espectros de masas.
- Alternativamente, definir estados de campo con los colores correspondientes utilizando los comandos en el "Base de datos de entradas del panel "de tal manera que cualquier agrupación basado en este campo definido utiliza el mismo color definido para este grupo.
- Realizar análisis de conglomerados. Haga clic en el comando "Calcular el análisis cluster" en el menú "Clustering". En la configuración de página de comparación 1, seleccione la "correlación de Pearson" y dejar otros parámetros por defecto. En la página 2, seleccione "UPGMA". Luego haga clic en "Finalizar".
- Obtener una parcela MDS usando el "escalamiento multidimensional ..." comando en el menú "Estadísticas".
- Juego Pico
- Haga clic en el tipo de espectro "Maldi" en el "experimentos" del panel. A continuación, seleccione "Diseño> Mostrar imagen". Los espectros se muestran como bandas de gel.
- Realizar juego pico con el comando "Haz coincidente pico" en el menú de "espectros".
- Identificación de clases de pico
- Realizar un análisis de componentes principales (PCA). Resalta el "Maldi "tipo de experimento en el" Experimental "panel y utilizar el" Análisis de Componentes Principales ... "comando en el menú" Estadística "para realizar PCA.
- Realizar bidireccional agrupación. Haga clic en el "Estadísticas> minería Matrix" ... en la ventana "Comparación". La intensidad de los picos adaptados a las clases de pico se representa usando diferentes colores (mapa de calor).
5. Las bacterias de identificación con una base de datos personalizada
- Método basado en el coeficiente de similitud
- Crear una comparación y generar un dendrograma basado en los espectros de masas a nivel de "réplica técnicos" como se describe en el paso 4.3.3. Guarde el dendrograma para la comparación de similitud.
- Seleccione un espectro de masa desconocida, y haga clic en el "Análisis> Identificar las entradas seleccionadas". Aparecerá el cuadro de diálogo de identificación.
- Seleccione el tipo de clasificador "en base de comparación" (o una classif almacenadaier) y haga clic en "Siguiente". En la página siguiente, elija el dendrograma guardado como una comparación de referencia y haga clic en "Siguiente".
- Elija la opción "similitud básica" como un método de identificación y luego haga clic en "Siguiente".
- Elija la opción "similitud máxima" como método de puntuación. Escriba los valores mínimos apropiados y valores mínimos de diferencia para cada parámetro y haga clic en "Siguiente".
- Una vez terminados los cálculos, aparecerá la ventana de identificación. En la "Resultados" del panel, se enumeran los miembros de la base de datos que mejor se adapten a lo desconocido.
- Guarde el proyecto de identificación y validación de la identificación mediante el comando "validación cruzada análisis" en el panel de "proyecto de identificación".
- Método basado en el potencial biomarcador
- Definir las clases altas. En la ventana "Matrix Minería", seleccionar conjuntos de picos que comparten características comunes y definir estos picos como especíclases pico fic (biomarcadores potenciales) utilizando "Espectros> Administrar tipos de clase pico ..." en la "ventana de comparación".
- Aquí, definir clases pico específicas para cada aislamiento para todos los 15 aislamientos.
- Seleccionar los espectros de masas de incógnitas y combinar los picos de estos espectros a las clases Pico definido como se describe anteriormente.
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Representative Results
Las bases de datos construidos en esta demostración tenían cuatro niveles, de mayor a menor nivel, incluyendo "Todos los niveles", "Especies", "réplica biológica" y "técnica de reproducir", respectivamente (Figura 1). La "técnica de reproducir" nivel contenía todos los espectros preprocesado de técnicos repeticiones. El "biológica replicar" y los niveles de "especies" contenían el compuesto (resumen) espectros. "Todos los niveles" contenían todos los espectros réplica técnica, así como todos los espectros compuesto.
Procedimientos de integración del espectro se muestran en la Figura 1, utilizando picos representativos. Cada espectro de masas miembro aparece como una línea gris delgada. El espectro compuesto se representa como una línea de color en rojo. Picos adyacentes están marcados con un color diferente para permitir la fácil inspección visual (Figura 1B).
la Tabla 1. La reproducibilidad más alta fue de 98,0 ± 1,4 para las especies de Bacillus B, y la más baja reproducibilidad fue 89,4 ± 7,8 para las especies Curvibacter (Tabla 1).
El análisis de conglomerados en la visualización de nivel biológica replicar facilitado de la estructura jerárquica en los datos de los espectros de masas complejas. Como se muestra en la Figura 2, réplicas biológicas agrupados juntos, y 15 especies de bacterias formaron 15 grupos. Las especies estrechamente relacionadas, por ejemplo, B. sp. A, B, D, y E, tendían a agruparse juntos. Sin embargo, los valores atípicos, por ejemplo, B. sp. C y F, también se observaron. Parcelas MDS basados en los espectros de masas en los niveles "técnicos y biológicos" se muestran en la Figura 3. MDS plotes arrojaron un claro, visualización 3-D de las similitudes entre los espectros de estas bacterias. Tanto repeticiones técnica y réplicas biológicas mostraron una agrupación similar (Figura 3 A y B).
Coincidente pico se utiliza para distinguir conjuntos de picos en los espectros de masas. Parámetros de adaptación de alta, incluyendo la tolerancia constante (puntos en el eje x), la tolerancia lineal (ppm) y la tasa de detección de pico necesitan ser especificado por el usuario. Tolerancia constante y la tolerancia lineal son los factores que se utilizan para calcular la tolerancia de posición de los picos utilizando la ecuación: tolerancia de posición = tolerancia constante + tolerancia lineal × m / z. Con el aumento de m / z, la importancia de la tolerancia constante disminuye. Tasa de detección de pico significa que sólo si se encuentra un pico en esa posición por más de la tasa definida de los espectros, se hace una clase de pico. Un pico en uno o más patrones representa una clase de pico. Por ejemplo, si la ecuación tasa de detección de picols 10%, una clase de pico sólo puede ser hecho si más del 10% de los espectros tiene picos en las posiciones. Esto excluye a los picos de prevalencia baja (generalmente picos de ruido) en un conjunto con técnicos repeticiones. Si el conjunto se basa en los espectros de material compuesto de réplicas biológicas, este número puede ser más baja como picos de baja prevalencia ya han sido filtrados a cabo durante la creación de los espectros de compuesto. En esta demostración, se realizó a juego pico usando espectros de masas a nivel de "réplica técnicos" y los valores de estos parámetros fueron 1.9, 550 y 10%, respectivamente. Sobre la base de los parámetros seleccionados, los picos se consideraron como juego o no juego, dando lugar a diferentes grupos pico. Un ejemplo de los resultados que coinciden con los picos se muestra en la Figura 4 usando 30 repeticiones de un solo aislado de especies de Bacillus (A). Los resultados coincidentes se visualizaron como una tabla en la que las intensidades primas están presentes como colores. El color azul indica baja intensidad y de color rojo indica alta intensity. Basándose en los resultados de pico características determinadas, los usuarios pueden definir clases pico que facilitar el análisis de seguimiento.
Tanto el análisis de componentes principales (PCA) (Figura 1) y de dos vías de la agrupación puede ser utilizado para analizar las clases de pico complejos. Un representante agrupación resultado de dos vías usando espectros de masas a nivel de "réplica Técnica" se muestra en la Figura 5. Dos dendrogramas se muestran. Se encuentra junto a los valores de m / z y la otra es por encima de las entradas de bacterias (Figura 5). La intensidad máxima fue representado por colores en los que el verde indica baja intensidad y el rojo indica alta intensidad. Por ejemplo, B. sp. A y F comparten muy pocas clases de pico con B. sp. B y D (Figura 5). Un examen detallado mostró que B. sp. B y D también tienen conjuntos de clases pico específicas de las especies (Figura 5). Estos resultados indican que los conjuntos de pico específicas compartir cert características ain se pueden definir como potenciales biomarcadores a nivel de especies. Por ejemplo, trece conjuntos de pico perteneciente a B. sp. D fueron seleccionados y se define como clases de pico (biomarcadores potenciales) de B. sp. D, incluyendo 2152.5, 2894.9, 3420.8, 4302.0, 4339.9, 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1, 7849.1 y (Tabla 2). Clases máximas de diferentes aislamientos se pueden mostrar en diferentes colores (Figura 2). Clases máxima específica para cada aislamiento se tabulan en la Tabla 2. Clases Pico definido se verificaron más manualmente para asegurarse de que aparecieron en todos los técnicos repeticiones con una intensidad mínima de 100 au Además, subconjuntos de clases de pico también se pueden almacenar para facilitar la caracterización de las bacterias en las subespecies y / o los niveles de tensión, por ejemplo, para distinguir las cepas patógenas de las cepas no patógenas y / o antibióticos para examinar la resistencia / sensibilidad.
ent "> Con respecto a la identificación, los espectros de masas de los aislamientos con código oculto se recogieron y se preprocesa de la misma manera como los espectros de masa de referencia en las bases de datos. Para la identificación basada en la comparación de coeficientes de similitud, se han especificado valores de los parámetros, incluyendo la máxima similitud al 95,0% y la similitud media en 87%. No se especificó similitud mínima (es decir, no se controla). Los valores mínimos de diferencia se establecieron como 5 tanto para la similitud máximo y promedio de similitud. Estos valores pueden necesitar ser optimizado aún más para aumentar la tasa de identificación correcta. La Figura 6 muestra los resultados de identificación basados en la comparación de coeficientes de similitud (Figura 6). El resultado de la casación sugirió que esta bacteria ciego codificado era más probable B. sp. A. Este proyecto de identificación basado en la comparación de coeficiente de similitud fue validado por la validación cruzada (Figura 3 (Figura 3). Curiosamente, la validación cruzada para proyectos de identificación basados en la comparación de las clases de pico es mucho más rápido que los basados en la comparación del coeficiente de similitud.La identificación también puede ser completada basada en coincidencia clase pico (Figura 4). Sin embargo se observaron desajustes de picos (Figura 4). Los desajustes pueden ser debidos a un cambio de masa resultante de los intercambios de aminoácidos en las proteínas respectivas. Los picos no ser emparejado también podrían ser picos que no son discriminativo a nivel de especie, pero que son específicos para esta cepa o aislado. Tomados en conjunto, our resultados sugieren que tanto los métodos de identificación - coeficiente de similitud y basadas en biomarcadores - pueden identificar fácilmente las bacterias a nivel de especies de ambientes kársticos utilizando la preparación de la muestra, la adquisición de espectro, y el flujo de trabajo de análisis de datos se describe aquí.
Figura 1. Base de datos de construcción y resumen espectros de masas Estructura de las bases de datos construidos de esta demostración (A).; Ilustración de resumen pico usando picos de 10 repeticiones técnica de Aminobacter especie A (B).
Figura 2. Dendrograma del material compuestoLos espectros de masas a nivel biológica replicar. El conjunto de datos contiene espectros de 15 especies diferentes, con tres espectros compuesta para cada especie. Cada especie se codifican con un color.
Figura 3. escalamiento multidimensional (MDS) representaciones de los espectros de masas a nivel de técnica de reproducir con 30 espectros para cada especie (A) y el nivel biológica replicar con tres espectros compuesta para cada especie (B). Colores fueron codificados como los mismos colores tal como se utiliza en la Figura 2.
Figura 4. Un ejemplo de tabla de asignación de picos. Tabla se genera en base a los espectros de masas de especies Bacillus A en la leve técnica de reproducirl. Los valores de parámetros de adaptación de pico fueron 1,9 para la tolerancia constante, 550 para la tolerancia lineal y 10% para la tasa de detección de pico, respectivamente. El color azul indica baja intensidad de pico y el rojo indica una alta intensidad de pico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
Figura 5. Una ilustración de dos vías agrupación. La figura se ha generado mediante espectros de masas a nivel de técnica de reproducir. Los colores de los aislados fueron codificados como los mismos colores que se utiliza en la figura 2. La intensidad máxima está representada por colores verde significado de baja intensidad y significado rojo de alta intensidad. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
Figura 6. Identificación Bacteria basado en la comparación del coeficiente de similitud utilizando base de datos personalizada.
| ID una | Fuente | Cercana relación b / Phylum / Clase | Adhesión # (b cercano pariente) | % De similitud | Clave BioNumerics | Reproducibilidad (%) |
| D2 | Espeleotemas en seco | Bacillus sp. E-257 / Firmicutes | FJ764776.1 | 98.8 | Bacillus especie A | 94,9 ± 4,0 |
| D7 | Speleot secodobladillo | Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes | FJ348039.1 | 99.0 | Especies de Bacillus B | 98,0 ± 1,4 |
| F1 | Piedra Flow | Bacillus niacina cepa M27 / Firmicutes | KC315764.1 | 99.2 | Especies de Bacillus C | 96,5 ± 2,4 |
| F4 | Piedra Flow | Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes | FJ348046.1 | 99.1 | Especies de Bacillus D | 89,8 ± 8,8 |
| F9 | Piedra Flow | Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes | EU124558.1 | 99.4 | Especies de Bacillus E | 96,5 ± 1,9 |
| R10 | Goteo de Estalactitas | Bacillus sp. K1 / Firmicutes | GU968734.1 99.8 | Especies de Bacillus F | 95,4 ± 3,9 | |
| D11 | Espeleotemas en seco | Brevibacillus cepa brevis IMAU80218 / Firmicutes | GU125635.1 | 99.5 | Especies Brevibacillus | 94,3 ± 5,8 |
| F14 | Piedra Flow | Sp Exiguobacterium. ZWU0009 / Firmicutes | JX292087.1 | 99.3 | Especies Exiguobacterium | 96,5 ± 2,5 |
| M7 | Espeleotemas húmedo | Brevibacterium sp. N78 / Actinobacteria | HQ188605 | 97.6 | Brevibacterium la especie A | 97,5 ± 2,0 |
| M14 | Espeleotemas húmedo | Cepa Kocuria rhizophila Ag09 / Actinobacteria | EU554435.1 | 100 | Especies Kocuria | 95,2 ± 4,1 |
| M15 | Espeleotemas húmedo | Brevibacterium sp. MN3-3 / Actinobacteria | JQ396535.1 | 99.5 | Brevibacterium especie B | 92,1 ± 4,9 |
| R4 | Goteo de Estalactitas | Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria | FJ711220.1 | 99.9 | Aminobacter especie A | 95,4 ± 2,7 |
| F5 | Piedra Flow | Comamonas cepa testosteroni NBRC 12047 / β-Proteobacteria | AB680219 | 100 | Especies Comamonas | 96,4 ± 2,6 |
| R8 | Goteo de Estalactitas | Delicadas Curvibacter / β-Proteobacteria | AB680705 | 97.0 | Curvibacter </ em> Especies | 89,4 ± 7,8 |
| F8 | Piedra Flow | Moraxella sp. 19.2 KSS / γ-Proteobacteria | HE575924.1 | 99.9 | Especies Moraxella | 92,6 ± 4,9 |
unas bacterias fueron aisladas de las Cavernas Kartchner, AZ, EE.UU. e identificados mediante secuenciación del 16S rDNA. Dos cebadores, 27f (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') y 1492r (5 'TAC TAC CTT GGT GTT ACG ACT T 3'), se utilizaron para obtener cerca de 1.400 pb de longitud 16S rRNA secuencias de genes.
b Sobre la base de una búsqueda BLAST de la base de datos NCBI.
c Los valores reportados son los coeficientes de correlación promedio de 30 repeticiones (tres biológicas repeticiones cada una con 10 repeticiones técnica) ± una desviación estándar.
Tabla 1. Las bacterias utilizadas en los aislamientos de demostración.
| Clave BioNumerics | Clases Peak / biomarcadores potenciales (Da) |
| Bacillus especie A | 2152.5, 2224.9, 2595.8, 2894.9, 2921.3, 3380.5, 3496.3, 3515.0, 3733.5, 4302.0, 4340.0, 4385.8,4763.9, 4910.6, 5189.4, 5227.0, 5634.6, 5769.6, 5892.8, 6301.4, 6756.2, 6789.4, 6990.3, 7029.5, 7466.3 |
| Especies de Bacillus B | 2152.5, 2941.2, 3196.9, 3262.7, 3352.9, 3420.8, 3733.5, 3925.2, 4302.0,4339.9, 4629.2, 4713.4, 4859.3, 4900.6, 5189.4, 5227.0, 5541.8, 5878.7, 6388.8, 6524.0, 6704.5, 6838.8, 7142.7, 7317.5, 7466.3, 7849.1, 9263.9, 9721.2 |
| Especies de Bacillus C | 2588.0, 3361.8, 4330.4, 5173.0, 5847.6, 6332.0, 6524.0, 6720.3 |
| Especies de Bacillus D | 2152.5, 2894.9, 3420.8, 4302.0, 4339.9, 4629.2, 5189.4, 5448.4, 5878.7, 6388.8, 6838.8, 6931.1, 7849.1 |
| Especies de Bacillus E | 2152.5, 2224.9, 2941.2, 3180.1, 3380.5, 4302.0, 4339.9, 4705.3, 5878.7, 6356.6, 6735.1, 6756.2 |
| Especies de Bacillus F | 3308.6, 3367.8, 3567.5, 4279.7, 4489.2, 4629.2, 4727.9, 4751.7, 5067.7, 6614.7, 6919.7, 7130.9 |
| Especies Brevibacillus | 2133.3, 2611.0, 4263.3, 4302.0, 4859.3, 4900.6, 5080.2, 5219.0, 5847.6, 6775.7, 7529.4, 9721.2 |
| Especies Exiguobacterium | 2588.0, 3053.3, 3420.8, 3695.5, 4263.3, 5133.1, 5173.0, 5248.8, 6104.8, 6605.3, 6804.4, 6838.8, 7390.2 |
| Brevibacterium la especie A | 3053.3, 6104.8, 6146.5 |
| Especies Kocuria | 3080.0, 4366.6, 5080.2, 5163.8, 5207.1, 5892.8, 6160.0, 6197.5, 6445.0, 7433.7 |
| Brevibacterium especie B | 3222.8, 3330.4, 3367.8, 4330.4, 4350.4, 4795.3, 4995.7, 5731.6, 6445.0, 6735.1,7487.3 |
| Aminobacter especie A | 2133.3, 2562.4, 3361.8, 3410.4, 4289.2, 4629.2, 4662.0, 4869.8, 6064.1, 6221.0, 6720.3, 6789.4,6818.8, 7216.1, 7447.4 |
| Especies Comamonas | 2806.0, 2921.4, 3246.5, 4350.4, 4727.9, 5607.5, 5666.3, 6221.0, 6488.3, 7317.5, 9362.6 |
| Especies Curvibacter | 2868.6, 3453.2, 4319.8, 5133.1, 6292.4, 6903.4, 7433.7 |
| Especies Moraxella | 3011.2, 5698.0, 6720.3, 7064.8, 7366.6 |
Tabla 2. Clases Peak (biomarcadores potenciales) (Da) definidos para cada especie.
Suplementaria Figura 1. Análisis Principio componente (PCA) de los espectros de masas en el the nivel técnico replicar (A) y las clases de pico (B). Los colores fueron codificados como los mismos colores que se utiliza en la figura 2.
Suplementaria Figura 2. Un ejemplo de clases punta seleccionados sobre la base de las dos vías de agrupamiento. Clases pico que tiene la misma etiqueta se colorean con el mismo color.
Suplementaria Figura 3. Resultados de Cross-validación del proyecto de identificación basado en las bases de datos personalizadas en BioNumerics.
Suplementaria Figura 4. Bacteria identificación basado en juego pico utilizando bases de datos personalizadas.
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Discussion
Esta demostración mostró procedimientos detallados de caracterización e identificación de bacterias usando MALDI-TOF MS y una base de datos personalizada. En comparación con los métodos moleculares tradicionales, por ejemplo, los métodos de secuenciación de 16S rDNA de huellas digitales, basados en MS MALDI-TOF facilitan más rápida identificación de diversas bacterias. Debido a su robustez, esta técnica se utiliza ampliamente para caracterizar las bacterias, los virus, los hongos y la levadura del medio ambiente y en entornos clínicos 1,14-16. Por otra parte, MALDI-TOF MS ha informado, para obtener, en algunos casos, a mayor resolución taxonómica 1. Por ejemplo, B. sp. A, B, D, y E, aunque tiende a agruparse juntos (Figura 2), se separaron claramente y la similitud entre los espectros de diferente B. sp. fue menor que 80% (Figura 2). En contraste, las secuencias de 16S rDNA de estas cepas tenían una alta similitud, que no podría ser usado para diferenciar estos aislamientosa nivel de especie. Las secuencias de 16S rDNA de B. sp. B y D tienen 99% de similitud sobre la base de análisis de alineación múltiple, mientras que las secuencias de B. sp. A y E muestran 95% y 96% de similitud, respectivamente, a las secuencias de B. sp. B y D. Los valores atípicos también se observaron. Por ejemplo, B. sp. C y F agrupan lejos de otros B. sp. (Figura 2). La aparición de cepas atípicas indica que el análisis de la agregación de los espectros de masas no establece necesariamente relaciones filogenéticas. El entorno de la cual aísla se obtuvieron también puede afectar a la agrupación espectros de masas. Por ejemplo, Brevibacterium especies especies Kocuria que se aislaron de espeleotemas húmedo y B. sp B y. F que se aisló de goteo estalactita tendía a agruparse (Tabla 1, Figura 2), pero se necesita más investigación para examinar si esto se observa en una colección más grande de Isolates.
Esta técnica basada en la biblioteca también tiene algunas limitaciones. La caracterización se basa generalmente en las bases de datos. Bases de datos comerciales actuales se componen principalmente de cepas bacterianas, particularmente los patógenos. Estas bases de datos comerciales son más útiles en entornos de laboratorio de microbiología clínica. Para la caracterización de aislados del medio ambiente, así como virus, hongos y levaduras, bases de datos personalizadas deben ser construidas utilizando grandes colecciones de cepas. Los parámetros utilizados en los análisis de seguimiento también pueden necesitar ser optimizado para aumentar la resolución taxonómica, especialmente en las subespecies y los niveles de deformación. Por ejemplo, el S: N utiliza para la detección de pico en esta demostración fue de 10. Este valor es apropiado para la identificación a nivel de especie, pero para la identificación a nivel de cepa, puede necesitar este valor a ser rebajado. Puesto que estos parámetros de procesamiento, así como los flujos de trabajo de procesamiento de datos están a veces definido por el usuario en muchos paquetes de software, por ejemplo, ClinProTools y BionumeRICS, es probable que se requiera una optimización de los valores de los parámetros y la selección de flujos de trabajo adecuadas para optimizar el análisis de datos. En esta demostración, parámetros coincidentes pico, valores umbrales utilizados en el proyecto de identificación y validación cruzada toda optimización necesarios para mejorar las tasas de identificación correctos. Para encontrar un método y / o procedimiento para optimizar estos parámetros es de gran interés para nuestro laboratorio. Por ejemplo, un enfoque podría involucrar diseño factorial estadístico, que hemos utilizado recientemente para optimizar MALDI-TOF automatizado de adquisición de datos 17. Futuras aplicaciones adicionales y mejora de la toma de huellas dactilares microbiana basada en MS MALDI-TOF incluyen la construcción de ampliamente disponibles, las bases de datos más grandes de bacterias del medio ambiente y / o microorganismos no bacterianos, así como la caracterización de cultivos mixtos 18 y las comunidades microbianas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
References
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