Abstract
Зубной налет анализы остаются одним из наиболее точных методов прямого количественного определения инфекционных вирионов и противовирусных веществ через подсчета дискретных бляшек (инфекционных единиц и клеточных мертвых зон) в клеточной культуре. Здесь показано, как выполнить основную бляшек, и как отличающиеся накладки и методы могут повлиять образование зубного налета и производства. Обычно твердые или полутвердые наложения субстраты, такие как агароза или карбоксиметилцеллюлоза, были использованы, чтобы ограничить распространение вируса, предотвращая неразборчивое инфекцию через жидкую среду роста. Иммобилизованные накладки ограничить сотовой инфекции в непосредственно окружающей монослоя, что позволяет формирование дискретного счетного очагов и последующего образования бляшек. Чтобы преодолеть трудности, связанные с использованием традиционных накладки, роман жидкость наложения использования микрокристаллической целлюлозы и натрий карбоксиметилцеллюлозу все чаще используется в качестве замены в стандартебляшек. Жидкие наложения налета анализы могут быть легко выполнены либо в стандартных 6 или 12 форматов а пластины в соответствии с традиционными методами и не требуют специального оборудования. Из-за его жидком состоянии и последующей легкости применения и удаления, форматы микрокультуры пластины, альтернативно, может быть использован в качестве быстрого, точного и высокой пропускной альтернативы большего масштаба вирусных титрования. Использование не нагретой вязкой жидкости полимера дает возможность упростить работу, экономит реагенты, инкубатор пространство, и повышает безопасность работы при использовании в традиционных или высоких сдерживания лабораториях как без отопления реагента или стеклянную посуду, необходимые. Жидкие накладки могут оказаться более чувствительными, чем традиционные накладками для некоторых термолабильный вирусов.
Introduction
Точная изоляция и количественное определение жизнеспособных вирусных образцов неизменно продолжающееся исследование цель в вирусологии. Он не был до появления бляшек в 1952, что является средством количественно и качественно рассчитать животных вирусные титры впервые была разработана 1,2. Эта техника была впервые адаптирована и изменена с фага анализов, которые ранее были использованы для расчета титры фондовых бактериофагов в биологии растений 1,2. В то время как альтернативные средства для количественного определения вирусной тех пор были разработаны и адаптированы, таких как иммунологические анализы, флуоресценции и просвечивающей электронной микроскопии, перестраиваемого зондирования резистивный импульса (TRPS), проточной цитометрии, рекомбинантные репортерных систем, и количественный ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР Qrt) эти методы не в состоянии идентифицировать и количественно репликации компетентных вирионов 1,3. В то время как прогресс в технологиях и методах продолжать совершенствовать и изменять ландшафт; plaquе анализы по-прежнему представляют золотой стандарт в определении вирусных концентрации инфекционных литических вирионов 1,4.
Во время анализа бляшек, сливающийся монослой клеток-хозяев, заражен литической вируса неизвестной концентрации, которая была серийно разведенной в счетной диапазоне, как правило, от 5-100 вирионов. Инфицированные монослои затем покрыта накладываемого иммобилизации среды, чтобы предотвратить вирусную инфекцию от распространения через разбора либо механического или конвекционного потока жидкой среды в процессе размножения вирусов. В то время как твердые или полутвердые накладки, такие как агароза, метилцеллюлозы или карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) традиционно использовались, жидкие накладки становятся все более привлекательной альтернативой с развитием новых жидких накладками, такие как Avicel 5- 7. Зубной налет анализы, использующие жидкий по сравнению с традиционными накладками имеют ряд преимуществ, как наложение может быть заявлварьировали при комнатной температуре, и приложения и снятия значительно легче. Как жидкие накладки не требуют потепления, нежные и термолабильный вирусы могут также оказаться проще бляшки.
После первичного инфицирования и применения иммобилизирующим наложения, отдельных бляшек или зон гибели клеток, начнет развиваться как вирусная инфекция и репликации ограничены в окружающую монослоя. Зараженные клетки будут продолжать цикл репликации лизис-инфекции, в дальнейшем распространяясь инфекцию, в результате чего все больше и больше различных и дискретных бляшек. В зависимости от вирусной кинетики роста и используемой клетки-хозяина, видимый налет, как правило, образуют в течение 2-14 дней. Сотовые монослои могут быть затем подсчитывали с помощью стандартной светлой поле микроскопа, или более, как правило, фиксированной и контрастному по нейтрального красного или кристалла насильственных для того, чтобы легко идентифицировать бляшки невооруженным глазом. Есть большое разнообразие доска встречных пятен доступны, каждый предлагая йОДП конкретные преимущества и недостатки. Кристалл фиолетового обычно добавляют в точке сбора и после фиксации / снятия накладки, обеспечивая быстрый и отчетливый счетчик пятно, который позволяет для идентификации очень маленьких бляшек при смешанной морфологией присутствует. Обычный красный имеет преимущество раннего применения и постоянном контакте с накладкой, что позволяет для мониторинга в реальном времени разработки образование бляшек, что особенно полезно при работе с неизвестным вирусом или репликации кинетики. Мы, однако, обнаружили, что окрашивание, как правило, не в отличие при использовании нейтрального красного. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) тетразолия бромид -2,5-дифенил (МТТ) дает несколько преимуществ, как желтые пятна цветные красители живые клетки темно-синий и вирусные бляшки можно пересчитать без удаления верхнего слоя, как с нейтральным красным. Высокая контрастность между живыми и мертвыми клетками предоставляемых МТТ также позволяет обнаружить небольшие бляшки в более раннем времени точка после заражения, Хотя хранение будет по-прежнему требовать удаления верхнего слоя 8. Как кристаллический фиолетовый можно просто выполнен в растворе воды и спирта, и обеспечивает высокую степень чувствительности к смешанной морфологией бляшек, мы выбрали его в качестве предпочтительного, и упрощенной счетчика пятно на протокол продемонстрировал, как мы используем несколько семейств хорошо охарактеризованные вирусы.
После фиксации и окрашивания зараженный клеточный монослой, бляшки подсчитываются, чтобы титровать образцы вирусов запаса по бляшкообразующих единиц (БОЕ) на миллилитр. Падение журнала Следует отметить, между серийных разведений и, в зависимости от размера пластины, между 5-100 бляшек, с отрицательным контролем, используемого в качестве ссылки. Статистически образцы будут меняться на 10% на каждые 100 бляшек при сравнении образца повторяет 3. Преимущество использования зубной налет анализов для определения вирусные титры заключается в их способности для количественного определения фактического количества инфекционных вирусных частиц Within образца. Как несколько вирионы могут потенциально заразить одну ячейку, терминология единиц по сравнению с вирионов используется во время налета титрования 1,2.
Налет морфология может варьироваться резко при различных условиях роста, а также между вирусных видов. Налет размер, четкость, определение границы, и распространение все должны быть отмечены как они могут предоставить ценную информацию о росте и факторов вирулентности вируса в вопросе.
Основные принципы анализа бляшек также могут быть адаптированы и модифицированы различными способами, например, в использовании фокус формирования анализов (FFAs). FFAs не полагаться на лизиса клеток и counterstaining обнаружить образование бляшек, а использовать иммуноокрашивания методы непосредственно обнаружить внутриклеточные белки вируса через меченых антител. Повышенная чувствительность, снижение времени инкубации после заражения, а главное способность количественного без литические вирусы все различныПреимущества при использовании FFAs. В то время как широко используется, критические факторы, ограничивающие в FFAs по сравнению с традиционным методом бляшек заключается в необходимости соответствующих антител и способностью только зонд для белковых субъединиц вируса по сравнению с фактическим инфекционных вирионов 4.
Для целей данного исследования, мы ограничим наше обсуждение классических налета анализов и описывают применение традиционных твердых и полутвердых накладками (агарозы и СМС), наряду с новыми жидкость микрокристаллических накладками целлюлозы.
Protocol
1. Подготовка клеток и реактивов
- День до теста, пластины соответствующих клеток-хозяев для вируса в вопросе (таблица 1 и 2) в 90 - 100% слияния.
- Подготовка фиксирующий раствор 10% формальдегида в дН 2 O. В примере, смешать 5,56 мл 36% акций формальдегида с 14,44 мл дистиллированной H 2 O (DH 2 O).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте практика обращения соответствующих безопасных и вентиляция при помощи формальдегида. - Подготовка кристаллическим фиолетовым пятном: 1% кристаллическим фиолетовым (CV) в 20% -ном этаноле и Д. 2 O.
- Подготовьте 2x бляшки носителя (тип клеток зависимую при концентрации 2 х; смотри Таблицу 2). Фильтр с использованием 0,2 мкм фильтр, если какие-либо реагенты не стерильны.
- Подготовка иммобилизовать накладками (Таблица 3)
- Для жидких накладками, сделать стерильный 2,4% раствор Avicel в дН 2 O. Для предотвращения образования комков, добавить порошок в колбу, содержащую воду йна быстро смешивания с мешалкой, заливают в Avicel медленно и быстро перемешивают при комнатной температуре (RT). Когда раствор окажется слишком вязким для мешальник до гомогенизации, переключиться на колбу шейкера для> 30 мин с тяжелой агитации для обеспечения равномерного гомогенизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: растворы могут быть сделаны при более низких концентрациях, но решения могут отделить и нужно будет ремикс для обеспечения гомогенизации. Рабочие растворы Avicel могут быть использованы в пределах от 0,6-3%. - После гомогенизации, автоклав решение и магазин запечатанный в РТ.
- Для агарозы и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) накладок, подготовить маточного раствора в дН 2 O 2% КМЦ или 0,6% агарозы. Смешать с мешалкой и автоклав или микроволновой печи, чтобы привести в раствор.
- Для жидких накладками, сделать стерильный 2,4% раствор Avicel в дН 2 O. Для предотвращения образования комков, добавить порошок в колбу, содержащую воду йна быстро смешивания с мешалкой, заливают в Avicel медленно и быстро перемешивают при комнатной температуре (RT). Когда раствор окажется слишком вязким для мешальник до гомогенизации, переключиться на колбу шейкера для> 30 мин с тяжелой агитации для обеспечения равномерного гомогенизации.
2. Растворы и инфекции
- На следующий день после посева, визуально проверить слияния и жизнеспособность клеток до начала анализа. Убедитесь, стандартный клеточной морфологии Aй ~ 90% сливной монослоя присутствует.
- Выполните десятикратное серийное разведение инфекционных образцов. С помощью сотового питательной среды для размножения вирусов в качестве разбавителя (таблица 2). Вары число разведений необходимых на основе ожидаемой титра вируса в вопросе, и всегда использовать неинфицированных контрольного образца самостоятельно обеспечить сотовой жизнеспособность и помощь в идентификации бляшек.
- Из серийных разведений, инфицировать клетки в течение 45 мин до 1 ч (таблица 1). Используйте достаточный объем посевного материала для покрытия ячейки, при сохранении объема как можно ниже, чтобы максимально увеличить контакт с вирусной монослоя (таблица 4). Аккуратно каменные плиты каждые 20 мин, чтобы обеспечить даже освещение и предотвратить сотовой монослоя от высыхания.
- После инфекции, накладывать соответствующий объем иммобилизации среды непосредственно к посевного в скважине (таблица 2) с использованием 1: 1 смесь 2x зубного налета средств массовой информации и immobilizчисле наложение выбора (CMC, агарозы или Авицел). Осторожно перемешать.
- Для жидких накладками, смешать 1: 1 с утепленным 2x налета СМИ и 1.2 - 2.4% RT фондовом Avicel получить рабочий раствор 0,6-1,2% Avicel наложения среды.
- Для агарозном наложения, использовать 1: 1 смесь утепленных 2x налета СМИ и исходного раствора с подогревом 0,6% агарозы, место в 56 ° С водяной бане в течение 30 мин, чтобы уравновесить температуру получения конечной концентрации агарозы / наложения 0.3 %.
- Для КМЦ, подготовить 2% исходного раствора и лечения, как описано в агарозном наложения.
- При применении накладку на монослое, всегда в равновесие горячей агарозы или CMC в 56 ° C водой, чтобы предотвратить повреждение монослое. Убедитесь решение теплая, но не горячая на ощупь, чтобы предотвратить гибель клеток и снижение вирусные титры. Большинство агарозные накладки начнет затвердевать ниже 42 ° С, работать быстро и / или подготовить небольшие партии для предотвращения затвердевания при работе.
- После добавления оверлея, инкубировать пластин для производства различных бляшки, которые явно счетно. Налет формирование может занять 2-14 дней в зависимости от вируса анализируются, таблицу 1.
Примечание: После того, как жидкие накладными пластины помещают в инкубатор, не перемещать их. Движение жидкости накладок в течение инкубационного периода приведет к размытыми бляшек. Агарозные и CMC пометки полутвердые и могут быть перемещены или периодически проверять под световым микроскопом, чтобы контролировать развитие бляшек.
3. Крепление и окрашивания клеток
- Для фиксации клеток, слить или аспирации наложение Avicel, и исправить клетки с помощью 10% -ного раствора формальдегида в течение 30 мин, чтобы в течение ночи (<1 мл на лунку для луночного планшета в 6).
- Для агарозы или CMC, непосредственно добавить раствор формальдегида в накладкой в течение 1 часа в ночь.
Примечание: Образцы могут храниться в течение длительного периода времени в фиксаторе условии, что он делаетне испаряются и высыхают, как это может исказить монослой.
- Для агарозы или CMC, непосредственно добавить раствор формальдегида в накладкой в течение 1 часа в ночь.
- До окрашивания и после фиксации, отбросить формальдегид и удалить полутвердые заглушки для агарозы и КМЦ с проточной водой или вручную, или с помощью шпателя. Промыть Avicel бляшки с водой, чтобы удалить остатки наложения / фиксатор перед окрашиванием.
- Для окрашивания, покрывают клетки с минимальным количеством кристаллического фиолетового раствора в течение ~ 15 мин. Рок плиты при необходимости обеспечить равномерное покрытие.
- Аккуратно смойте кристаллическим фиолетовым пятном водой. После того, как фиксированной, окрашенных, и сушат, магазин бляшки на неопределенный срок для последующего анализа.
4. Определение титров вируса
- Граф бляшки в каждую лунку, взяв среднее за любые технические повторов одного и того же разведения. Для больших форматов пластин, скидка скважин с менее чем 5 или больше 100 бляшек. Принять к сведению размер бляшек и морфологии. Отрицательный контроль должен иметь равномерный монослой иможет быть использован в качестве контроля опорной.
- Определить титр вируса на фондовом образца, принимая среднее число бляшек для разбавления и обратного общего коэффициента разбавления.
Примечание: В качестве примера, 30 и 32 бляшек для повторах в 1 х 10 -7 разведений [31 (в среднем) 10 / -7 (разведение) х 0,4 мл (инокулята)] даст титр 7,75 х 10 8 БОЕ / мл.
Representative Results
Способность налета анализов, чтобы точно оценить вирусные титры опирается на многочисленных факторов: соответствующим выбором клетки-хозяина, соответствующих средствах массовой информации и условий роста для сотовых и вирусной жизнеспособности, иммобилизованной вирусного распространения, и точное определение вирусной инкубационного периода, чтобы обеспечить достаточное время для различны и формирование счетная доска.
Для этого исследования, вирусы из трех представительных семей были выбраны, чтобы продемонстрировать различия в: наложения отбора, инкубационных периодов, и бляшки морфологии по всей различными типами образцов. Венесуэльский лошадиный энцефалит (VEEV) был выбран в качестве (+) ssRNA вирусной модели, которые могут нанести значительный болезни в лошадиных видов и человека и представляет семью Togaviridae. Грипп B Тайвань штамм, сегментирован (-) вирус ssRNA первую очередь инфицировать людей, представляет семью Orthomyxoviridae. Вирус Рифт-Валли (RVFV), (-) ssRNA членистоногих родился вирус в первую очередь заразить членистоногих,жвачные и люди, была выбрана в качестве представителя семейства буньявирусов.
Для RVFV (рисунок 1), титры определяли из исходного раствора рекомбинантного живого ослабленного MP12 штамма RVFV в формате 12 и пластины с использованием CMC, агарозные или AVICEL накладки, которые инкубировали бок о бок в течение после заражения 72 ч (HPI). Представитель пластина показывая разведения, начиная от 10 -4 до 10 -7 можно увидеть в панели А. бляшек с использованием CMC и агарозные накладки показали небольшие, четкие и определенные бляшки с четко определенной круговой границы. Мемориальные доски с жидкой наложения были немного более обильные и больше по сравнению с агарозном и СМС бляшки, и при условии, менее отчетливое границу. Вирусные титры были сравнены в Группе B со всеми накладками выполнении сравнительно.
Для того, чтобы получить более четкое визуальное сравнение между накладками для MP12 вместе с большим размером выборки для определения reproducвость, 6 и пластина была также опробована в трех экземплярах (рисунок 2). В формате пластины 6 также, использование накладки CMC показали меньшие, чем любой бляшки агарозных или жидких накладками, которые были сравнимы по размеру друг от друга. В то время как вирусные титры были аналогичны между всеми тремя накладками (Панель D), бляшки, образованные в агарозных и жидких накладками оказалось легче рассчитывать из-за их увеличенного размера.
В отличие от RVFV, VEEV титров и бляшки морфологии среди различных накладок варьировалась заметно (рис 3а). Бляшки, образованные в CMC накладками продемонстрировали ясную и четкую морфологию при использовании формата 12-луночного планшета, за счет бляшки размера и чувствительности (панель В). В отличие от CMC, использование агарозных и жидких накладками приводило к значительно более крупные бляшки, указывающий более низкий вирусный ингибирование и повышенную чувствительность к VEEV репликации. Это было ранее подтверждено, когда только сравнивая агарозы в сравнении CMC в аркабан опубликованы Хуарес и др. 4. В то время как агарозные и жидкие накладки производили крупные бляшки, чем CMC, бляшки были плохо определены границы и были трудно рассчитывать на так формате 12, с жидкими накладок, обеспечивающих наибольшую границы распространения. Когда бляшки опробована в 6-луночные планшеты (рисунок 4), тем больше формат хорошо 6 отрицается вопрос открыто крупных бляшек, которые трудно дифференцировать в формате 12 а, с агарозы и жидких накладками, подтверждающих превосходит накладками СМС с точки зрения доска определение и чутко (рис 4D).
По сравнению с RVFV или VEEV, грипп предоставляет ряд уникальных трудностей при plaquing, такие, как требование внешнего протеазы. Чувствительность вируса гриппа в различных наложения выборов также были хорошо документированы в прошлом, как значительные изменения были отмечены при модификации как незначительные, как отличающиеся марки агарозы есть бытьан используется 9.
Интересно для штамма гриппа B Тайваня, использование CMC в виде наложения привело заметно меньшие бляшки, которые было трудно рассчитывать и оказалось трудно надежно забить (5А). Использование агарозном наложения при условии, лучшие бляшки (Панель С), и в результате более темном фоне пятна (вероятно, из-за повышенной жизнеспособности монослоя), и показали более четких и резких бляшки в непосредственном сравнении с использованием жидкой накладкой (панель B ).
Отличительное преимущество жидких полимеров более твердых и полутвердых накладками, таких как агароза и КМЦ, состоит в легкости удаления и применения. Сыры накладки требуют нагрева и кристаллизации может оказаться проблематичным при обращении и удаления. Для того, чтобы заработать на этих преимуществ и для определения целесообразности использования Avicel в высокой пропускной образом для RVFV, 96 Формат хорошо Планшет опробована на различных наложения КонцентрацДополнения (Рисунок 6). Для RVFV MP-12, разведения проводили в четырех повторностях на обоих 0,6 и 1,2% конечной концентрации Avicel. Наложение применение и удаление оказалось простой, без каких-либо очевидных различий между повторами или между концентрациями отмечено, демонстрируя высокую степень воспроизводимости. Когда забил, бляшки были различны и счетная невооруженным глазом, демонстрируя возможности использования жидких накладки в высокой пропускной образом для RVFV.
Рисунок 1:. RVFV налета сравнения наложения, использующие 12-луночных Veros высевали на 2,5 × 10 5 клеток в 12-луночных планшетах и заражены 200 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец MP12. После заражения 1,5 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ (Final Concentrations), были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели А. бляшек подсчитывали и титровали в Группе B.
Рисунок 2:. RVFV налета сравнения наложения, использующие 6 пластин также Veros высевали на 5 х 10 5 клеток в 6-луночные планшеты и заражены 400 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец MP12. Три мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели A, B, и C. Отдельные эксперименты проводили, как описано одинаково для панелей переменного тока, с бляшек и титруют в панели D (N = 3).
Рисунок 3: <сильные> VEEV налета сравнения наложения, использующие 12-луночных. Veros высевали на 2,5 × 10 5 клеток в 12-луночных планшетах и заражены 200 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец вакцинного штамма в VEEV TC-83. После заражения 1,5 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели А. бляшек подсчитывали и титровали в панели B.
Рисунок 4:. V EEV сравнения доска наложения, использующие 6 пластин также Veros высевали на 5 х 10 5 клеток в 6-луночные планшеты и заражены 400 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец VEEV TC-83. После заражения, 3 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показанов Панели А, В и С. Отдельные эксперименты проводились одинаково, как описано для панели A - C, с бляшек и титровали в Панель D (N = 3).
Рисунок 5: гриппа зубного налета сравнения наложения MDCK клетки высевали на 5 х 10 5 клеток в 6-луночные планшеты и инфицировали 400 мкл инокулята, использующих один и тот же начальный серийно разводили образец гриппа В Тайване.. Нет фетальной бычьей сыворотки (FBS) не был использован в ростовой среде или накладок, как ФБС может ингибировать распространение гриппа путем ингибирования определенных протеаз, которые требуются для вирусного слияния. ТРСК-трипсином был добавлен ко всем накладок до применения, чтобы облегчить синтез вирусной и запись с клетками-хозяевами. После заражения, 3 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ были применены для того, чтобы непосредственно сравнитьпометки, как показано в панели А, В и С. отдельных экспериментов проводились одинаково, как описано в Панели А - С, с бляшек и титровали в Панель D (N = 3). В то время как в среднем было принято для CMC бляшек они оказались трудно надежно рассчитывать, поскольку они продемонстрировали диффузные границы и очень маленькие размеры бляшек.
На рисунке 6:. Высокая пропускная способность налета накладки 96-луночный планшет из Veros высевали при 3 х 10 4 клеток на лунку, были инфицированы 50 мкл инокулята, использующих один и тот же начальный серийно разводили образец RVFV MP12 в течение 1 ч, в четырех повторностях. Для накладок, 0,6 и 1,2% конечные концентрации Avicel были опробована в целях определения целесообразности и воспроизводимость использования жидких накладки в высокой пропускной образом, панели А и В,
| RVFV | VEEV | Грипп B | |
| Тип клетки | Веро | Веро | MDCK |
| Период инфекции | 1 час | 1 час | 45 мин |
| Время инкубации | 3 дня | 2 дня | 3 дня |
Таблица 1: бляшек инокуляции Условия и Сотовые Типы
| RVFV | VEEV | Грипп B | |
| Тип клетки | Веро | Веро | MDCK |
| Тип роста | DMEM 1 | DMEM 1 | DMEM 2 |
| Налет Медиа | 2xEMEM | 2xEMEM | 2xEMEM B |
1. Игла в модификации Дульбекко, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 1% Penicllin / стрептомицина.
2. Игла в модификации Дульбекко среде с добавлением 1% L-глутамина, 1% Penicllin / стрептомицина, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,025% HEPES, DEAE-декстран 50 мкг / мл.
А. 2x минимальной необходимой Медиа (500 мл) с добавлением 5% FBS (25 мл), 1% Минимальные незаменимых аминокислот (5 мл), 1% пирувата натрия (5 мл), 1% L-глутамина (5 мл), 2% Pen / Strep (10 мл).
Б. 2x минимальной необходимой Медиа (500 мл) с добавлением 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 1% Минимальный незаменимых аминокислот (5 мл), 50 мкг / мл, 0,025% HEPES, DEAE-декстран, трипсин-ТРСК *
* Только до подготовки, добавить 1 мкл на 25мл 2 мкг / мл фондовой из ТРСК-трипсина к аликвотой вы будете использовать для смешивания с агарозы для бляшек.
Таблица 2: Налет и Вирусный / Сотовая Рост Medias
| RVFV | VEEV | Грипп B | |
| Тип клетки | Веро | Веро | MDCK |
| Период инфекции | 1 час | 1 час | 45 мин |
| Время инкубации | 3 дня | 2 дня | 3 дня |
Наложение решения не истекут, когда сделал так долго, как бесплодие поддерживается.
Таблица 3: наложений со
| 6 хорошо | 12 хорошо | 96 хорошо | |
| # Клеток / лунку | 5 х 10 5 | 2,5 х 10 5 | 3 х 10 4 |
| Объем инокулята (мкл) | 400 | 200 | 50 |
| Объем наложения (мл) | 3 | 1,5 | 0.100 |
Таблица 4: Пластинчатые форматы
Discussion
Наиболее важным фактором для успешного бляшек заключается в оптимизации протокола для конкретного вируса в культуре в вопросе, как условия могут существенно различаться. Ключевые моменты, которые следует учитывать, являются: провести сотовой совместимость с вирусом в вопросе, соответствующих вирусных условий роста, достаточных диапазонах разбавления для того, чтобы четко различать бляшки, и правильный подбор наложения и окрашивание клеток и вируса в вопросе.
В то время как VEEV и RVFV и расти в очень похожих условиях с использованием многих из тех же типов клеток хозяина, различия в налета морфологии и кинетики роста существенно различаться. При использовании клетки Веро на налета анализов, которые традиционно используются в качестве распространения и индикатора клеточной линии для геморрагических вирусов лихорадки и альфавирусов, VEEV обычно вырастает до высоких титров чем RVFV и демонстрирует увеличилось кинетики репликации, разработке больших единых бляшек на 48 HPI 4, 10 - 12. В отличие от VEEV, RVFV требуется 72 HPI и демонстрирует бляшки, которые, как правило, гораздо меньше, и переменный размер.
В противоположность RVFV и VEEV, вирус гриппа является весьма специфические клетки-хозяина, и может быть трудно распространяться через культуре ткани. Для вируса гриппа, вирусного входа и слияния, как правило, по инициативе связывание рецептора на поверхности клетки с вирусной гликопротеина hamagglutinin (HA), которая является посредником вступление в клетки-мишени путем связывания с α-сиаловой поверхности кислоты рецептора клетки-хозяина. НА представляет собой тример гликопротеин, присутствующий в мембранной оболочке всех вирусов гриппа и требует расщепление в субъединиц HA1 и HA2 по конкретной клетки-хозяина протеазы. Чтобы еще более усложнить вопрос, эти сайты расщепления может часто отличаются вирусных штаммов 13. Как экспрессии протеазы, способные к расщеплению HA ограничивается конкретными тканей, протеазы ARе часто добавляют к среде для культивирования клеток для того, чтобы облегчить синтез вирусной и вступление в выбранной клетке-хозяине, 13. ТРСК-трипсином является одним из примеров широко используемом протеазы, который используется в клеточной культуре с обеих MDCK и клетки Vero: содействие репликацию мульти-цикла (в отсутствие какого-либо инактивации трипсина сыворотки) через активацию протеолитической вирусной HA 14,15.
Как показано в этом исследовании и других, различия в вирусных жизненных циклов могут влиять наложения выборы, форматы плит и раз коллекцию, со значительными отклонениями среди различных классов и видов вирусов. В нашем исследовании, агарозы накладки продемонстрировал более четкие бляшки на более высоких титров, чем любой CMC или жидких накладок для обоих RVFV и вируса гриппа В, усиливая его полезность среди широкого спектра вирусов и типах клеток. Используя низкую конечную концентрацию агарозы большую помощь в удалении твердых пробки и упрощенную окрашивание. CMC в целом продемонстрировал рoorest эффективность в виде наложения на всех трех вирусов проверенных и производимых очень маленькими и нечеткими бляшек на вирус гриппа B. Хотя в целом CMC продемонстрировали наименее желательными характеристиками, его применение в стремительно растет и чрезвычайно вирулентные вирусы могут оказаться выгодным, как это было, кажется, уменьшить размер бляшек только с минимальным снижением титра. Жидкость накладка оказалась наиболее универсальным в том, что он был чрезвычайно прост в приготовлении, увеличилось простоту использования, и был сопоставим с агарозы через все вирусы выбранных. В формате более высокую пропускную способность 96-луночного планшета, применения и удаления не ингибируется в результате затвердевания как с традиционными накладками, и при условии, точные и стабильные результаты. Фактором при использовании жидких накладки заключается в непрозрачной окраски и неспособности контролировать образование бляшек в тарелки не могут быть перемещены до точки сбора, ограничения этого адаптацию к вирусам с ранее характеризующихся кинетики репликации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2x EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 °C |
| MEM 100x | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
References
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
