Protocol
Forsiktig: Uidentifiserte bakterier fra alle miljøer kan være sykdomsfremkallende og må håndteres med forsiktighet ved bruk av passende biologisk protokoller. Arbeid med levende kulturer må utføres i en klasse II biosikkerhet skap ved hjelp Biologisk Safety Level 2 (BSL-2) prosedyrer. Mer informasjon om BSL-2 prosedyrer er tilgjengelig i CDC / NIH manuell tittelen "biosikkerhet i Mikrobiologiske og Biomedical Laboratories," sider 33-38. Dokumentet er tilgjengelig online på http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Egnet personlig verneutstyr (PVU), inkludert lab strøk / kjoler, vernebriller, og nitril eller latex hansker, må brukes. Vanlig mikrobiologisk praksis og forsiktighetsregler må følges, og biologisk avfall må kastes på riktig måte.
Bakterier som brukes i denne demonstrasjonen ble isolert fra kartchner Caverns,AZ, USA, fra fire miljøer, inkludert tørr speleothem, flow stein, fuktig speleothem og Dryppsteinene drypp (tabell 1). Alle isolater ble identifisert av 16S rDNA-sekvensering og oppbevart ved -80 ° C i 25% glycerol-R2 B medium. Alle forsøkene ble gjennomført ved RT.
Merk: Vi anbefaler at du bruker den samme prøveopparbeidelse metode for å skaffe massespektra for database konstruksjon og massespektra av ukjente. Prøveopparbeidelse metoden har vist seg tidligere å påvirke spekteret kvalitet og reproduserbarhet tre. Ved hjelp av en annen prøveprepareringsmetode kan forårsake feilaktig identifikasjon av ukjente, spesielt når høyere taksonomisk oppløsning (for eksempel ved strekknivå) er ønsket.
1. avsetning på MALDI Target
Forsiktig: Flere protokoller for å oppnå proteinekstrakter krever bruk av syrer og organiske løsningsmidler som må anvendes i samsvar med guidElines og informasjon som finnes i deres respektive Materialer HMS-datablad (MSDS). Egnet verneutstyr må brukes og vil variere basert på type og mengde kjemikalier som brukes (for eksempel lab strøk / kjoler, hansker, vernebriller og åndedrettsvern må brukes når du arbeider med betydelige mengder av giftige, brennbare løsemidler, som for eksempel acetonitril, og korrosive syrer, slik som maursyre og trifluoreddik-syre).
- Innskudd 1 ul protein ekstrakt inneholder ingen levedyktige celler (innhentet ved hjelp av egnede, tidligere beskrevet protokoller 11-13) på en rustfritt stål MALDI sikteplate og la den tørke. Overlappe tørket protein ekstrakt med 1 pl matriseløsning (α-cyano-4-hydroxy-kanelsyreløsning), og la den tørke.
- For hver biologisk replikere, spot et passende antall tekniske replikater (5 til 20 tekniske replikat). Her, spot 10 tekniske replikater for hver biologisk replikere og tre biologiske replikater were forberedt.
Merk: Vi anbefaler å bruke en polert MALDI stål sikteplate når du bruker protein utvinning prøveopparbeidelse metode. Ved hjelp av bakkestål målplater kan forårsake utilsiktet spredning og blanding av de forskjellige prøver utsiden av de enkelte prøvebrønner. - Innskudd 1 ul kalibrerings standard på måleplate og la den tørke. Overlay med 1 pl matrise løsning og la den tørke.
- Innskudd 2 ul matriseløsningen på skyteskiven som en negativ kontroll.
2. Mass Spectra Acquisition
- Bruk en MALDI-TOF massespektrometer utstyrt med en nitrogen laser (λ = 337 nm) og drives ved hjelp Bruker Flexcontrol-programvaren.
- Samle hver masse spektrum i positiv lineær modus ved akkumulering av 500 laserskudd i 100 skudd trinn. Sett ionekilden en spenning på 20 kV; ionekilde 2 spenning til 18.15 kV; og linsen spenningen til 9,05 kV. Merk at disse parametrene er instrument-spesiFIC og kan kreve justering på andre instrumenter for å oppnå optimale resultater.
- Still masse-til-charge range for automatisert spekteret evaluering fra 2 til 20 kDa per lading. Bruk Tyngdepunktet peak algoritme. Sette minimum oppløsning terskel på 100 Da. Still signal til støyforhold (S: N) terskel på 2. Still minimum intensitet terskel på 100.
3. Database Construction
- Database design
- Lag en ny database i BioNumerics 7.1 ved hjelp av "Ny database wizard".
- Lag et spektrum eksperiment type, for eksempel, MALDI ved hjelp av kommandoer i "Experiment Types" panel.
- Lag nivåene ved bruk av "Database design panel". Legge til nye nivåer ved hjelp av "Level> Legg til nytt nivå ..." kommandoen i "Database" meny. Her, skape "Species" nivå, "Biologisk replikere" nivå "og" Tekniske replikere "nivå, respectively.
- Importere og preprosessering rå massespektra
- Eksportere den rå massespektra som .txt filer ved hjelp FlexAnalysis ved å klikke på "Export> Masse spekteret" kommandoen i "Fil" -menyen.
- Importere rå massespektra (TXT-filer) inn i databasen i nivået på de tekniske replikater.
- Preprocess rå massespektra.
- Import og sampling (ved hjelp av en kvadratisk montering algoritme).
- Utføre en baseline subtraksjon (med en valseplate med en størrelse på 50 poeng).
- Beregne støy [Kontinuerlig Wavelet Transformation (CWT)], glatt (Kaiser Vindu med en vindustørrelse på 20 poeng og beta av 10 poeng), og utføre en ny baseline subtraksjon (rullende plate med størrelse på 200 poeng).
- Detektere toppene [CWT med et minimum signal-til-støy-forhold (S: N) 10].
- Etter forbehandling, spare karakteristiske mønstre av hver massespekteret, slik som topplistene inneholder toppstørrelser, peak intensitet, S: N, etc., i databasen.
- Lage sammensatte masse spektra
- Lag kompositt spektra fra preprocessed spektra ved hjelp av "Oppsummer ..." kommandoen i "Analyse" -menyen. Velg "Biologisk replikere" som target nivå.
- Her kombinere massespektra av 10 tekniske replikater av den samme koloni for å gi et komposittmassespektrum for den koloni, noe som resulterer i tre sammensatte massespektra for at isolatet i "Biological replikere" -nivå.
- Her oppsummerer tre kompositt spektra å lage et sammensatt spektrum for at isolere på "Species" nivå.
Merk: Det sammensatte spekteret er punkt-for-punkt gjennomsnitt av de tekniske replikater. Replikerer med en likhet (Pearson korrelasjon) til gjennomsnittet av lavere enn 95% (standardinnstilling) er utelukket fra kompositt. Toppene på den sammensatte spektra er bare kalt hvis de er til stede i 75% (standardinnstilling) av de inkluderte replikater. For de biologiske replika, disse innstillingene var 90 og 60%, henholdsvis.
4. Mass Spectrum Data Analysis
- Velg oppføringene i databasen og lage en sammenligning ved å klikke på "Opprett ny sammenligning" kommandoen i "Sammenligninger" panel.
- Her bruker masse spektra på "Tekniske replikere" og / eller "Biologisk replikere" nivåer for å vise sammenligninger og analyser.
- Likheten-baserte klyngeanalyse og multidimensjonal skalering (MDS)
- Lag grupper med farger. Velg tre biologiske sammensatte masse spektra og klikk på "Opprett ny gruppe fra utvalg" kommandoen i "grupper" menyen for å lage en gruppe for tilsvarende isolat. Utpeke en farge automatisk for disse tre massespektra.
- Alternativt definere felt stater med tilsvarende farger ved hjelp av kommandoene i "Database oppføringer "panel slik at enhver gruppering basert på dette definert feltet bruker samme farge som er definert for denne gruppen.
- Utføre klyngeanalyse. Klikk på "Beregn klyngeanalyse" kommandoen i "Clustering" -menyen. På Sammenligning innstillinger side 1, velg "Pearson korrelasjon" og la andre parametere som standard. På side 2, velg "UPGMA". Klikk deretter på "Finish".
- Få en MDS plottet ved hjelp av "Multi-dimensjonale skalering ..." kommandoen i "Statistics" -menyen.
- Topp matching
- Klikk på spekteret type "MALDI" i "Eksperimenter" panel. Velg deretter "Layout> Vis bilde". Spektra er vist som gel bånd.
- Utføre topp matching bruke "Gjør topp matching" kommandoen i "Spectra" -menyen.
- Identifisering av peak klasser
- Utføre prinsipal komponent analyse (PCA). Markere "MALDI "eksperiment type i" Experimental "panel og bruke" Principal Components Analyse ... "kommandoen i" Statistical "menyen for å utføre PCA.
- Utføre toveis clustering. Klikk på "Statistikk> Matrix mining" ... i "Sammenligning" -vinduet. Intensiteten av toppene tilpasset peak klassene er representert ved hjelp av forskjellige farger (varme kart).
5. Bakterier Identifisering med en Custom Database
- Likheten koeffisient-basert metode
- Lag en sammenligning og generere et dendrogram basert på massespektra i "Technical replikere" nivå som beskrevet i trinn 4.3.3. Lagre dendrogrammet for sammenligning av likhet.
- Velg en ukjent massespekteret, og klikk på "Analyse> Identifisere valgte oppføringer". Identifisering dialogboks vises.
- Velg "Sammenligning basert" klassifikator type (eller en lagret Fareklier) og klikk "neste". På neste side velger du den lagrede dendrogrammet som en referanse sammenligning og klikk "neste".
- Velg "Basic likhet" som identifiseringsmetode og klikk "neste".
- Velg "Maksimal likheten" som scoring metoden. Skriv inn riktige terskelverdier og minimum differanseverdier for hver parameter, og klikk deretter på "neste".
- Når beregningene er fullført, vil identifikasjons vinduet. I "Resultater" panel, er medlemmene av databasen som best matcher ukjent oppført.
- Lagre identifikasjon prosjektet og validere identifisering ved hjelp av "kryssvalidering analyse" kommandoen i "Identification prosjektet" panel.
- Potensiell biomarkør-basert metode
- Definere peak klasser. I "Matrix Mining" vindu, velger et sett med topper som deler felles kjennetegn og definere disse toppene som spesiFIC peak klasser (potensielle biomarkører) ved hjelp av "Spectra> Administrer toppklassetyper ..." i "Sammenligning vindu".
- Her definerer peak klasser spesifikke for hver isolere for alle de 15 isolatene.
- Velg massespektra av ukjente og møter toppene av disse spektrene til de definerte peak klasser som tidligere beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Databasene konstruert i denne demonstrasjonen hadde fire nivåer, fra høyeste til laveste nivå, blant annet "Alle nivåer", "Species", "Biologisk replikere" og "Tekniske replikere", henholdsvis (figur 1A). "Teknisk replikere" nivå inneholdt all den preprocessed spektra av tekniske replikater. Den "Biologisk replikere" og "art" nivåer inneholdt kompositt (sammendrag) spektra. "Alle nivåer" inneholdt alt det tekniske replikere spektra samt all den sammensatte spektra.
Spektrum summarization prosedyrer er vist i figur 1 under anvendelse av representative topper. Hvert medlem massespekteret vises som en tynn grå linje. Det sammensatte spektrum blir representert som en farget linje i rødt. Tilstøtende toppene er merket med en annen farge for å tillate enklere visuell inspeksjon (figur 1B).
tabell 1. Den høyeste reproduserbarheten var 98.0 ± 1.4 for Bacillus-arter B, og den laveste Reproduserbarheten var 89.4 ± 7.8 for Curvibacter artene (tabell 1).
Klyngeanalyse på den biologiske replikere nivå lettes visualisering av den hierarkiske strukturen i de komplekse massespektra eller data. Som vist i figur 2, biologiske replikater gruppert sammen, og 15 arter av bakterier dannet 15 klynger. Nært beslektede arter, for eksempel, B. sp. A, B, D og E, hadde en tendens til å klynge sammen. Imidlertid utliggere, for eksempel B. sp. C og F, ble også observert. MDS-plott basert på massespektra ved "teknisk og biologisk" nivåer er vist på figur 3. MDS pmassevis ga en klar, 3-D visualisering av likhetene mellom spektra av disse bakteriene. Både tekniske og biologiske replikater replikater viste en lignende gruppering (figur 3 A og B).
Topptilpasning ble brukt for å skille settene med topper i massespektra. Peak matchende parametere, inkludert konstant toleranse (punkter på x-aksen), lineær toleranse (ppm) og toppdeteksjonsraten må spesifiseres av brukeren. Konstant toleranse og lineær toleranse er de faktorene som brukes til å beregne posisjonen toleranse av toppene ved hjelp av ligningen: posisjon toleranse = konstant toleranse + lineær toleranse × m / z. Med økende m / z, reduserer betydningen av den konstante toleranse. Toppdeteksjonsraten betyr at hvis en topp er funnet i den posisjonen i mer enn det definerte frekvensen av spektrene, er en toppklasse laget. En topp på ett eller flere mønstre representerer en toppklasse. For eksempel, hvis toppen oppklaringsprosenten EQUAls 10%, kan en toppklasse gjøres bare dersom mer enn 10% av spektrene har topper ved stillingen. Dette utelukker lav prevalens topper (vanligvis støytopper) i et sett med tekniske replikater. Hvis apparatet er basert på den sammensatte spektra av biologiske replikater, kan dette nummer må være lavere så lave prevalens topper har allerede blitt filtrert ut under dannelsen av den sammensatte spektra. I denne demonstrasjon ble det topptilpasning utføres ved hjelp av massespektrene ved "Technical replikere" nivå, og verdiene av disse parametrene var 1,9, 550 og 10%, respektivt. Basert på utvalgte parametre, ble topper ansett som samsvarer med eller ikke samsvarer, noe som resulterer i ulike peak grupper. Et eksempel på toppsamsvarende resultater er vist i figur 4 ved å bruke 30 replikater av et enkelt isolat (Bacillus arter A). De samsvarende resultater ble visualisert som en tabell i hvilken de rå intensiteter er til stede som farger. Blå indikerer lav intensitet og rødt indikerer høy intensity. Basert på topp samsvarende resultater, kan brukerne definere peak klasser som letter oppfølgingen analyser.
Både hovedkomponentanalyse (PCA) (Supplerende figur 1), og to-veis gruppering kan brukes til å analysere den komplekse peak klasser. Et representativt toveis clustering resultat ved hjelp av massespektrene ved "Technical replikere" nivå er vist i figur 5. To dendrogrammer er vist. Den ene er ved siden av m / z-verdier og den andre er over bakterier oppføringer (Figur 5). Peak intensitet ble representert av farger som grønt indikerer lav intensitet og rødt indikerer høy intensitet. For eksempel B. sp. A og F dele svært få toppklassene med B. sp. B og D (figur 5). Lukk undersøkelse viste at B. sp. B og D har også sett av artsspesifikke peak klasser (figur 5). Disse resultatene indikerer at bestemte peak sett dele cert ain egenskaper kan defineres som artsnivå potensielle biomarkører. For eksempel, tretten peak sett tilhører B. sp. D ble valgt og definert som peak klasser (potensielle biomarkører) av B. sp. D, inkludert 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339,9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1 og 7849,1 (tabell 2). Peak klasser av ulike isolater kan vises i forskjellige farger (Supplementary figur 2). Peak klasser spesifikke for hver isolat ble oppført i Tabell 2. Definerte peak klasser ble ytterligere manuelt kontrolleres for å sikre at de dukket opp i alle tekniske replikater med en minimum intensitet på 100 au Videre kan undergrupper av peak klasser også lagres til rette karakterisering av bakterier på underarter og / eller belastningsnivå, for eksempel for å skille patogene stammer fra ikke-patogene stammer og / eller for å undersøke antibiotikaresistens / følsomhet.
ent "> Med hensyn til identifisering, ble massespektra av blinde kodede isolater samlet og forbehandlet på samme måte som referansemassespektra i databasene. For identifisering basert på sammenligning av likhet koeffisienter, ble parameterverdier som er angitt, inklusive den maksimale likheten på 95,0% og den gjennomsnittlige likheten på 87%. Minimum likheten er ikke angitt (dvs. venstre ukontrollert). Den minste forskjell verdiene ble angitt som 5 for både den maksimale og gjennomsnittlige likhet likhet. Disse verdiene kan trenge å bli ytterligere optimalisert for å øke frekvensen av korrekt identifisering. Figur 6 viser identifikasjonsresultater basert på sammenligninger av likheten koeffisienter (figur 6). Det tilsvarende resultatet antydet at dette blind kodede bakterien var mest sannsynlig B. sp. A. Denne identifikasjonen prosjekt basert på sammenligning av likheten koeffisient ble ytterligere validert av kryssvalidering (Supplerende Figur 3 (Supplerende Figur 3). Interessant, er kryssvalidering for identifikasjons prosjekter basert på sammenligning av peak klasser mye raskere enn de som er basert på sammenligning av likhet koeffisient.Identifikasjon kan også fylles ut basert på topp klasse matching (Supplementary figur 4). Men manglende matching av toppene ble observert (Supplementary figur 4). De mistilpasninger kan skyldes en masseforskyvning som følge av aminosyre-utveksling i de respektive proteiner. Toppene ikke blir matchet kan også være topper som ikke er diskriminerende på artsnivå, men er spesifikke for denne belastningen eller isolerer. Tatt sammen, our resultater tyder på at både identifikasjon metoder - likheten koeffisient og biomarkør-baserte - kan lett identifisere bakterier på artsnivå fra karstic miljøer ved hjelp av prøveopparbeidelse, spektrum oppkjøpet, og arbeidsflyt dataanalyse er beskrevet her.
Figur 1. Database konstruksjon og massespektra summe Oppbygging av databaser er konstruert på denne demonstrasjonen (A).; Illustrasjon av peak samandrag hjelp topper fra 10 tekniske replikater av Aminobacter arter A (B).
Figur 2. dendrogram av komposittenmassespektra på biologisk replikere nivå. Datasettet inneholder spektra av 15 ulike arter med tre kompositt spektra for hver art. Hver art ble kodet med en farge.
Figur 3. Multi-dimensjonale skalering (MDS) representasjoner av massespektra på teknisk replikere nivå med 30 spektra for hver art (A) og biologisk replikere nivå med tre kompositt spektra for hver art (B). Farger ble kodet som de samme fargene som anvendt i figur 2.
Figur 4. En illustrasjon av peak matchende bord. Table ble generert basert på massespektra av Bacillus arter A ved teknisk replikere level. Verdiene av peak matchende parametre var 1,9 for konstant toleranse, 550 for lineær toleranse og 10% for topp oppklaringsprosenten henholdsvis. Blå indikerer lav peak intensitet og rødt indikerer høy peak intensitet. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 5. En illustrasjon av to-veis clustering. Figur ble generert ved hjelp av massespektra på teknisk replikere nivå. Farger av isolater ble kodet som de samme fargene som brukes i figur 2. Peak intensitet er representert med farger, grønn betydning lav intensitet og rød mening høy intensitet. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 6. Bacterium identifikasjon basert på sammenligning av likhet koeffisient hjelp tilpasset database.
| ID en | Kilde | Nærmeste slektning b / Phylum / klasse | Tiltredelse # (nærmeste slektning b) | % Likhet | BioNumerics nøkkel | Reproduserbarhet (%) |
| D2 | Tørr speleothem | Bacillus sp. E-257 / Firmicutes | FJ764776.1 | 98,8 | Bacillus arter A | 94.9 ± 4.0 |
| D7 | Tørr speleothem | Bacillus sp. GGC-P3 / Firmicutes | FJ348039.1 | 99.0 | Bacillus arter B | 98.0 ± 1.4 |
| F1 | Flow stein | Bacillus niacin stamme M27 / Firmicutes | KC315764.1 | 99,2 | Bacillus arter C | 96.5 ± 2.4 |
| F4 | Flow stein | Bacillus sp. GGC-P5A1 / Firmicutes | FJ348046.1 | 99.1 | Bacillus arter D | 89.8 ± 8.8 |
| F9 | Flow stein | Bacillus sp. OSS 19 / Firmicutes | EU124558.1 | 99.4 | Bacillus arter E | 96.5 ± 1.9 |
| R10 | Stalactite drypp | Bacillus sp. K1 / Firmicutes | GU968734.1 99,8 | Bacillus arter F | 95,4 ± 3,9 | |
| D11 | Tørr speleothem | Brevibacillus brevis belastning IMAU80218 / Firmicutes | GU125635.1 | 99,5 | Brevibacillus arter | 94.3 ± 5.8 |
| F14 | Flow stein | Exiguobacterium sp. ZWU0009 / Firmicutes | JX292087.1 | 99,3 | Exiguobacterium arter | 96,5 ± 2,5 |
| M7 | Fuktig speleothem | Brevibacterium sp. N78 / Aktinobakterier | HQ188605 | 97.6 | Brevibacterium arter A | 97,5 ± 2,0 |
| M14 | Fuktig speleothem | Kocuria rhizophila belastning Ag09 / Aktinobakterier | EU554435.1 | 100 | Kocuria arter | 95,2 ± 4,1 |
| M15 | Fuktig speleothem | Brevibacterium sp. MN3-3 / Aktinobakterier | JQ396535.1 | 99,5 | Brevibacterium arter B | 92.1 ± 4.9 |
| R4 | Stalactite drypp | Aminobacter sp. KC-EP-S4 / α-Proteobacteria | FJ711220.1 | 99.9 | Aminobacter arter A | 95,4 ± 2.7 |
| F5 | Flow stein | Comamonas testosteroni belastning NBRC 12047 / β-Proteobacteria | AB680219 | 100 | Comamonas arter | 96.4 ± 2.6 |
| R8 | Stalactite drypp | Curvibacter finvask / β-Proteobacteria | AB680705 | 97.0 | Curvibacter </ em> arter | 89.4 ± 7.8 |
| F8 | Flow stein | Moraxella sp. 19.2 KSS / γ-Proteobacteria | HE575924.1 | 99.9 | Moraxella arter | 92,6 ± 4,9 |
en Bakterier ble isolert fra Kartchner Caverns, AZ, USA og identifisert ved hjelp av 16S rDNA sekvensering. To primere, 27F (5 'AGA GTT TGA TGG CTC TCC AG 3') og 1492r (5 'TAC GGT TAC CTT GTT ACT ACG T 3') ble anvendt for å oppnå nesten 1400 bp lengde 16S rRNA gensekvensene.
b Basert på en BLAST søk på NCBI databasen.
c Verdier rapportert er de gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienter på 30 replikater (tre biologiske gjentak hver med 10 tekniske replikater) ± ett standardavvik.
Tabell 1. Bakterier isolater brukes i demonstrasjonen.
| BioNumerics nøkkel | Peak timer / Potensielle biomarkører (DA) |
| Bacillus arter A | 2152,5, 2224,9, 2595,8, 2894,9, 2921,3, 3380,5, 3496,3, 3515,0, 3733,5, 4302,0, 4340,0, 4385.8,4763.9, 4910,6, 5189,4, 5227,0, 5634,6, 5769,6, 5892,8, 6301,4, 6756,2, 6789,4, 6990,3, 7029,5, 7466,3 |
| Bacillus arter B | 2152,5, 2941,2, 3196,9, 3262,7, 3352,9, 3420,8, 3733,5, 3925,2, 4302.0,4339.9, 4629,2, 4713,4, 4859,3, 4900,6, 5189,4, 5227,0, 5541,8, 5878,7, 6388,8, 6524,0, 6704,5, 6838,8, 7142,7, 7317,5, 7466,3, 7849,1, 9263,9, 9721,2 |
| Bacillus arter C | 2588,0, 3361,8, 4330,4, 5173,0, 5847,6, 6332,0, 6524,0, 6720,3 |
| Bacillus arter D | 2152,5, 2894,9, 3420,8, 4302,0, 4339.9, 4629,2, 5189,4, 5448,4, 5878,7, 6388,8, 6838,8, 6931,1, 7849,1 |
| Bacillus arter E | 2152,5, 2224,9, 2941,2, 3180,1, 3380,5, 4302,0, 4339,9, 4705,3, 5878,7, 6356,6, 6735,1, 6756,2 |
| Bacillus arter F | 3308,6, 3367,8, 3567,5, 4279,7, 4489,2, 4629,2, 4727,9, 4751,7, 5067,7, 6614,7, 6919,7, 7130,9 |
| Brevibacillus arter | 2133,3, 2611,0, 4263,3, 4302,0, 4859,3, 4900,6, 5080,2, 5219,0, 5847,6, 6775,7, 7529,4, 9721,2 |
| Exiguobacterium arter | 2588,0, 3053,3, 3420,8, 3695,5, 4263,3, 5133,1, 5173,0, 5248,8, 6104,8, 6605,3, 6804,4, 6838,8, 7390,2 |
| Brevibacterium arter A | 3053,3, 6104,8, 6146,5 |
| Kocuria arter | 3080,0, 4366,6, 5080,2, 5163,8, 5207,1, 5892,8, 6160,0, 6197,5, 6445,0, 7433,7 |
| Brevibacterium arter B | 3222,8, 3330,4, 3367,8, 4330,4, 4350,4, 4795,3, 4995,7, 5731,6, 6445,0, 6735.1,7487.3 |
| Aminobacter arter A | 2133,3, 2562,4, 3361,8, 3410,4, 4289,2, 4629,2, 4662,0, 4869,8, 6064,1, 6221,0, 6720,3, 6789.4,6818.8, 7216,1, 7447,4 |
| Comamonas arter | 2806,0, 2921,4, 3246,5, 4350,4, 4727,9, 5607,5, 5666,3, 6221,0, 6488,3, 7317,5, 9362,6 |
| Curvibacter arter | 2868,6, 3453,2, 4319,8, 5133,1, 6292,4, 6903,4, 7433,7 |
| Moraxella arter | 3011,2, 5698,0, 6720,3, 7064,8, 7366,6 |
Tabell 2. Peak klasser (Potensielle biomarkører) (DA) er definert for hver art.
Tilsetnings Figur 1. Prinsippkomponentanalyse (PCA) av massespektra på the teknisk replikere nivå (A) og peak klassene (B). Farger ble kodet som de samme fargene som brukes i figur 2.
Supplerende Figur 2. En illustrasjon av peak klasser valgt basert på toveis clustering. Peak klasser som har samme etikett er farget med samme farge.
Supplerende Figur 3. Cross-validerings resultatene av identifikasjon prosjekt basert på de tilpassede databaser i BioNumerics.
Supplerende Figur 4. Bacterium identifikasjon basert på topp matching bruker tilpassede databaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne demonstrasjonen viste detaljerte prosedyrer for karakterisering og identifisering av bakterier ved hjelp av MALDI-TOF MS og en tilpasset database. I forhold til tradisjonelle molekylærbiologiske metoder, for eksempel 16S rDNA-sekvensering, MALDI-TOF-MS-baserte metoder fingeravtrykk rette for mer rask identifisering av forskjellige bakterier. På grunn av sin robusthet, er denne teknikken er mye brukt for å karakterisere bakterier, virus, sopp og gjær fra omgivelsene og i kliniske omgivelser 1,14-16. Videre har MALDI-TOF MS blitt rapportert å gi, i noen tilfeller høyere taksonomisk oppløsning 1. For eksempel B. sp. A, B, D og E, men som tenderer til å klynge sammen (figur 2), ble klart fraskilt og likheten mellom spektra av forskjellige B. sp. var mindre enn 80% (figur 2). I kontrast til 16S rDNA-sekvenser av disse isolatene hadde stor likhet, som ikke kunne benyttes for å skille disse isolaterpå artsnivå. 16S rDNA sekvenser av B. sp. B og D har 99% likhet basert på flersekvensanalyse, mens sekvensene av B. sp. A og E viser 95% og 96% likhet med henholdsvis sekvensene av B. sp. B og D. Outliers ble også observert. For eksempel B. sp. C og F gruppert unna annet B. sp. (Figur 2). Utseendet av uteligger isolater viser at klyngeanalysen av massespektra ikke nødvendigvis etablere fylogenetiske forhold. Miljøet som isolerer ble oppnådd kan også påvirke massespektra clustering. For eksempel, Brevibacterium arter B og Kocuria arter som ble isolert fra fuktige speleothem og B. sp. F som ble isolert fra stalactite drypp tendens til å klynge sammen (tabell 1, figur 2), men videre forskning er nødvendig for å undersøke om dette er observert i en større samling av isolater.
Dette biblioteket basert teknikk har også noen begrensninger. Karakterisering er vanligvis basert på databaser. Gjeldende kommersielle databaser er i hovedsak består av bakteriestammer, spesielt patogene seg. Disse kommersielle databaser er mest nyttig i kliniske mikrobiologi lab innstillinger. Å karakterisere miljø isolater samt virus, sopp og gjær, tilpassede databaser må bygges ved bruk av store belastningsskader samlinger. Parametrene som brukes i oppfølgings analyser kan også trenge å være optimalisert for å øke den taksonomiske oppløsning, spesielt på underarter og belastningsnivåer. For eksempel, S: N brukes for toppdeteksjon i denne demonstrasjonen var 10. Denne verdien er egnet for artsnivå identifikasjon, men for strekknivå identifikasjon, kan denne verdien må senkes. Siden disse prosessparametere samt databehandling arbeidsflyt er ofte brukerdefinert i mange programvarepakker, for eksempel, ClinProTools og Bionumerics, vil en optimalisering av parameterverdier og valg av passende arbeidsflyter sannsynligvis være nødvendig for å optimalisere dataanalyse. I denne demonstrasjonen, peak matchende parametre, terskelverdier brukt i identifiseringen prosjektet, og kryssvalidering all nødvendig optimalisering for å forbedre riktige identifikasjons priser. Å finne en metode og / eller prosedyre for å optimalisere disse parametrene er av stor interesse for vår lab. For eksempel kan en tilnærming involvere statistisk faktoriell design, som vi brukte nylig å optimalisere MALDI-TOF automatisert datainnsamling 17. Ytterligere fremtidige applikasjoner og forbedring av MALDI-TOF MS-baserte mikrobiell fingerprinting inkluderer bygging av allment tilgjengelig, større databaser av miljøbakterier og / eller ikke-bakterielle mikroorganismer samt karakterisering av blandede kulturer 18 og mikrobielle samfunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%, CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis software | Bruker Daltonics | version 3.0 | |
| Bionumerics software | Applied Maths | version 7.1 |
References
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
- Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
- Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
- Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
- Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
- Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
- Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
- Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
- Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
- Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
- Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
- Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
- Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
- Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
- Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
- Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
