Protocol
Varning: Oidentifierade bakterier från alla miljöer kan vara patogena och måste hanteras med försiktighet med hjälp av lämpliga biosäkerhet protokoll. Arbeta med levande kulturer måste utföras i en klass II biosäkerhet skåp med hjälp Biologisk säkerhet Nivå 2 (BSL-2) procedurer. Mer information om BSL-2 procedurer finns i CDC / NIH handbok med rubriken "biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier," sidorna 33-38. Dokumentet finns online på http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), inklusive rockar / kappor, skyddsglasögon och nitril eller latex handskar, måste bäras. Standard mikrobiologiska metoder och försiktighetsåtgärder måste följas, och biologiskt avfall skall kasseras på lämpligt sätt.
Bakterier som används i denna demonstration isolerades från Kartchner Caverns,AZ, USA, från fyra miljöer, däribland torra Droppsten, flöde sten, fuktig Droppsten och stalaktiter dropp (tabell 1). Alla isolat identifierades genom 16S rDNA-sekvensering och förvaras vid -80 ° C i 25% glycerol-R 2 B-medium. Alla experiment genomfördes vid RT.
Obs: Vi rekommenderar att du använder samma prov förberedelse metod att skaffa masspektra för databaskonstruktion och mass-spektra av okända. Provberedning metod har visat tidigare att påverka spektrum kvalitet och reproducerbarhet 3. Med hjälp av en annan provberedning metod kan orsaka felaktig identifiering av okända, särskilt när högre taxonomiska upplösning (t.ex. på stamnivå) önskas.
1. Deposition på MALDI Target
Försiktighet: Flera protokoll för att erhålla proteinextrakt kräver användning av syror och organiska lösningsmedel som skall användas i enlighet med guidElines och information i sina respektive Säkerhetsdatablad (MSDS). Lämplig skyddsutrustning ska bäras och kommer att variera beroende på typ och volym av kemikalier som används (t.ex. rockar / kappor, handskar, skyddsglasögon och andningsskydd måste användas när man arbetar med stora mängder giftiga, brandfarliga lösningsmedel, såsom acetonitril, och korrosiva syror, såsom myrsyra och trifluorättiksyra).
- Deposition 1 pl proteinextrakt som inte innehåller några levande celler (erhållna med hjälp av lämpliga, tidigare beskrivna protokoll 11-13) på en rostfri MALDI måltavla och låt det torka. Överlägg den torkade proteinextrakt med 1 pl matrislösning (α-cyano-4-hydroxy-kanelsyralösning), och låt det torka.
- För varje biologisk replikera, spot ett lämpligt antal tekniska replikat (5 till 20 tekniska replikat). Här, spot 10 tekniska replikat för varje biologisk replikera och 3 biologiska replikat were förberedd.
Obs: Vi rekommenderar att du använder en polerad MALDI mål stålplåt när du använder proteinextraktion provberedningsmetod. Använda måltavlor markstål kan orsaka spridning och oavsiktlig blandning av de olika proven utanför individuella provbrunnar. - Deposition 1 pl kalibreringsstandard på måltavlan och låt det torka. Overlay med 1 pl matrislösning och låt det torka.
- Deposition 2 il matrislösning på måltavlan som en negativ kontroll.
2. Mass Spectra Acquisition
- Använd en MALDI-TOF-masspektrometer utrustad med en kvävelaser (λ = 337 nm) och drivs med hjälp av Bruker Flexcontrol programvara.
- Samla varje Masspektrumet i positivt linjärt läge genom ackumulering av 500 laserskott i steg 100 skott. Ställ jonkällan 1 spänning till 20 kV; jonkälla 2 spänning till 18.15 kV; och linsspänningen till 9,05 kV. Notera att dessa parametrar är instrument specific och kan behöva justeras om andra instrument för att uppnå optimala resultat.
- Ställ massa och laddning sortiment för automatiserad utvärdering spektrum från 2 till 20 kDa per laddning. Använd den centroida toppdetekteringsalgoritmen. Ställ in minsta upplösning tröskel vid 100 Da. Ställ in signalbrusförhållandet (S: N) tröskel vid 2. Ställ in minimiintensitetströskel vid 100.
3. Databas Konstruktion
- Databasdesign
- Skapa en ny databas i BioNumerics 7.1 med hjälp av "Ny databas wizard".
- Skapa ett spektrum experiment typ, t.ex. Maldi, hjälp av kommandon i "Experiment Typer" panelen.
- Skapa nivåerna med hjälp av "Databasdesign panel". Lägg till nya nivåer med hjälp av "Nivå> Lägg till ny nivå ..." kommando i menyn "Databas". Här skapar "Species" nivå "Biologisk replikera" nivå "och" Tekniska replikera "nivå, respektively.
- Importera och förbehandling rå masspektra
- Exportera rå masspektra som .txt filer med FlexAnalysis genom att klicka på "Exportera> Masspektrum" kommando i menyn "File".
- Importera rå masspektra (.txt) i databasen i nivån av de tekniska replikat.
- Förbehandla rå masspektra.
- Import och sampla (med hjälp av en kvadratisk passande algoritm).
- Utför en baslinjesubtraktion (med en rullande skiva med en storlek på 50 poäng).
- Beräkna buller [Kontinuerlig Wavelet Transformation (CWT)], slät (Kaiser Fönster med ett fönsterstorlek på 20 poäng och beta av 10 poäng), och utför en andra baslinjesubtraktion (rullande skiva med storleken på 200 poäng).
- Detect toppar [CWT med en minsta signalbrusförhållande (S: N) av 10].
- Efter förbehandling, spara karakteristiska mönster av varje masspektrum såsom topplistorna innehåller toppstorlekar toppintensiteter, S: N etc, i databasen.
- Skapa sammansatta masspektra
- Skapa sammansatta spektra från förbehandlade spektra med hjälp av "Sammanfatta ..." kommandot i menyn "Analys". Välj "Biologisk replikera" som målnivå.
- Här kombinerar masspektra av 10 tekniska replikat av samma koloni att ge en sammansatt masspektrum för den koloni, vilket resulterade i tre sammansatta masspektra för det isolat vid "Biologisk replikera" nivå.
- Här, sammanfatta de tre sammansatta spektra för att skapa en sammansatt spektrum för att isolera på "Art" nivå.
Obs: Den sammansatta spektrumet är den punkt-för-punkt genomsnittet av de tekniska replikat. Replikerar med en likhet (Pearson korrelation) till genomsnittet av mindre än 95% (standardinställning) är undantagna från kompositen. Toppar på komposit spektra bara kallas om de är närvarande i 75% (standardinställning) av de inkluderade replikat. För de biologiska replikat, dessa inställningar var 90 och 60%, respektive.
4. Masspektrum Data Analysis
- Markera de poster i databasen och skapa en jämförelse genom att klicka på "Skapa ny jämförelse" kommando i "Jämförelser" panelen.
- Här använder masspektra på "Tekniska replikera" och / eller "Biologisk replikera" nivåer för att visa jämförelser och analyser.
- Likhet Baserad klusteranalys och flerdimensionell skalning (MDS)
- Skapa grupper med färger. Välj de tre biologiska sammansatta masspektra och klicka på "Skapa ny grupp från urvals" kommando i menyn "Grupper" för att skapa en grupp för motsvarande isolat. Utse en färg automatiskt för dessa tre masspektra.
- Alternativt definierar fält stater med motsvarande färger med kommandona i "Databas poster "panel så att varje gruppering utifrån detta definierat område använder samma färg som definierats för denna grupp.
- Utför klusteranalys. Klicka på "Beräkna klusteranalys" kommando i menyn "Kluster". På Jämförelse inställningar Page 1, välj "Pearson korrelation" och lämna andra parametrar som standard. På sidan 2, välj "UPGMA". Klicka sedan på "Finish".
- Skaffa en MDS plot med "Multi-dimensionell skalning ..." kommandot i menyn "Statistik".
- Peak matchning
- Klicka på den typ spektrum "Maldi" i "Experiment" panelen. Välj sedan "Layout> Visa bild". Spektra visas som gelbanden.
- Utför topp matchning med hjälp av "Gör peak matchning" kommando i menyn "Spectra".
- Identifiering av toppklasser
- Utför principalkomponentanalys (PCA). Markera "Maldi "experiment typ i" Experimental "panel och använd" Principal Components Analysis ... "kommando i" menyn statistik "att utföra PCA.
- Utför tvåvägs klustring. Klicka på "Statistik> Matrix mining" ... i "Jämförelse" fönstret. Intensiteten av topparna matchade till toppklasserna representeras med olika färger (värme karta).
5. Bakterier Identifiering med en anpassad Database
- Likhet koefficient baserad metod
- Skapa en jämförelse och generera en dendrogram utifrån masspektra på "Tekniska replikera" nivå som beskrivs i steg 4.3.3. Spara dendrogram för jämförelse av likhet.
- Välj en okänd masspektrum, och klicka på "Analys> Identifiera markerade poster". Identifierings dialogrutan visas.
- Välj "Jämförelse baserade" klassificerare typ (eller en lagrad classifier) och klicka på "nästa". På nästa sida, välj den sparade dendrogram som referens jämförelse och klicka sedan på "Nästa".
- Välj "Grund likheten" som identifieringsmetod och klicka sedan på "Nästa".
- Välj "Maximum likhet" som scoring metod. Skriv in lämpliga tröskelvärden och minimiskillnadsvärden för varje parameter och klicka sedan på "Nästa".
- När beräkningarna är färdiga visas identifieringsfönstret. I "Results" panel, är medlemmarna i databasen som bäst matchar det okända listad.
- Spara identifierings projektet och validera identifieringen med hjälp av "cross-valideringsanalys" kommando i "Identifikation projektet" panelen.
- Potentiell biomarkör baserad metod
- Definiera topp klasser. I "Matrix Mining" fönstret väljer uppsättningar toppar som delar gemensamma egenskaper och definiera dessa toppar som specific toppklasser (potentiella biomarkörer) med "Spectra> Hantera peak klasstyper ..." i "jämförelsefönster".
- Här definierar toppklasser specifika för varje isolat för alla de 15 isolaten.
- Välj masspektra för okända och matcha topparna av dessa spektra till de definierade topp klasser såsom tidigare beskrivits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Databaserna konstruerade i denna demonstration hade fyra nivåer, från högsta till lägsta nivå, bland annat "alla nivåer", "Art", "Biologisk replikera" och "Tekniska replikera", respektive (Figur 1A). Den "Tekniska replikera" nivån innehöll all förbehandlade spektra av tekniska replikat. Den "Biologisk replikera" och "Arter" nivåer innehöll kompositen (sammanfattning) spektra. "Alla nivåer" innehöll all teknisk replikera spektra liksom alla komposit spektra.
Spektrumsammanfattnings procedurer visas i figur 1 med användning av representativa toppar. Varje medlem masspektrum visas som en tunn grå linje. Den sammansatta spektrum representeras som en linje färgade i rött. Intilliggande toppar är markerade med en annan färg för att möjliggöra enklare visuell inspektion (Figur 1B).
tabell 1. Den högsta reproducerbarhet var 98,0 ± 1,4 för Bacillus arter B, och den lägsta reproducerbarhet var 89,4 ± 7,8 för Curvibacter arter (tabell 1).
Klusteranalys på biologiska replikera nivå underlättas visualisering av den hierarkiska strukturen i de komplexa spektra uppgifter mass. Såsom visas i fig 2, biologiska replikat grupperade tillsammans, och 15 arter av bakterier som bildas 15 kluster. Närbesläktade arter, till exempel B. sp. A, B, D och E, tenderade att koncentrera tillsammans. Men avvikare, exempelvis B. sp. C och F, observerades också. MDS tomter baserade på masspektra vid de "tekniska och biologiska" nivåer visas i figur 3. MDS pmassor gav en klar, 3-D visualisering av likheterna mellan spektra för dessa bakterier. Både tekniska replikat och biologiska replikat uppvisade en liknande gruppering (Figur 3 A och B).
Peak matchning användes för att särskilja uppsättningar av toppar i masspektra. Peak matchande parametrar, däribland konstant tolerans (punkter på x-axeln), linjär tolerans (ppm) och toppdetekteringsgrad måste anges av användaren. Konstant tolerans och linjär tolerans är de faktorer som används för att beräkna toleransläge av topparna med hjälp av ekvationen: positionen tolerans = konstant tolerans + linjär tolerans × m / z. Med ökande m / z, minskar vikten av konstant tolerans. Peak upptäckten hastighet innebär att endast om en topp hittas på den positionen under mer än den definierade hastighet spektra, är en topp klass gjorde. En topp på en eller flera mönster representerar en topp klass. Om exempelvis toppdetekteringshastigheten EQUAls 10%, kan göras en topp klass endast om mer än 10% av spektra har toppar vid positionen. Detta utesluter låga prevalenstoppar (vanligtvis bullertoppar) i en uppsättning med tekniska replikat. Om apparaten är baserad på den sammansatta spektra av biologiska replikat, kan detta antal behöva bli lägre så låga prevalenstoppar har redan filtrerats bort under skapandet av den sammansatta spektra. I denna demonstration, var toppmatchning utförs med hjälp masspektra på "Tekniska replikera" nivå och värdena på dessa parametrar var 1,9, 550 och 10%, respektive. Baserat på utvalda parametrar, var toppar anses matcha eller inte matcha, vilket resulterar i olika toppgrupper. Ett exempel på topp matchande resultat visas i figur 4 med användning av 30 replikat av en enstaka isolat (Bacillus-arter A). De matchande resultat visualiserades såsom en tabell, i vilken de råa intensiteter är närvarande som färger. Blått indikerar låg intensitet och rött indikerar högt intensity. Baserat på topp matchande resultat, kan användarna definiera toppklasser som underlättar uppföljning analyser.
Både huvudkomponentanalys (PCA) (Kompletterande Figur 1) och två-vägs klustring kan användas för att analysera komplexa topp klasser. Ett representativt tvåvägs klustring resultat med masspektra på "Tekniska replikera" nivå visas i figur 5. Två dendrograms visas. En är bredvid m / z-värden och den andra är över bakterie poster (Figur 5). Peak intensitet representerades av färger som grönt indikerar låg intensitet och rött indikerar hög intensitet. Till exempel, B. sp. A och F delar väldigt få toppklasser med B. sp. B och D (Figur 5). Nära undersökning visade att B. sp. B och D har även uppsättningar av artspecifika toppklasser (Figur 5). Dessa resultat tyder på att specifika topp uppsättningar dela cert Ain egenskaper kan definieras som potentiella biomarkörer arter nivå. Till exempel, tretton topp uppsättningar tillhör B. sp. D valdes ut och definieras som toppklasser (potentiella biomarkörer) av B. sp. D, inklusive 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, och 7849,1 (tabell 2). Peak klasser av olika isolat kan visas i olika färger (Kompletterande Figur 2). Peak klasser specifika för varje isolat var i Tabell 2. Bestämda toppklasser ades ytterligare manuellt kontrolleras för att säkerställa att de dök upp i alla tekniska replikat med en minsta intensitet 100 au Dessutom kan delmängder av toppklasser också lagras för att underlätta karakterisering av bakterier vid underarter och / eller belastningsnivåer, till exempel för att skilja patogena stammar från icke-patogena stammar och / eller för att undersöka antibiotikaresistens / känslighet.
ent "> När det gäller identifiering, var masspektra blindkodade isolat samlas och förbehandlas på samma sätt som referens masspektra i databaserna. För identifiering baserad på jämförelse av likhets koefficienter var parametervärden anges, inklusive maximal likheten vid 95,0% och den genomsnittliga likheten vid 87%. Minimum likhet inte angavs (dvs, lämnas därhän). De minsta differensvärdena fastställdes som 5 för både maximal likhet och genomsnittlig likheten. Dessa värden kan behöva optimeras ytterligare för att öka graden av korrekt identifiering. Figur 6 visar identifierings resultat baserat på jämförelser av likhets koefficienter (Figur 6). Den matchande resultat tydde på att denna blinda kodade bakterie var troligen B. sp. A. Denna identifiering projekt som bygger på en jämförelse av likheten koefficient ytterligare validerats av korsvalidering (Kompletterande Figur 3 (Kompletterande Figur 3). Intressant är korsvalidering för identifiering som bygger på en jämförelse av topp klasser mycket snabbare än de som baseras på en jämförelse av likhet koefficient.Identifiering kan också kompletteras utifrån topp klass matchning (Kompletterande Figur 4). Emellertid felpassningar av toppar observerades (Kompletterande Fig 4). De felpamingar kan bero på en massförskjutning som härrör från aminosyrautbyten i de respektive proteinerna. Topparna inte matchas kan också vara toppar som inte är diskriminerande på artnivå men är specifika för denna stam eller isolera. Taget tillsammans, oåra resultat tyder på att båda identifieringsmetoder - likheten koefficient och biomarkörer baserade - lätt kan identifiera bakterier på artnivå från karstic miljöer med hjälp av provberedning, förvärvsspektrum, och dataanalys arbetsflöde beskrivs här.
Figur 1. Databas konstruktion och masspektra sammanfattnings Struktur av databaser byggda i denna demonstration (A). Illustration av toppsammanfattning använder toppar från 10 tekniska replikat av Aminobacter species A (B).
Figur 2. dendrogram av kompositmasspektra på biologiska replikera nivån. Data set innehåller spektra av 15 olika arter med tre sammansatta spektra för varje art. Varje art kodades med en färg.
Figur 3. Multi-dimensionell skalning (MDS) representationer av masspektra på tekniska replikera nivån med 30 spektra för varje art (A) och biologisk replikera nivå med tre sammansatta spektra för varje art (B). Färger kodades som samma färger som användes i fig 2.
Figur 4. En illustration av topp tillhörande bord. Tabell genererades utifrån masspektra av Bacillus species A på teknisk replikera level. Värdena för topp matchande parametrar var 1,9 för konstant tolerans, 550 för linjär tolerans och 10% för topp upptäckten hastighet, respektive. Blått indikerar låg toppintensitet och rött indikerar hög toppintensitet. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 5. En illustration av tvåvägs klustring. Figur genererades med hjälp av masspektra på teknisk replikat nivån. Färger av isolat kodades som samma färger som används i figur 2. Peak intensitet representeras av färger grönt börden låg intensitet och röd innebörd hög intensitet. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 6. Bakterier identifiering baserad på jämförelse av likhet koefficient använda anpassade databas.
| ID a | Källa | Närmaste relativa b / Stam / klass | Anslutnings # (närmaste släkting b) | % Likhet | BioNumerics nyckel | Reproducerbarhet (%) |
| D2 | Torr Droppsten | Bacillus sp. E-257 / Firmicutes | FJ764776.1 | 98,8 | Bacillus-arter A | 94,9 ± 4,0 |
| D7 | Torr speleotfåll | Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes | FJ348039.1 | 99,0 | Bacillus-arter B | 98,0 ± 1,4 |
| F1 | Flödes sten | Bacillus niacin stam M27 / Firmicutes | KC315764.1 | 99,2 | Bacillus-arter C | 96,5 ± 2,4 |
| F4 | Flödes sten | Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes | FJ348046.1 | 99,1 | Bacillus-arter D | 89,8 ± 8,8 |
| F9 | Flödes sten | Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes | EU124558.1 | 99,4 | Bacillus-arter E | 96,5 ± 1,9 |
| R10 | Stalactite dropp | Bacillus sp. K1 / Firmicutes | GU968734.1 99,8 | Bacillus-arter F | 95,4 ± 3,9 | |
| D11 | Torr Droppsten | Brevibacillus brevis stam IMAU80218 / Firmicutes | GU125635.1 | 99,5 | Brevibacillus arter | 94,3 ± 5,8 |
| F14 | Flödes sten | Exiguobacterium sp. ZWU0009 / Firmicutes | JX292087.1 | 99,3 | Exiguobacterium arter | 96,5 ± 2,5 |
| M7 | Fuktig Droppsten | Brevibacterium sp. N78 / Aktinobakterier | HQ188605 | 97,6 | Brevibacterium arter A | 97,5 ± 2,0 |
| M14 | Fuktig Droppsten | Kocuria Rhizophila stam Ag09 / Aktinobakterier | EU554435.1 | 100 | Kocuria arter | 95,2 ± 4,1 |
| M15 | Fuktig Droppsten | Brevibacterium sp. MN3-3 / Aktinobakterier | JQ396535.1 | 99,5 | Brevibacterium species B | 92,1 ± 4,9 |
| R4 | Stalactite dropp | Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-proteobakterier | FJ711220.1 | 99,9 | Aminobacter art A | 95,4 ± 2,7 |
| F5 | Flödes sten | Comamonas testosteroni stam NBRC 12047 / β-proteobakterier | AB680219 | 100 | Comamonas arter | 96,4 ± 2,6 |
| R8 | Stalactite dropp | Curvibacter fintvätt / β-proteobakterier | AB680705 | 97,0 | Curvibacter </ em> arter | 89,4 ± 7,8 |
| F8 | Flödes sten | Moraxella sp. 19,2 KSS / γ-proteobakterier | HE575924.1 | 99,9 | Moraxella art | 92,6 ± 4,9 |
en bakterie isolerades från Kartchner hålor, AZ, USA och identifieras med användning av 16S rDNA-sekvensering. Två primrar, 27f (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') och 1492r (5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'), användes för att erhålla nästan 1400 bp-längd 16S rRNA gensekvenser.
B baserat på en BLAST-sökning av NCBI-databasen.
c Värden rapporteras är de genomsnittliga korrelationskoefficienterna 30 replikat (tre biologiska replikat vardera 10 tekniska replikat) ± en standardavvikelse.
Tabell 1. Bakterier isolat används i demonstrationen.
| BioNumerics nyckel | Peak kurser / Potentiella biomarkörer (Da) |
| Bacillus-arter A | 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3 |
| Bacillus-arter B | 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2 |
| Bacillus-arter C | 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3 |
| Bacillus-arter D | 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1 |
| Bacillus-arter E | 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2 |
| Bacillus-arter F | 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9 |
| Brevibacillus arter | 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2 |
| Exiguobacterium arter | 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2 |
| Brevibacterium arter A | 3053,3, 6104,8, 6146,5 |
| Kocuria arter | 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7 |
| Brevibacterium species B | 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3 |
| Aminobacter art A | 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4 |
| Comamonas arter | 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6 |
| Curvibacter arter | 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7 |
| Moraxella art | 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6 |
Tabell 2. Peak klasser (Potentiella biomarkörer) (Da) definierade för varje art.
Kompletterande Figur 1. Princip komponentanalys (PCA) av massan spektra på the teknisk replikat nivå (A) och toppklasser (B). Färger kodades som samma färger som används i figur 2.
Kompletterande Figur 2. En illustration av toppklasser utvalda baserat på tvåvägs klustring. Peak klasser som har samma etikett är färgade med samma färg.
Kompletterande Figur 3. Tvärvalideringsresultaten identifierings projekt som bygger på de egna databaserna i BioNumerics.
Kompletterande Figur 4. Bakterier identifiering baserad på topp matchning med hjälp av anpassade databaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna demonstration visade detaljerade förfaranden för karakterisering och identifiering av bakterier som använder MALDI-TOF MS och en egen databas. I jämförelse med traditionella molekylära metoder, till exempel, 16S rDNA sekvense, MALDI-TOF MS-baserade fingeravtrycksmetoder underlättar snabbare identifiering av olika bakterier. På grund av dess robusthet, är denna teknik används i stor utsträckning för att karakterisera bakterier, virus, svampar och jäst från omgivningen och i kliniska situationer 1,14-16. Vidare har MALDI-TOF MS rapporterats att ha råd med, i vissa fall, högre taxonomiska upplösning 1. Till exempel, B. sp. A, B, D och E, men tenderar att klustra ihop (figur 2), var klart åtskilda och likheten mellan spektra av olika B. sp. var mindre än 80% (figur 2). Däremot 16S rDNA-sekvenserna av dessa isolat hade hög likhet, som inte skulle kunna användas för att differentiera dessa isolatpå artnivå. 16S rDNA-sekvenser av B. sp. B och D har 99% likhet baserad på analys multipel anpassning, medan sekvenser av B. sp. A och E visar 95% respektive 96% likhet, respektive att sekvenserna av B. sp. B och D. Extremvärden observerades också. Till exempel, B. sp. C och F grupperade ifrån andra B. sp. (Figur 2). Utseendet på outlier isolat visar att klusteranalys av masspektra inte nödvändigtvis etablera fylogenetiska relationer. Miljön som isolerar erhölls kan också påverka masspektra klustring. Till exempel, Brevibacterium arter B och Kocuria arter som isolerats från fuktig Droppsten och B. sp. F som isolerades från stalactite dropp tenderade att samlas ihop (Tabell 1, Figur 2), men det krävs ytterligare forskning för att undersöka om detta har observerats i en större samling av Isolates.
Detta bibliotek Baserad teknik har också vissa begränsningar. Karakterisering baseras vanligen på databaser. Aktuella kommersiella databaser huvudsakligen består av bakteriestammar, särskilt patogena sådana. Dessa kommersiella databaser är mest användbara i klinisk mikrobiologi lab inställningar. Att karaktärisera miljö isolat samt virus, svampar och jäst, anpassade databaser måste byggas med hjälp av stora belastningssamlingar. De parametrar som används i de uppföljande analyser kan också behöva optimeras för att öka den taxonomiska upplösning, särskilt vid de underarter och belastningsnivåer. Till exempel, S: N som används för toppdetektering i denna demonstration var 10. Detta värde är lämpligt för artbestämning nivå, men för nivå identifiering stam, kan detta värde behöva sänkas. Eftersom dessa processparametrar samt databehandling arbetsflöden ibland användardefinierade i många mjukvarupaket, till exempel, ClinProTools och BionumeRICS, kommer en optimering av parametervärden och val av lämpliga arbetsflöden sannolikt att krävas för att optimera dataanalys. I denna demonstration, topp matchande parametrar, tröskelvärden som används i projektidentifiering, och korsvalidering all nödvändig optimering för att förbättra korrekta identifierings priser. För att hitta en metod och / eller förfarande för att optimera dessa parametrar är av stort intresse för vårt labb. Till exempel kan ett tillvägagångssätt innebära statistisk faktor, som vi använde nyligen att optimera MALDI-TOF automatisk datainsamling 17. Ytterligare framtida tillämpningar och förstärkning av MALDI-TOF MS-baserade mikrobiella fingeravtryck inkluderar konstruktion av allmänt tillgängliga, större databas med miljö bakterier och / eller icke-bakteriella mikroorganismer samt karakterisering av blandade kulturer 18 och mikrobiella samhällen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
- Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
- Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
- Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
- Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
- Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
- Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
- Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
- Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
- Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
- Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
- Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
- Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
- Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
- Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
