Protocol
Внимание: Неизвестные бактерии из любой среды может быть патогенным и должны быть обработаны с осторожностью, используя соответствующие протоколы биобезопасности. Работа с живыми культурами должны быть выполнены в корпусе класса II биобезопасности с помощью биологической безопасности уровня 2 (BSL-2) процедуры. Более подробная информация о BSL-2 процедур доступен в руководстве CDC / NIH под названием "биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях," страниц 33-38. Документ доступен в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), в том числе халатах / платья, защитные очки и нитрильных или латексные перчатки, должны носить. Стандартные микробиологические методы и меры предосторожности должны быть соблюдены, и биологически опасные отходы должны быть уничтожены соответственно.
Бактерии, используемые в этой демонстрации были выделены из Kartchner пещеры,AZ, USA, один из четырех сред, в том числе сухой Натёчные образования, расход камня, влажной Натёчные образования и сталактитов капельно (таблица 1). Все изоляты были идентифицированы 16S рДНК последовательности и выдерживают при -80 ° С в 25% глицерин-R 2 B среде. Все эксперименты были выполнены при комнатной температуре.
Примечание: Мы рекомендуем использовать тот же метод подготовки пробы приобрести масс-спектры для строительства базы данных и масс-спектров неизвестных. Пример способ получения, как было показано ранее, чтобы повлиять на качество спектра и воспроизводимость 3. Использование другого метода подготовки образца может привести к неправильной идентификации неизвестных, особенно при более высоких таксономических разрешение (например, на уровне деформации) желательно.
1. Нанесение на MALDI мишени
Внимание: несколько протоколов, чтобы получить белковые экстракты требуют использования кислот и органических растворителей, которые должны быть использованы в соответствии с GUIDelines и информация, содержащиеся в соответствующих листов по безопасности применения материалов (MSDS). Соответствующие средства индивидуальной защиты должны носить и будет варьироваться в зависимости от типа и объема используемых химикатов (например, халатах / платья, перчатки, защитные очки и средства защиты органов дыхания должны быть использованы при работе со значительными количествами токсичных, легковоспламеняющихся растворителей, таких как ацетонитрил, и коррозионные кислоты, такие как муравьиная и трифторуксусной кислоты).
- Депозит 1 мкл белкового экстракта, не содержащего жизнеспособные клетки (полученные с использованием соответствующих, описанных ранее протоколов 11-13) на нержавеющей стали MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть. Наложение сухого экстракта белка с раствором матрицы 1 мкл (α-циано-4-гидрокси-коричной кислотный раствор), и дайте ему высохнуть.
- Для каждого биологического репликации, место соответствующее количество технических повторов (от 5 до 20 технические Копировщиков). Здесь, место 10 технических повторов для каждого биологического репликации и 3 биологических повторяет Wпрежде чем подготовлены.
Примечание: Мы рекомендуем использовать полированную MALDI стали мишень при использовании метода пробоподготовки экстракции белка. Использование шлифованной стали целевые пластины может привести к распространению и непреднамеренное смешение различных проб за пределами отдельных образцов скважин. - Депозит 1 мкл калибрующего стандарт на целевой пластине и дайте ему высохнуть. Наложение с матричным раствором 1 мкл и дайте ему высохнуть.
- Депозит 2 мкл раствора матрицы на целевой пластине в качестве отрицательного контроля.
2. Масс-спектр Приобретение
- Используйте масс-спектрометра MALDI-TOF оснащен лазерным азота (λ = 337 нм) и управляется с помощью программного обеспечения Bruker Flexcontrol.
- Соберите каждый масс-спектр в положительном линейном режиме накоплением 500 лазерных выстрелов в 100 с шагом выстрел. Установите напряжение источника ионов 1 до 20 кВ; ионный источник 2 напряжения 18,15 кВ; и объектив напряжения 9,05 кВ. Обратите внимание, что эти параметры являются инструментом, удельнаяFIC и может потребовать корректировки на другие инструменты для получения оптимальных результатов.
- Установите диапазон массы к заряду для автоматизированного оценки спектра от 2 до 20 кДа на одной зарядке. Используйте центра тяжести алгоритм пик обнаружения. Установите минимальное разрешение порог в 100 Da. Установите сигнал-шум (S: N) порога, при 2. Установите порог минимальной интенсивностью 100.
3. База данных Строительство
- Проектирование базы данных
- Создать новую базу данных в BioNumerics 7,1 с помощью «Мастера нового базы данных".
- Создать спектра типа эксперимента, например, MALDI, с помощью команд "Типы эксперимент" панели.
- Создавайте уровни с помощью "проектирования баз данных панели". Добавить новые уровни с помощью «уровня> Добавить новый уровень ..." в меню "База данных". Здесь, создавать «видов» уровне, уровне «Биологические REPLICATE" "и" Технические REPLICATE "Level respectivЭли.
- Импорт и предварительной обработки спектров сырой массы
- Экспорт сырой масс-спектры, как .txt файлов с помощью FlexAnalysis, нажав на команду "Экспорт> Масс-спектр" в меню "Файл".
- Импорт сырой масс-спектры (файлы с расширением .txt) в базе данных по уровню технических повторяет.
- Предварительная обработка спектров сырой массы.
- Импорт и частоты дискретизации (используя квадратичную алгоритм подбора).
- Выполнение базового вычитание (с прокатки диска с размером 50 пунктов).
- Вычислить шум [Непрерывный вейвлет-преобразования (CWT)], гладкая (Kaiser окно с размером окна 20 пунктов и бета 10 очков), а также выполнять второй Вычитание (прокат диск с размером 200 точек).
- Обнаружение пиков [CWT с минимальным отношением сигнала к шуму (S: N) из 10].
- После предварительной обработки, сохранения характерные модели каждого масс-спектра, такие как пик списков, содержащих пикразмеры, пик интенсивности, S: N, и т.д., в базе данных.
- Создание составного масс-спектров
- Создать составной спектры от предварительно обработаных спектров с помощью команды "подвести итог ..." в меню "Анализ". Выберите «Биологический копировщика" как целевого уровня.
- Здесь, объединить масс-спектры 10 технических повторов одного и того же колонии для получения композитного масс-спектр для этого колонии, в результате чего три композитных масс-спектров для этого изолята на уровне «Биологические реплик".
- Здесь приводится краткое описание трех композитный спектры для создания одного составного спектра для этой изолировать на уровне «видов».
Примечание: композитный спектр средняя точка за точкой технических повторяет. Репликация с подобия (корреляции Пирсона) в среднем ниже, чем 95% (значение по умолчанию) исключены из композита. Пики на спектрах композитного только вызывается, если они присутствуют в 75% (настройка по умолчанию) включенных повторов. Для биологических повторностей, эти параметры были 90 и 60%, соответственно.
Анализ 4. Массовая спектральных данных
- Выберите записи в базе данных и создать сравнение, нажав на команду «Создать новый сравнение" в "Сравнения" панели.
- Вот, используйте масс-спектры в разделе "Технические репликации" и / или "Биологическое повторных" уровней, чтобы показать сравнения и анализа.
- Сходство на основе кластерного анализа и многомерное шкалирование (MDS)
- Создание групп с цветами. Выберите биологических спектров двух композитных масс и нажмите кнопку "Создать новую группу из выделения" команды в меню "Группы", чтобы создать группу для соответствующего изолята. Назначить цвет автоматически, используемые для этих трех масс-спектров.
- Кроме того, определить состояний поля с соответствующими цветов с помощью команды в "База данных записей "панели, таких, что любая группировка на основе этого определенного поля используется тот же цвет, определенный для этой группы.
- Выполните кластерный анализ. Выберите команду "Вычислить кластерный анализ" в меню "кластеризации". На настроек сравнения Страница 1, выберите "корреляции Пирсона" и оставить другие параметры по умолчанию. На странице 2, выберите "UPGMA". Затем нажмите кнопку "Готово".
- Получить участок MDS, используя "многомерного шкалирования ..." в меню "Статистика".
- Пик соответствия
- Щелкните на типе спектра "MALDI" в "Опыты" панели. Затем выберите "Макет> Показать изображение". Спектры показаны как гель полос.
- Выполните пик соответствия, используя команду "Do пик соответствия" в меню "Spectra".
- Идентификация пиков классов
- Выполните анализ главных компонент (PCA). Выделите "MALDI "типа эксперимент в" экспериментальной "панели и использовать" Основные компоненты Анализ ... "в меню" Статистическом "для выполнения СПС.
- Выполните двустороннюю кластеризацию. Нажмите "Статистика> Горно-матрицы" ... в окне "Сравнение". Интенсивность пиков подобранных к пиковым классов представлены с использованием различных цветов (тепловая карта).
5. Бактерии Идентификация с пользовательской базы данных
- Сходство коэффициентный метод на основе
- Создать сравнение и генерировать дендрограмму на основе масс-спектров на уровне "Технические реплик», как описано в шаге 4.3.3. Сохраните дендрограмму для сравнения сходства.
- Выберите неизвестный масс-спектр, и нажмите кнопку "Анализ> Определить выбранные записи". Появится диалоговое окно идентификации.
- Выберите "Сравнение на основе" тип классификатору (или хранимой объявлМЭО) и нажмите "Далее". На следующей странице выберите сохраненный дендрограмму в качестве эталонного сравнения, а затем нажмите "Далее".
- Выберите "принципиальное сходство" как метод идентификации и нажмите кнопку "Далее".
- Выберите "Максимальная сходство» как метод скоринга. Введите соответствующие пороговые значения и минимальные значения разности для каждого параметра, а затем нажмите "Далее".
- После того, как расчеты завершены, появляется окно идентификации. В «Результаты» панели, члены базе данных, которая наилучшим образом соответствуют неизвестное перечислены.
- Сохранить в определение проекта и проверки идентификации, используя команду "Перекрестная проверка анализа" в "Идентификация проекта" панели.
- Потенциал метод биомаркеров на основе
- Определить пиковые классы. В окне "Матрица Mining", выбрать группы пиков, имеющих общие характеристики и определить эти пики как SPECIFIC пик классы (потенциальные биомаркеры) с использованием "Spectra> Управление типами пик класса ..." в окне "Сравнение".
- Здесь определяют пиковые классы, специфичные для каждого изолята для всех 15 изолятов.
- Выбор масс-спектры неизвестных и соответствуют вершины этих спектров с определенными классами пик, как описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Базы данных, построенные в этой демонстрации было четыре уровня, от самого высокого до самого низкого уровня, в том числе "всех уровнях", "вид", "биологическом репликации" и "Технические репликации", соответственно (рис 1А). "Технические реплику" уровень содержится вся предобработанных спектры технических повторяет. "Биологическая реплику" и "вид" уровни содержится композитный (резюме) спектров. "Все уровни" содержатся все технические спектры REPLICATE, а также все композитный спектры.
Процедуры реферирования спектра показано на рисунке 1 с использованием репрезентативных пики. Каждый масса членом спектр выглядит как тонкая серая линия. Композиционный спектр представлен в виде линии красным цветом. Смежные вершины помечены другим цветом, что облегчает визуальный осмотр (рисунок 1b).
таблице 1. Высокая воспроизводимость была 98,0 ± 1,4 для Bacillus вида B, а самый низкий воспроизводимость была 89,4 ± 7,8 для видов Curvibacter (Таблица 1).
Кластерный анализ на биологическом уровне реплику способствовало визуализации иерархической структуры в сложных данных масс-спектров. Как показано на фиг.2, биологических повторяет сгруппированы вместе, и 15 видов бактерий образуется 15 кластеров. Близкородственных видов, например, В. П.. А, В, D и Е, как правило, группируются вместе. Тем не менее, выбросы, например, В. П.. С и F, также не наблюдалось. MDS участки, основанные на масс-спектров на "техническую и биологическую" уровней приведены на рисунке 3. MDS рмного дали ясное, 3-D визуализацию сходства между спектрами этих бактерий. Как технические, так повторов и биологических повторяет показали сходную группировку (рис 3, б).
Пик был использован соответствующий различать наборы пиков в масс-спектрах. Пик параметры соответствия, в том числе постоянной толерантности (точек на оси абсцисс), линейный толерантности (частей на миллион) и пиковой скорости обнаружения должны быть указаны пользователем. Постоянная терпимости и линейный терпимость факторов, используемых для расчета терпимости положение пиков с помощью уравнения: толерантность положение = постоянный допуск + линейный терпимости × м / г. С увеличением т / г, значение константы толерантности уменьшается. Пиковая скорость обнаружения означает, что только тогда, когда пик находится в этом положении в течение более определенной скоростью спектров, пик класса выполнен. Пик на одном или нескольких шаблонов представляет собой пиковую класс. Например, если частота обнаружения пика EQUALs 10%, пик класс может быть сделано только тогда, когда более чем 10% от спектров имеют пики при положении. Это исключает низкая распространенность пики (обычно шума пиков) в комплекте с техническим повторов. Если множество основан на композиционной спектров биологических повторяет, это число может должны быть ниже, так как низкие пики распространенности уже отфильтрованы при создании составного спектра. В этой демонстрации, пик соответствующий проводили с использованием масс-спектры на уровне "Технический реплик" и значения этих параметров были 1,9, 550 и 10%, соответственно. На основе выбранных параметров, пики рассматривать как соответствие или не соответствие, что приводит к различным группам пиков. Пример пиковых результатов сопоставления показано на рисунке 4, с использованием 30 повторов одной изолята (виды Bacillus а). Результаты согласования визуализировали в виде таблицы, в которой исходные интенсивности присутствуют в цветах. Синий свидетельствует о низкой интенсивности и красный указывает на высокий Intensity. Основываясь на результатах пик соответствия, пользователи могут определять пиковые классы, которые облегчают наблюдение анализа.
И анализ главных компонент (PCA) (Дополнительный рисунок 1) и двусторонней кластеризация может быть использована для анализа сложных пиков классы. Представитель двусторонний кластеризации результат с помощью масс-спектров на уровне "Технические реплик" показан на рисунке 5. Два дендрограммы показаны. Одним из них является рядом значений / г м, а другой выше элементов бактерий (фиг.5). Пик интенсивности была представлена цветов, которые зеленый цвет означает, низкой интенсивности и красный указывает на высокую интенсивность. Например, В. П.. И F поделиться очень мало пиков классы с Б. Sp. В и D (фиг.5). Закрыть экспертиза показала, что Б. Sp. B и D также наборы видоспецифичных пиковых классов (рисунок 5). Эти результаты показывают, что специфические множества пика обмена сертификат Ain характеристики могут быть определены в качестве потенциальных маркеров вида уровня. Например, тринадцать множества пика принадлежащий Б. SP. D, были отобраны и определяется как пик классов (потенциальных биомаркеров) Б. Sp. D, в том числе 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1 и 7849,1 (таблица 2). Пик классы различных изолятов могут быть показаны в различных цветах (Дополнительный рисунок 2). Пик классы, специфичные для каждого изолята были приведены в таблице 2. Выраженный пик классы были дополнительно проверили вручную, чтобы гарантировать, что они появились во всех технических повторов с минимальной интенсивностью 100 а.е. Кроме того, подмножества пиковых классов также могут быть сохранены, чтобы облегчить характеристику бактерий на подвиды и / или уровней деформации, например, чтобы отличить патогенные штаммы от непатогенных штаммов и / или для изучения устойчивости к антибиотику / чувствительность.
ENT "> Что касается идентификации, масс-спектры слепых кодированием изолятов были собраны и предварительно обработаны таким же образом, как опорный масс-спектров в базах данных. Для идентификации на основе сравнения коэффициентов сходства, значения параметров были определены, в том числе максимального сходства на 95,0%, а средний сходства в 87%. Порог подобия не указано (то есть, их не остановить). минимальную разницу значений были установлены 5 и для максимального сходства и среднего сходства. Эти значения, возможно, должны быть дополнительно оптимизированы, чтобы увеличить Скорость правильной идентификации. Рисунок 6 показывает результаты идентификации, основанные на сравнении коэффициентов подобия (Рисунок 6). соответствующий результат позволяет предположить, что этот слепой кодировкой бактерия, скорее всего, B. Sp. A. Это определение проекта на основе сравнения коэффициент подобия была дополнительно подтверждена перекрестной проверки (Дополнительный рис 3 (Дополнительный рисунок 3). Интересно, что Перекрестная проверка для идентификации проектов, основанных на сравнении пиковых классов гораздо быстрее, чем те, которые основаны на сравнении коэффициента подобия.Идентификация также может быть выполнено на основе пика соответствия класса (Дополнительный рисунок 4). Однако несовпадения наблюдались пики (Дополнительный рисунок 4). В несоответствие может быть связано с сдвига массы в результате обмена аминокислот в соответствующих белков. Пики не совпадающая также может быть пики, которые не дискриминационный на видовом уровне, но являются специфическими для данного штамма или изолировать. Взятые вместе, оРезультаты ур предположить, что оба метода идентификации - коэффициент подобия и биомаркеров на основе - можно легко определить бактерии на видовом уровне от карстовых средах, использующих подготовку образца, приобретение спектра и анализа данных рабочий процесс, описанный здесь.
Рисунок строительство 1. База данных и масс-спектры обобщение структуры баз данных, построенных в этой демонстрации (A).; Иллюстрация пик обобщения с использованием пиков от 10 технических повторов Aminobacter видов А (В).
Рисунок 2. Дендрограмма композитныйМасс-спектры на биологическом уровне репликации. Набор данных содержит спектры 15 различных видов с тремя композитного спектров для каждого вида. Каждый вид был закодирован с цветом.
Рисунок 3. многомерного шкалирования (MDS) представления масс-спектров на техническом уровне репликацию с 30 спектров для каждого вида (А) и биологическом уровне репликацию с двух композитных спектров для каждого вида (B). Цвета были закодированы как же цветов Используемый на фиг.2.
Рисунок 4. Иллюстрация пик соответствующей таблицы. Таблица были получены на основе масс-спектров Bacillus видов А в техническом реплик урол. Значения параметров пика соответствия были 1,9 для постоянного толерантности, 550 для линейного толерантности и 10% для максимальной скорости обнаружения, соответственно. Синий свидетельствует о низкой пиковой интенсивности и красный указывает на высокую пиковую интенсивность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок 5. иллюстрация двусторонней кластеризации. Рисунок был создан с помощью масс-спектров на техническом уровне репликации. Цвета изолятов были закодированы как же цветов, как и в диаграмме 2. Пик интенсивности представлены цвета, зелёный смысл низкой интенсивности и красного смысла высокой интенсивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок идентификация 6. Бактерия, основанный на сравнении коэффициента подобия, используя пользовательскую базу данных.
| ID | Источник | Ближайший родственник б / Тип / Класс | Присоединение # (ближайший родственник б) | % Сходство | Ключ BioNumerics | Воспроизводимость (%) |
| D2 | Сухой Натёчные образования | Bacillus зр. E-257 / Firmicutes | FJ764776.1 | 98,8 | Bacillus видов | 94,9 ± 4,0 |
| D7 | Сухой speleotкромка | Bacillus зр. GGC-P3 / Firmicutes | FJ348039.1 | 99,0 | Bacillus видов B | 98,0 ± 1,4 |
| F1 | Поток камень | Bacillus ниацин напрягать M27 / Firmicutes | KC315764.1 | 99,2 | Bacillus видов C | 96,5 ± 2,4 |
| F4 | Поток камень | Bacillus зр. GGC-P5A1 / Firmicutes | FJ348046.1 | 99,1 | Bacillus видов D | 89,8 ± 8,8 |
| F9 | Поток камень | Bacillus зр. OSS 19 / Firmicutes | EU124558.1 | 99,4 | Bacillus видов E | 96,5 ± 1,9 |
| R10 | Stalactite капельного | Bacillus зр. K1 / Firmicutes | GU968734.1 99,8 | Bacillus видов F | 95,4 ± 3,9 | |
| D11 | Сухой Натёчные образования | Brevibacillus штамм Brevis IMAU80218 / Firmicutes | GU125635.1 | 99,5 | Brevibacillus виды | 94,3 ± 5,8 |
| F14 | Поток камень | Exiguobacterium Sp. ZWU0009 / Firmicutes | JX292087.1 | 99,3 | Exiguobacterium виды | 96,5 ± 2,5 |
| M7 | Влажный Натёчные образования | Brevibacterium Sp. N78 / Actinobacteria | HQ188605 | 97,6 | Brevibacterium виды | 97,5 ± 2,0 |
| M14 | Влажный Натёчные образования | Штамм Kocuria rhizophila Ag09 / Actinobacteria | EU554435.1 | 100 | Виды Kocuria | 95,2 ± 4,1 |
| M15 | Влажный Натёчные образования | Brevibacterium Sp. MN3-3 / Actinobacteria | JQ396535.1 | 99,5 | Brevibacterium видов B | 92,1 ± 4,9 |
| R4 | Stalactite капельного | Aminobacter Sp. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria | FJ711220.1 | 99,9 | Aminobacter видов А | 95,4 ± 2,7 |
| F5 | Поток камень | Comamonas testosteroni штамм NBRC 12047 / β-Proteobacteria | AB680219 | 100 | Виды Comamonas | 96,4 ± 2,6 |
| R8 | Stalactite капельного | Curvibacter деликатесы / β-Proteobacteria | AB680705 | 97,0 | Curvibacter </ EM> Породы | 89,4 ± 7,8 |
| F8 | Поток камень | Moraxella Sp. 19,2 KSS / γ-Proteobacteria | HE575924.1 | 99,9 | Moraxella виды | 92,6 ± 4,9 |
бактерии были выделены из Kartchner Пещеры, Аризона, США и определены с использованием 16S рДНК последовательности. Два праймера, 27F (5 'AGA GTT TCC TGG ТГА СТС А. 3') и 1492r (5 'TAC TAC GGT GTT CTT ACG ACT T 3'), были использованы для получения около 1400 п.н. длины 16S рРНК генов последовательности.
б основанный на поиске BLAST базы данных NCBI.
С Значения являются средними коэффициенты корреляции 30 повторов (три биологических повторяет каждый с 10 технических повторов) ± одно стандартное отклонение.
Таблица 1. Бактерии изолятов используется в демонстрации.
| Ключ BioNumerics | Пик классы / Потенциальные биомаркеры (DA) |
| Bacillus видов | 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3 |
| Bacillus видов B | 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2 |
| Bacillus видов C | 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3 |
| Bacillus видов D | 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1 |
| Bacillus видов E | 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2 |
| Bacillus видов F | 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9 |
| Brevibacillus виды | 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2 |
| Exiguobacterium виды | 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2 |
| Brevibacterium виды | 3053,3, 6104,8, 6146,5 |
| Виды Kocuria | 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7 |
| Brevibacterium видов B | 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3 |
| Aminobacter видов А | 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4 |
| Виды Comamonas | 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6 |
| Curvibacter виды | 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7 |
| Moraxella виды | 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6 |
Таблица 2. Классы Пик (потенциальные биомаркеры) (DA), определенные для каждого вида.
Дополнительный Рисунок 1. Принцип компонентного анализа (РСА) масс-спектров в гое технический уровень повторной (А) и пик классы (B). Цвета были закодированы как и того же цвета, используемый на фиг.2.
Дополнительный Рисунок 2. Иллюстрация пиковых классов, выбранных на основе двусторонней кластеризации. Пик классы, имеющие ту же метку окрашены тем же цветом.
Дополнительный Рисунок 3. Результаты перекрестной проверки идентификации проекта, основанного на пользовательских баз данных в BioNumerics.
Дополнительный Рисунок идентификация 4. Бактерия на основе пика соответствия с помощью пользовательских баз данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта демонстрация показала, подробные процедуры характеризации и идентификации бактерий с использованием MALDI-TOF MS и пользовательскую базу данных. По сравнению с традиционными методами молекулярной, например, методы, отпечатков пальцев последовательности рДНК 16S, MALDI-TOF MS на основе способствовать более быструю идентификацию различных бактерий. Из-за своей надежности, этот метод широко используется для характеристики бактерий, вирусов, грибков и дрожжей из окружающей среды и в клинических условиях 1,14-16. Кроме того, MALDI-TOF MS сообщалось, с получением, в некоторых случаях, более высоких таксономических разрешение 1. Например, В. П.. А, В, D и Е, но тенденцию группироваться вместе (рисунок 2), были четко разделены и сходство между спектрами различных Б. SP. было меньше, чем 80% (рисунок 2). В отличие от этого, рДНК 16S последовательности этих изолятов были высокое сходство, которое не может быть использовано для различения этих изолятовна видовом уровне. РДНК 16S последовательности B. Sp. В и D имеют 99% сходство на основе анализа множественного выравнивани, а последовательностей Б. SP. А и Е показывают 95% и 96% сходства, соответственно, последовательностей Б. SP. Наблюдались также B и D. Выбросы. Например, В. П.. C и F сгруппированы отдельно от других Б. Sp. (Рисунок 2). Появление анализ вылетающих изолятов показывает, что кластеризация анализ масс-спектров, не обязательно устанавливать филогенетические отношения. Среда, из которой изолирует были получены также может влиять на масс-спектры кластеров. Например, Brevibacterium видов В и виды Kocuria, которые были выделены из влажного Натёчные образования и Б. SP. F, который был выделен из сталактитов капельно, как правило, группируются вместе (Таблица 1, Рисунок 2), но необходимы дальнейшие исследования, чтобы изучить, является ли это наблюдается в большей коллекции изолическихАтеш.
Этот метод библиотечная также имеет некоторые ограничения. Характеристика, как правило, на основе баз данных. Текущие коммерческие базы данных, в основном, состоит из бактериальных штаммов, в частности те, патогенных. Эти коммерческие базы данных являются наиболее полезными в клинических условиях микробиологической лабораторией. Чтобы охарактеризовать экологические изолятов, а также вирусы, грибки и дрожжи, пользовательские базы данных должны быть построены с использованием больших коллекций деформации. Параметры, используемые в последующих анализах может также должны быть оптимизированы для повышения таксономического разрешения, особенно на подвидов и уровней напряжения. Например, S: N используется для обнаружения пика в этой демонстрации было 10. Это значение является подходящим для идентификации уровня разновидностей, но для идентификации уровня напряжения, это значение может должен быть снижен. Так как эти параметры обработки, а также обработки данных рабочие процессы иногда определяемый пользователем во многих программных пакетов, например, ClinProTools и BionumeRICS, оптимизация значений параметров и выбора соответствующих технологических процессов, вероятно, будет необходимо для оптимизации анализа данных. В этой демонстрации, пиковые показатели соответствия, пороговые значения, используемые в идентификации проекта, и кросс проверки всех необходимых оптимизации, чтобы повысить правильные цены, удостоверяющие личность. Чтобы найти способ и / или процедуры для оптимизации этих параметров представляет большой интерес к нашей лаборатории. Например, один подход может включать в себя статистическую факторный план, который мы использовали в последнее оптимизировать MALDI-TOF автоматизированной приобретение 17 данных. Дополнительные будущих приложений и повышение MALDI-TOF MS на основе микробного отпечатков пальцев включают строительство широко доступны, большие базы данных экологических бактерий и / или небактериальных микроорганизмов, а также характеристики смешанных культур 18 и микробных сообществ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
- Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
- Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
- Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
- Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
- Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
- Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
- Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
- Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
- Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
- Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
- Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
- Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
- Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
- Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
