Protocol
Let op: Unidentified bacteriën uit elke omgeving kunnen pathogene zijn en moet met de nodige voorzichtigheid worden behandeld met behulp van geschikte bioveiligheid protocollen. Werken met levende culturen moet in een klasse II bioveiligheid kast worden uitgevoerd met behulp van Biologische Veiligheid Niveau 2 (BSL-2) procedures. Meer informatie over BSL-2 procedures is beschikbaar in de CDC / NIH handleiding getiteld, "Bioveiligheid in Microbiologische en Biomedische Laboratories", pagina's 33-38. Het document is online beschikbaar op http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van witte jassen / jassen, veiligheidsbril, en nitril of latex handschoenen, moeten worden gedragen. Standaard microbiologische methoden en voorzorgsmaatregelen moeten worden gevolgd, en biologisch gevaarlijk afval moet op passende wijze worden weggegooid.
Bacteriën die in deze demonstratie werden geïsoleerd uit Kartchner Caverns,AZ, USA, uit vier omgevingen, waaronder droge speleothem, stroom steen, vochtige speleothem en stalactieten druppelen (tabel 1). Alle isolaten werden geïdentificeerd door 16S rDNA sequentie en bij -80 ° C in 25% glycerol-R 2 B medium gehouden. Alle experimenten werden voltooid bij kamertemperatuur.
Opmerking: Wij raden het gebruik van hetzelfde monster bereidingswijze massa spectra voor database-bouw en massa spectra van onbekenden te verwerven. Monstervoorbereiding methode is eerder aangetoond dat het invloed spectrum kwaliteit en reproduceerbaarheid 3. Met behulp van een andere steekproef bereidingswijze kan onjuiste identificatie van onbekenden, vooral wanneer hogere taxonomische resolutie (bv De stam van) veroorzaken gewenst is.
1. Afzetting op de MALDI Target
Let op: Verschillende protocollen te verkrijgen eiwitextracten vereisen het gebruik van zuren en organische oplosmiddelen die moeten worden gebruikt in overeenstemming met de GUIDElines en informatie in hun respectieve Materials veiligheidsinformatiebladen (VIB). Geschikte beschermingsmiddelen moeten worden gedragen en zal variëren op basis van het type en het volume van de chemicaliën die worden gebruikt (bijvoorbeeld lab jassen / jassen, handschoenen, een veiligheidsbril, en ademhalingsbescherming moet gebruikt worden bij het werken met grote hoeveelheden giftige, brandbare oplosmiddelen, zoals acetonitril, en bijtende zuren, zoals mierezuur en trifluorazijnzuur).
- Borg 1 pl proteïne-extract, die geen levensvatbare cellen (verkregen met behulp van passende, eerder beschreven protocollen 11-13) op een roestvrij stalen MALDI doel plaat en laat ze drogen. Overlay het gedroogde eiwit extract met 1 pi matrixoplossing (α-cyano-4-hydroxy-kaneelzuur oplossing) en laten drogen.
- Voor elke biologische repliceren, spot een passend aantal technische herhalingen (5-20 technische replica). Hier, spot 10 technische replica voor elke biologische repliceren en 3 biologische herhalingen wEre voorbereid.
Opmerking: Wij raden het gebruik van een gepolijste stalen MALDI richtplaat bij het gebruik van het eiwit extractie monstervoorbereiding methode. Met behulp van geslepen stalen doelwit platen kunnen veroorzaken verspreiden en onopzettelijke vermenging van de verschillende monsters buitenkant van individuele monsterputjes. - Borg 1 ui kalibrant standaard op de doelgroep bord en laat ze drogen. Overlay met 1 ui matrix-oplossing en laat ze drogen.
- Breng 2 pi matrixoplossing op de trefplaat als een negatieve controle.
2. Mass Spectra Acquisitie
- Gebruik een MALDI-TOF massaspectrometer uitgerust met een stikstof laser (λ = 337 nm) en gebruikt Bruker FlexControl software.
- Verzamel elk massaspectrum in positieve lineaire modus door ophoping van 500 laser schoten in stappen van 100 geschoten. Stel de ionenbron 1 spanning tot 20 kV; ionbron 2 spanning tot 18.15 kV; en de lens voltage tot 9,05 kV. Merk op dat deze parameters zijn instrument-specific en misschien aanpassing op andere instrumenten nodig om optimale resultaten te verkrijgen.
- Stel de massa-tot-lading bereik voor automatische spectrum evaluatie van 2 tot 20 kDa per lading. Gebruik het zwaartepunt piekdetectie algoritme. Stel de minimale resolutie drempel bij 100 Da. Stel de signaal-ruisverhouding (S: N) drempel 2. Stel de minimale intensiteit drempel op 100.
3. Database Bouw
- Database-ontwerp
- Maak een nieuwe database in BioNumerics 7.1 met behulp van de "Nieuwe database tovenaar".
- Maak een spectrum soort experiment, bijvoorbeeld, Maldi, met behulp van commando's in het "Experiment Types" paneel.
- Maak de niveaus met behulp van de "Database ontwerp panel". Voeg nieuwe niveaus met behulp van de 'Level> Voeg nieuwe level ... "opdracht in het menu" Database ". Hier maken "Soort" niveau "Biologische repliceren" niveau "en" Technische repliceren "niveau, respectieely.
- Importeren en voorbewerken ruwe massa spectra
- Exporteer de ruwe massa spectra als .txt-bestanden met behulp van FlexAnalysis door te klikken op de "Exporteer> Massa spectrum" commando in het menu "Bestand".
- Importeren het ruwe massaspectra (.txt bestanden) in de database van het niveau van de technische duplo's.
- Preprocess de ruwe massa spectra.
- Import en resamplen (met behulp van een kwadratische fitting algoritme).
- Voer een basislijn aftrekken (met een rollende schijf met een grootte van 50 punten).
- Berekenen ruis [Continue Wavelet Transformatie (CWT)], glad (Kaiser Venster met een venster grootte van 20 punten en bèta van 10 punten), en het uitvoeren van een tweede aftrekken van de basislijn (rollende schijf met een grootte van 200 punten).
- Detect pieken [CWT minimaal signaal-ruisverhouding (S: N) 10].
- Na de voorbewerking, sparen karakteristieke patronen van elk massaspectrum, zoals piek lijsten met peakformaten piekintensiteiten, S: N, etc. in de database.
- Het creëren van samengestelde massa spectra
- Maken composiet spectra van voorbewerkte spectra met behulp van de "Vat ..." opdracht in het menu "Analyse". Kies de "Biologische repliceren" als streefwaarde.
- Hier combineren massaspectra van 10 technische replicaten van dezelfde kolonie om een samengesteld massaspectrum opleveren die kolonie, waardoor drie samengestelde massa spectra die isoleren in de "Biologische repliceren" niveau.
- Hier, een samenvatting van de drie samengestelde spectra op één samengestelde spectrum voor dat isoleren op de "Soort" niveau te creëren.
Opmerking: De samengestelde spectrum is het punt voor punt gemiddelde van de technische duplo's. Duplo's met gelijkenis (Pearson correlatie) met het gemiddelde van minder dan 95% (standaardinstelling) zijn uitgesloten van de composiet. Pieken op de samengestelde spectra worden alleen ingeschakeld wanneer zij aanwezig zijn in 75% (standaardinstelling) van de opgenomen herhalingen. Voor de biologische herhalingen, deze instellingen waren 90 en 60%, respectievelijk.
4. Massa Spectrum Data Analyse
- Selecteer de gegevens in de database en maak een vergelijking door te klikken op de "Create new vergelijking" commando in de "Vergelijkingen" paneel.
- Hier, gebruik maken van de massa spectra bij de "Technische repliceren" en / of "biologische repliceren" levels om vergelijkingen en analyses tonen.
- Similarity-gebaseerde cluster analyse en multi-dimensionale scaling (MDS)
- Maak groepen met kleuren. Selecteer de drie biologische samengestelde massa spectra en klik op de "nieuwe groep aanmaken van selectie" opdracht in het menu "Groepen" om een groep te maken voor de overeenkomstige isolaat. Wijst een kleur automatisch gebruikt voor deze drie massa spectra.
- Als alternatief definiëren veld staten met bijbehorende kleuren met behulp van de commando's in de "Databasevermeldingen "paneel, dat elke groep op basis van dit gedefinieerd veld gebruikt dezelfde kleur gedefinieerd voor deze groep.
- Voeren cluster analyse. Klik op de "Bereken cluster analyse" opdracht in het menu "Clustering". Op de Vergelijking instellingen Page 1, selecteert u de "Pearson correlatie" en laat andere parameters als standaard. Op pagina 2, selecteert u "UPGMA". Klik vervolgens op "Finish".
- Het verkrijgen van een MDS plot met behulp van de "Multi-dimensionale scaling ..." commando in het menu "Statistieken".
- Peak matching
- Klik op het spectrum soort "Maldi" in de "Experimenten" paneel. Selecteer vervolgens "Layout> Show image". Spectra worden als gel bands.
- Voeren piek matching met behulp van de "Doe piek matching" opdracht in het menu "Spectra".
- Identificatie van piek klassen
- Voeren principale componenten analyse (PCA). Markeer de "Maldi "type experiment in het" experimentele "paneel en de" Principal Components Analysis ... "commando in het menu" statistisch "PCA voeren.
- Voer twee-weg clustering. Klik op de "Statistieken> Matrix mining" ... in het venster "Vergelijking". De intensiteit van de pieken afgestemd op de top klassen vertegenwoordigd met verschillende kleuren (warmte kaart).
5. Bacteriën Identificatie met een aangepaste database
- Gelijkenis-coëfficiënt gebaseerde methode
- Maak een vergelijking en het genereren van een dendrogram gebaseerd op massa spectra bij de "Technische repliceren" niveau, zoals beschreven in stap 4.3.3. Sla het dendrogram voor de vergelijking van de gelijkenis.
- Selecteer een onbekende massa spectrum, en klik op de "Analyse> Identificeer geselecteerde items". Het dialoogvenster identificatie verschijnt.
- Selecteer de "Vergelijking op basis van" classifier type (of een opgeslagen Classifier) en klik op "volgende". Op de volgende pagina kiest u de opgeslagen dendrogram als referentie vergelijking en klik op "volgende".
- Kies de "Basic gelijkenis" als identificatiemethode en klik op "volgende".
- Kies de "Maximum gelijkenis" als scoringsmethode. Typ in passende drempelwaarden en minimaal verschil waarden voor elke parameter en klik op "volgende".
- Nadat de berekeningen zijn voltooid, wordt de identificatie venster. In de "Resultaten" paneel, worden de leden van de database die het beste passen bij het onbekende vermeld.
- Sla het project identificatie en validatie van de identificatie met behulp van de "cross-validatie analyse" commando in de "Identification project" paneel.
- Potentiële-biomarker gebaseerde methode
- Definieer piek klassen. In het venster "Matrix Mining", selecteer sets van pieken delen van gemeenschappelijke kenmerken en definieer deze pieken als specific piek klassen (potentiële biomarkers) met behulp van "Spectra> Beheer soorten piek klasse ..." in het venster "Vergelijking".
- Hier definieert piek klassen specifiek voor elk isolaat van alle 15 isolaten.
- Selecteer de massaspectra van onbekenden en overeenkomen met de toppen van deze spectra met de gedefinieerde piek klassen zoals eerder beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De databases gebouwd in deze demonstratie had vier niveaus, van hoog naar laag niveau, met inbegrip van "Alle niveaus", "Species", "Biologische repliceren" en "Technische repliceren", respectievelijk (Figuur 1A). De "Technische repliceren" niveau bevatte alle voorbewerkte spectra van technische replica. De "Biologische repliceren" en "Species" niveaus die de composiet (samenvatting) spectra. "Alle niveaus" bevat alle technische repliceren spectra alsmede de samengestelde spectra.
Spectrum samenvatten procedures zijn weergegeven in figuur 1 met representatieve pieken. Elk lid massaspectrum verschijnt als een dunne grijze lijn. De samengestelde spectrum wordt weergegeven als een lijn kleur rood. Aangrenzende pieken zijn gemarkeerd met een andere kleur gemakkelijker visueel onderzoek (Figuur 1B) mogelijk.
Tabel 1. De hoogste reproduceerbaarheid was 98,0 ± 1,4 voor Bacillus species B, en de laagste reproduceerbaarheid 89,4 ± 7,8 voor Curvibacter soorten (Tabel 1).
Cluster analyse op de biologische repliceren niveau vergemakkelijkt visualisatie van de hiërarchische structuur in de complexe massa spectra data. Zoals getoond in figuur 2, samen biologische replicaten geclusterd en 15 soorten bacteriën gevormde 15 clusters. Nauw verwante species, bijvoorbeeld B. sp. A, B, D en E, de neiging te bundelen. Echter, uitlopers, bijvoorbeeld B. sp. C en F werden ook waargenomen. MDS krommen gebaseerd op de massaspectra in de "Technische en biologische" niveaus worden weergegeven in figuur 3. MDS pkavels leverde een heldere, 3-visualisatie van de overeenkomsten tussen spectra van deze bacteriën. Zowel technische replicaten en biologische replicaten vertoonde een soortgelijke groepering (Figuur 3 A en B).
Extra matching werd gebruikt om reeksen pieken in massaspectra onderscheiden. Peak matching parameters, met inbegrip van constante tolerantie (punten op de x-as), lineaire tolerantie (ppm) en piekdetectie tarief moet worden opgegeven door de gebruiker. Constant tolerantie en lineaire tolerantie zijn de factoren gebruikt om de positie tolerantie van de pieken met behulp van de vergelijking te berekenen: positie tolerantie = constant tolerantie + lineaire tolerantie × m / z. Met toenemende m / z, het belang van de constante tolerantie vermindert. Piekdetectie tarief betekent dat alleen als er een piek is te vinden op die positie voor meer dan de gedefinieerde snelheid van de spectra, is een piek klasse gemaakt. Een piek op een of meer patronen vertegenwoordigt een piek klasse. Bijvoorbeeld, als de piek detectie Equals 10%, kan een piek klasse alleen plaatsvinden indien meer dan 10% van de spectra pieken op die positie. Dit sluit lage prevalentie pieken (meestal geluidspieken) in een set met technische herhalingen. Als de set is gebaseerd op de samengestelde spectra van biologische herhalingen, kan het nodig zijn dit aantal lager te zijn zo laag prevalentie pieken zijn al uitgefilterd tijdens het maken van de samengestelde spectra. In deze demonstratie werd piek overeenkomende uitgevoerd met massaspectra in de "Technical repliceren" -niveau en de waarden van deze parameters waren 1.9, 550 en 10%, respectievelijk. Op basis van geselecteerde parameters, werden pieken beschouwd als aanpassing of niet passen, waardoor verschillende piek groepen. Een voorbeeld van piek overeenkomende resultaten wordt getoond in figuur 4 met 30 herhalingen van één isolaat (A Bacillus species). De overeenkomende resultaten werden gevisualiseerd als een tabel waarin de rauwe intensiteit aanwezig als kleuren zijn. Blauw geeft een lage intensiteit en rood geeft een hoge intensity. Op basis van de piek overeenkomende resultaten kunnen gebruikers piek klassen die vergemakkelijken vervolganalyses definiëren.
Beide principal component analysis (PCA) (aanvullende figuur 1) en twee-weg clustering kan worden gebruikt om de complexe piek klassen analyseren. Een representatieve tweeweg clustering resultaat met massaspectra in de "Technical repliceren" niveau in figuur 5. Twee dendrograms getoond. Een naast de m / z-waarden en de andere boven de bacterie artikelen (figuur 5). Piek intensiteit werd vertegenwoordigd door de kleuren waarin groen geeft een lage intensiteit en rood geeft een hoge intensiteit. Bijvoorbeeld, B. sp. A en F delen zeer weinig piek klassen met B. sp. B en D (figuur 5). Nader onderzoek bleek dat B. sp. B en D hebben ook sets van soortspecifieke piek klassen (figuur 5). Deze resultaten geven aan dat specifieke piek sets delen cert ain kenmerken kunnen worden gedefinieerd als species-niveau potentiële biomarkers. Bijvoorbeeld, dertien piek sets die tot B. sp. D werden geselecteerd en gedefinieerd als piek klassen (potentiële biomarkers) van B. sp. D, met inbegrip van 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1 en 7849,1 (tabel 2). Extra klassen van verschillende isolaten kunnen worden weergegeven in verschillende kleuren (aanvullend figuur 2). Extra klassen specifiek voor elk isolaat werden in Tabel 2. Gedefinieerd piek klassen werden verder handmatig gecontroleerd zodat ze verschenen alle technische replicaten met een minimale lichtsterkte van 100 au Voorts kan subsets van piek klassen worden opgeslagen karakterisering bacteriën vergemakkelijken de ondersoort en / of rekniveaus bijvoorbeeld pathogene stammen onderscheiden van niet-pathogene stammen en / of antibiotische resistentie / gevoeligheid onderzocht.
ent "> Voor identificatie massaspectra blind gecodeerde isolaten werden verzameld en voorbewerkt op dezelfde wijze als de referentie massaspectra in de databases. Voor identificatie gebaseerd op vergelijking van gelijkheidscoëfficiënten werden parameterwaarden aangegeven met de maximale gelijkenis bij 95.0% en de gemiddelde overeenkomst 87%. Min overeenkomst niet is opgegeven (dwz er geen controle). De minimale verschilwaarden werden als 5 voor het maximale gelijkenis en gemiddelde gelijkenis. Deze waarden moet verder worden geoptimaliseerd toenemen het percentage correcte identificatie. Figuur 6 toont de identificatie resultaten op basis van vergelijkingen van gelijkheidscoëfficiënten (figuur 6). De bijbehorende resultaat suggereerde dat deze blinde gecodeerde bacterie was waarschijnlijk B. sp. A. Deze identificatieproject basis van de vergelijking van gelijkenis coëfficiënt werd verder gevalideerd door cross-validatie (aanvullende figuur 3 (aanvullende figuur 3). Interessant kruisvalidatie identificatie projecten die de vergelijking van piek klassen is veel sneller dan op basis van de vergelijking van overeenstemming coëfficiënt.Identificatie kan ook worden ingevuld op basis van de piek klasse matching (aanvullende figuur 4). Echter mismatches pieken waargenomen (aanvullend figuur 4). De mismatches kan door een massaverschuiving gevolg van aminozuuruitwisselingen in de respectieve eiwitten. De pieken niet geëvenaard kan ook zijn pieken die niet onderscheidend op het niveau van soorten, maar zijn specifiek voor deze stam of te isoleren. Samen genomen, our resultaten suggereren dat zowel identificatiemethoden - gelijkenis coëfficiënt en-biomarker gebaseerde - gemakkelijk kan identificeren bacteriën op species niveau van karst omgevingen met behulp van de monstervoorbereiding, spectrum acquisitie en data-analyse workflow hier beschreven.
Figuur 1. Database constructie en massaspectra samenvatting structuur van databanken geconstrueerd deze demonstratie (A).; Illustratie van de piek samenvatten met behulp van pieken van 10 technische replica van Aminobacter soorten A (B).
Figuur 2. Dendrogram van de composietmassa spectra bij de biologische repliceren niveau. De dataset bevat spectra van 15 verschillende soorten met drie composiet spectra voor elke soort. Elke soort werd gecodeerd met een kleur.
Figuur 3. Multi-dimensionale scaling (MDS) representaties van massaspectra op technisch repliceren niveau 30 spectra voor elke soort (A) en biologische repliceren niveau drie composiet spectra voor elke soort (B). Kleuren gecodeerd werden dezelfde kleuren zoals in figuur 2.
Figuur 4. Een illustratie van piek bijpassende tafel. Tafel werd gegenereerd op basis van de massa spectra van Bacillus soorten A bij de technische repliceren level. De waarden van de piek matching parameters waren 1,9 voor een constante tolerantie, 550 voor lineaire tolerantie en 10% voor de piek detectie, respectievelijk. Blauw geeft lage piek intensiteit en rood geeft hoge piek intensiteit. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Een illustratie van twee-weg clustering. Figuur werd gegenereerd met behulp van massa spectra op technisch repliceren niveau. Kleuren van de isolaten werden gecodeerd als dezelfde kleuren als gebruikt in figuur 2. Peak intensiteit wordt vertegenwoordigd door kleuren, groen betekenis lage intensiteit en rode betekenis hoge intensiteit. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Bacterie identificatie op basis van vergelijking van de gelijkenis coëfficiënt met behulp van aangepaste database.
| ID een | Bron | Dichtstbijzijnde relatieve b / Stam / Klasse | Toetreding # (dichtstbijzijnde relatieve b) | % Similarity | BioNumerics sleutel | Reproduceerbaarheid (%) |
| D2 | Droge speleothem | Bacillus sp. E-257 / Firmicutes | FJ764776.1 | 98.8 | Bacillus soorten A | 94.9 ± 4.0 |
| D7 | Droge speleotzoom | Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes | FJ348039.1 | 99.0 | Bacillus soorten B | 98.0 ± 1.4 |
| F1 | Flow steen | Bacillus niacine stam M27 / Firmicutes | KC315764.1 | 99.2 | Bacillus soorten C | 96,5 ± 2,4 |
| F4 | Flow steen | Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes | FJ348046.1 | 99.1 | Bacillus soorten D | 89.8 ± 8.8 |
| F9 | Flow steen | Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes | EU124558.1 | 99.4 | Bacillus soorten E | 96,5 ± 1,9 |
| R10 | Druipsteen druppelen | Bacillus sp. K1 / Firmicutes | GU968734.1 99.8 | Bacillus soorten F | 95,4 ± 3,9 | |
| D11 | Droge speleothem | Brevibacillus brevis stam IMAU80218 / Firmicutes | GU125635.1 | 99.5 | Brevibacillus soorten | 94,3 ± 5,8 |
| F14 | Flow steen | Exiguobacterium sp. ZWU0009 / Firmicutes | JX292087.1 | 99.3 | Exiguobacterium soorten | 96.5 ± 2.5 |
| M7 | Vochtige speleothem | Brevibacterium sp. N78 / Actinobacteria | HQ188605 | 97.6 | Brevibacterium soorten A | 97.5 ± 2.0 |
| M14 | Vochtige speleothem | Kocuria rhizophila stam Ag09 / Actinobacteria | EU554435.1 | 100 | Kocuria soorten | 95.2 ± 4.1 |
| M15 | Vochtige speleothem | Brevibacterium sp. MN3-3 / Actinobacteria | JQ396535.1 | 99.5 | Brevibacterium soort B | 92,1 ± 4,9 |
| R4 | Druipsteen druppelen | Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria | FJ711220.1 | 99.9 | Aminobacter soorten A | 95,4 ± 2,7 |
| F5 | Flow steen | Comamonas testosteroni stam NRBC 12047 / β-Proteobacteria | AB680219 | 100 | Comamonas soorten | 96.4 ± 2.6 |
| R8 | Druipsteen druppelen | Curvibacter delicates / β-Proteobacteria | AB680705 | 97.0 | Curvibacter </ Em> soorten | 89.4 ± 7.8 |
| F8 | Flow steen | Moraxella sp. 19.2 KSS / γ-Proteobacteria | HE575924.1 | 99.9 | Moraxella | 92,6 ± 4,9 |
een Bacteriën werden geïsoleerd uit Kartchner Caverns, AZ, Verenigde Staten en geïdentificeerd met behulp van 16S rDNA sequencing. Twee primers, 27f (5 'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') en 1492r (5 'GGT TAC TAC CTT GTT ACG ACT T 3') werden gebruikt om bijna 1400 bp lengte 16S rRNA gen sequenties te verkrijgen.
B Op basis van een BLAST-onderzoek van de NCBI database.
C-waarden gemeld zijn de gemiddelde correlatiecoëfficiënten van 30 herhalingen (drie biologische herhalingen elk met 10 technische replica) ± één standaarddeviatie.
Tabel 1. Bacteriën isolaten gebruikt in de demonstratie.
| BioNumerics sleutel | Piek klassen / Potentieel biomarkers (Da) |
| Bacillus soorten A | 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3 |
| Bacillus soorten B | 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2 |
| Bacillus soorten C | 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3 |
| Bacillus soorten D | 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1 |
| Bacillus soorten E | 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2 |
| Bacillus soorten F | 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9 |
| Brevibacillus soorten | 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2 |
| Exiguobacterium soorten | 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2 |
| Brevibacterium soorten A | 3053,3, 6104,8, 6146,5 |
| Kocuria soorten | 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7 |
| Brevibacterium soort B | 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3 |
| Aminobacter soorten A | 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4 |
| Comamonas soorten | 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6 |
| Curvibacter soorten | 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7 |
| Moraxella | 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6 |
Tabel 2. Peak klassen (Potentiële biomarkers) (Da) gedefinieerd voor elke soort.
Aanvullende Figuur 1. Principe component analyse (PCA) van de massa spectra bij The repliceren technisch niveau (A) en de piek klassen (B). Kleuren gecodeerd werden dezelfde kleuren als in figuur 2.
Aanvullende Figuur 2. Een illustratie van piek klassen gekozen op basis van twee-weg clustering. Extra klassen met dezelfde label wordt gekleurd met dezelfde kleur.
Aanvullende 3. Cross-validatie resultaten van de identificatie van projecten op basis van de aangepaste databases in BioNumerics figuur.
Aanvullende Figuur 4. Bacterie identificatie op basis van de piek matching met behulp van aangepaste databases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze demonstratie toonde gedetailleerde procedures van karakterisering en identificatie van bacteriën met behulp van MALDI-TOF MS en een aangepaste database. In vergelijking met traditionele moleculaire methoden, bijvoorbeeld 16S rDNA sequencing, MALDI-TOF MS basis vingerafdruk van methoden snellere identificatie van diverse bacteriën. Door zijn robuustheid, wordt deze techniek veel gebruikt om bacteriën, virussen, schimmels en gist kenmerken uit de omgeving en in klinische settings 1,14-16. Bovendien heeft MALDI-TOF MS gerapporteerd waardoor in sommige gevallen hogere taxonomische resolutie 1. Bijvoorbeeld, B. sp. A, B, D en E, maar lijken voornamelijk te zitten elkaar (figuur 2), werden duidelijk gescheiden en de gelijkenis tussen de spectra van verschillende B. sp. minder dan 80% (figuur 2). In tegenstelling, de 16S rDNA sequenties van deze isolaten hadden hoge gelijkenis, die niet konden worden gebruikt om deze isolaten differentiërenop het niveau van soorten. De 16S rDNA sequenties van B. sp. B en D hebben 99% gelijkenis via multiple alignment analyse, terwijl de sequenties van B. sp. A en E tonen 95% en 96% gelijkenis, respectievelijk de sequenties van B. sp. B en D. Uitschieters werden ook waargenomen. Bijvoorbeeld, B. sp. C en F gegroepeerd buurt van andere B. sp. (Figuur 2). Het uiterlijk van uitschieters isolaten wijst dat de clustering analyse van massaspectra fylogenetische relaties niet noodzakelijk vast. De omgeving waaruit isolaten werden verkregen kan ook invloed hebben op de massa spectra clustering. Bijvoorbeeld, Brevibacterium species B Kocuria soorten die werden geïsoleerd tegen vochtige speleothem en B. sp. F, die werd geïsoleerd uit stalactieten druppelen de neiging om samen (Tabel 1, Figuur 2) te clusteren, maar verder onderzoek is nodig om te onderzoeken of deze wordt waargenomen in een grotere verzameling van isolAtes.
Deze library gebaseerde techniek heeft ook een aantal beperkingen. Karakterisering is meestal gebaseerd op databases. Huidige commerciële databases worden hoofdzakelijk samengesteld uit bacteriestammen, in het bijzonder pathogene degenen. Deze commerciële databases zijn het meest bruikbaar in de klinische microbiologie lab instellingen. Om het milieu isolaten evenals virussen, schimmels en gisten karakteriseren, moeten deze databases worden gebouwd met behulp van grote stam collecties. De parameters die worden gebruikt in de follow-up analyses moet mogelijk ook worden geoptimaliseerd om de taxonomische resolutie te verhogen, vooral bij de ondersoort en spanning niveaus. Bijvoorbeeld, de S: N voor piekdetectie in deze demonstratie was 10. Deze waarde is geschikt voor species-identificatie, maar stam-identificatie, moet deze waarde worden verlaagd. Aangezien deze verwerking parameters alsmede gegevens verwerken workflows worden soms de gebruiker gedefinieerde in veel softwarepakketten, bijvoorbeeld ClinProTools en BionumeRICS, een optimalisatie van parameterwaarden en selectie van geschikte workflows zal waarschijnlijk nodig zijn om data-analyse te optimaliseren. In deze demonstratie, piek matching parameters, drempelwaarden die worden gebruikt bij de identificatie van projecten, en cross validatie alle benodigde optimalisatie om correcte identificatie tarieven te verbeteren. Een werkwijze en / of procedure om deze parameters te optimaliseren is van groot belang voor ons laboratorium. Bijvoorbeeld, zou één benadering statistische factorieel ontwerp, dat we onlangs gebruikt voor het optimaliseren van MALDI-TOF geautomatiseerde data-acquisitie 17 te betrekken. Extra toekomstige toepassingen en verbetering van MALDI-TOF MS-gebaseerde microbiële fingerprinting omvatten bouw van veelgebruikte, grotere databases milieu bacteriën en / of niet-bacteriële micro-organismen en karakterisering van gemengde culturen 18 en microbiële gemeenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
- Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
- Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
- Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
- Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
- Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
- Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
- Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
- Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
- Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
- Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
- Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
- Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
- Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
- Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
