Abstract
पट्टिका assays सेल संस्कृति में असतत सजीले टुकड़े (संक्रामक इकाइयों और सेलुलर मृत क्षेत्रों) की गिनती के माध्यम से संक्रामक virons और एंटीवायरल पदार्थों के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव के लिए सबसे सही तरीकों में से एक रहे. यहाँ हम एक बुनियादी पट्टिका परख प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन कैसे, और भिन्न ओवरले और तकनीक पट्टिका गठन और उत्पादन को प्रभावित कर सकते हैं. आमतौर पर इस तरह के agarose या Carboxymethyl सेलूलोज के रूप में ठोस या semisolid ओवरले substrates के, तरल मध्यम विकास के माध्यम से अंधाधुंध संक्रमण को रोकने, वायरल प्रसार को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Immobilized ओवरले असतत गणनीय foci और बाद पट्टिका गठन के गठन की अनुमति, तुरंत आसपास के monolayer के लिए सेलुलर संक्रमण सीमित. पारंपरिक ओवरले का उपयोग करने में निहित कठिनाइयों को दूर करने के लिए, माइक्रोक्रिस्टलाइन सेलुलोज और Carboxymethyl सेलूलोज़ सोडियम का उपयोग एक उपन्यास तरल ओवरले तेजी मानक में एक स्थानापन्न के रूप में इस्तेमाल किया गया हैपट्टिका परख. तरल ओवरले पट्टिका assays आसानी से परंपरागत तकनीकों के अनुसार मानक 6 या 12 अच्छी तरह से थाली प्रारूपों में भी प्रदर्शन किया और कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता हो सकती है. कारण इसकी तरल अवस्था और आवेदन और हटाने के बाद आसानी के लिए, microculture प्लेट स्वरूपों वैकल्पिक रूप से बड़े पैमाने वायरल अनुमापन करने के लिए एक, तेजी से सटीक और उच्च throughput विकल्प के रूप में उपयोग किया जा सकता है. एक गैर गर्म चिपचिपा तरल बहुलक का उपयोग करें, काम को कारगर बनाने का अवसर प्रदान करता अभिकर्मकों, इनक्यूबेटर अंतरिक्ष, और कोई अभिकर्मक हीटिंग या कांच के बने पदार्थ जैसे पारंपरिक या उच्च नियंत्रण प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जब परिचालन सुरक्षा के लिए आवश्यक हैं बढ़ जाती है संरक्षण. तरल ओवरले भी कुछ गर्मी अस्थिर वायरस के लिए पारंपरिक ओवरले तुलना में अधिक संवेदनशील साबित हो सकता है.
Introduction
व्यवहार्य वायरल नमूनों की सटीक अलगाव और मात्रा का ठहराव लगातार विषाणु विज्ञान में चल रहे एक शोध लक्ष्य दिया गया है. यह पहली बार 1,2 विकसित किया गया था एक साधन मात्रात्मक और गुणात्मक पशु वायरल titers की गणना करने के लिए है कि 1952 में पट्टिका परख के आगमन तक नहीं था. इस तकनीक को पहले अनुकूलित और पहले से प्लांट बायोलॉजी 1,2 में शेयर bacteriophages की titers की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था जो फेज assays के, से संशोधित किया गया था. वायरल मात्रा का ठहराव के लिए वैकल्पिक साधन के बाद से इस तरह के immunoassays, प्रतिदीप्ति और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, ट्यून करने योग्य प्रतिरोधक पल्स संवेदन (टीआरपी) के रूप में, विकसित और अनुकूलित किया गया है, वहीं cytometry, पुनः संयोजक संवाददाता सिस्टम प्रवाह, और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (QRT- पीसीआर) इन विधियों प्रतिकृति सक्षम virons 1,3 की पहचान और quantitate असफल. प्रौद्योगिकी और तकनीक के क्षेत्र में प्रगति को निखारने और परिदृश्य को बदलने के लिए जारी; plaquई assays के संक्रामक अपघट्य virons 1,4 के लिए वायरल सांद्रता निर्धारित करने में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करने के लिए जारी है.
एक पट्टिका परख के दौरान मेजबान कोशिकाओं का एक मिला हुआ monolayer क्रमानुसार 5-100 virions के बीच आम तौर पर, एक गणनीय रेंज को पतला कर दिया गया है कि एक अज्ञात एकाग्रता की एक अपघट्य वायरस से संक्रमित है. संक्रमित monolayers फिर अंधाधुंध वायरल प्रचार के दौरान तरल माध्यम के यांत्रिक या convectional प्रवाह या तो के माध्यम से फैलने से वायरल संक्रमण को रोकने के लिए एक immobilizing ओवरले मध्यम के साथ आते हैं. ऐसे agarose, मिथाइल सेलूलोज या Carboxymethyl सेलूलोज़ (सीएमसी) के रूप में ठोस या semisolid ओवरले पारंपरिक रूप से इस्तेमाल किया गया है, तरल ओवरले ऐसे Avicel 5- 7 के रूप में उपन्यास तरल ओवरले के विकास के साथ एक तेजी से आकर्षक विकल्प बन गए हैं. ओवरले हो सकता है के रूप में पारंपरिक ओवरले बनाम तरल उपयोग पट्टिका assays Appl कई फायदे हैंकमरे के तापमान, और आवेदन और हटाने पर आइईडी काफी आसान है. तरल ओवरले वार्मिंग की आवश्यकता नहीं है के रूप में, नाजुक और गर्मी अस्थिर वायरस भी पट्टिका के लिए आसान साबित हो सकता है.
प्रारंभिक संक्रमण और immobilizing ओवरले, व्यक्तिगत सजीले टुकड़े, या कोशिका मृत्यु के क्षेत्रों के आवेदन के बाद, के रूप में वायरल संक्रमण और प्रतिकृति आसपास monolayer के लिए विवश कर रहे हैं विकसित करने के लिए शुरू हो जाएगा. संक्रमित कोशिकाओं, प्रतिकृति-सेल-संक्रमण चक्र जारी रखने के आगे तेजी से अलग और असतत सजीले टुकड़े, जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण प्रचार करेंगे. इस्तेमाल किया वायरल विकास कैनेटीक्स और मेजबान सेल पर निर्भर करता है, एक दृश्य पट्टिका सामान्य रूप से 2-14 दिनों के भीतर बनेगी. सेलुलर monolayers आसानी से नग्न आंखों के साथ सजीले टुकड़े की पहचान करने के क्रम में तो एक मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ गिना जाएगा, या अधिक आम तौर पर तटस्थ लाल या हिंसक क्रिस्टल द्वारा तय की और counterstained सकता है. उपलब्ध पट्टिका काउंटर दाग की एक विस्तृत विविधता, प्रत्येक भेंट वें रहे हैंEIR विशिष्ट फायदे और नुकसान. क्रिस्टल बैंगनी आम तौर पर मिश्रित आकृति विज्ञान मौजूद है जब बहुत छोटे सजीले टुकड़े की पहचान के लिए अनुमति देता है जो एक तेजी से और अलग काउंटर दाग प्रदान करने, संग्रह की बात पर और ओवरले का निर्धारण / हटाने के बाद जोड़ा गया है. तटस्थ लाल एक अज्ञात वायरस या प्रतिकृति कैनेटीक्स के साथ काम कर रहा है जब विशेष रूप से उपयोगी है जो पट्टिका गठन, के विकास की लाइव निगरानी के लिए अनुमति देता है, जल्दी आवेदन और ओवरले के साथ लगातार संपर्क का लाभ दिया है. लेकिन हम तटस्थ लाल का उपयोग करते समय धुंधला हो जाना आम तौर पर अलग नहीं है कि मिल गया है. पीले रंग की डाई दाग गहरे नीले और वायरल सजीले ओवरले को हटाने के रूप में बिना गिना जा सकता है कोशिकाओं रहते हैं 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-Diphenyl tetrazolium ब्रोमाइड (MTT), कई लाभ प्रदान करता है तटस्थ लाल के साथ. MTT द्वारा afforded रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच उच्च विपरीत भी एक पहले के समय बिंदु के बाद संक्रमण पर छोटे सजीले टुकड़े का पता लगाने के परमिट, भंडारण अभी ओवरले 8 को हटाने की आवश्यकता होगी, हालांकि. क्रिस्टल बैंगनी बस पानी और शराब की एक समाधान में बनाया, और मिश्रित पट्टिका आकृति विज्ञान के लिए संवेदनशीलता के एक उच्च डिग्री प्रदान करता जा सकता है जैसा कि प्रोटोकॉल हम अच्छी तरह से कई परिवारों का उपयोग कर रहे हैं के रूप में प्रदर्शन के लिए, हम एक पसंदीदा और सरलीकृत काउंटर दाग के रूप में इसे चुना है विशेषता वायरस.
संक्रमित सेलुलर monolayer फिक्सिंग और धुंधला के बाद, सजीले मिली लीटर प्रति पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) के मामले में वायरल शेयर नमूने अनुमापांक के क्रम में गिने जाते हैं. 5-100 सजीले एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ, गिना के बीच एक प्रवेश ड्रॉप, थाली के आकार पर निर्भर करता है, धारावाहिक dilutions के बीच विख्यात और किया जाना चाहिए. आंकड़ों के नमूने नमूना की तुलना 3 प्रतिकृति जब गिना हर 100 सजीले टुकड़े के लिए 10% से भिन्न होगी. वायरल titers निर्धारित करने के लिए पट्टिका assays का उपयोग का लाभ डब्ल्यू संक्रामक वायरल कणों की वास्तविक संख्या quantitate करने की क्षमता में निहित हैनमूना ithin. कई virions संभवतः एक एकल कोशिका को संक्रमित कर सकता है के रूप में, virons बनाम इकाइयों की शब्दावली पट्टिका अनुमापन 1,2 के दौरान प्रयोग किया जाता है.
फलक आकृति विज्ञान नाटकीय रूप से भिन्न विकास परिस्थितियों में और वायरल प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं. वे सवाल में वायरस के विकास और डाह कारकों पर बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं के रूप में फलक आकार, स्पष्टता, सीमा परिभाषा, और वितरण सभी ध्यान दिया जाना चाहिए.
बेसिक पट्टिका परख सिद्धांतों भी अनुकूलित और इस तरह फोकस बनाने assays के (FFAs) के उपयोग में के रूप में अलग अलग तरीकों की एक संख्या में संशोधित किया जा सकता है. FFAs पट्टिका गठन पता लगाने के लिए सेल और counterstaining पर भरोसा करते हैं, बल्कि सीधे टैग एंटीबॉडी के माध्यम से इंट्रासेल्युलर वायरल प्रोटीन का पता लगाने के लिए तकनीक immunostaining को रोजगार नहीं है. वृद्धि की संवेदनशीलता, सबसे महत्वपूर्ण बात यह गैर-अपघट्य वायरस सब अलग हैं quantitate करने की क्षमता संक्रमण के बाद ऊष्मायन बार कमी आई है, औरफायदे FFAs रोजगार जब. व्यापक रूप से इस्तेमाल करते हैं, एक पारंपरिक पट्टिका परख बनाम FFAs में महत्वपूर्ण सीमित कारकों उपयुक्त एंटीबॉडी के लिए की जरूरत है और वास्तविक संक्रामक virons 4 बनाम वायरल प्रोटीन सब यूनिटों के लिए केवल जांच करने की क्षमता में निहित है.
इस अध्ययन का उद्देश्य के लिए, हम शास्त्रीय पट्टिका assays के लिए हमारी चर्चा सीमित कर देगा और उपन्यास तरल माइक्रोक्रिस्टलाइन सेलुलोज ओवरले के साथ, परंपरागत ठोस और semisolid ओवरले (agarose और सीएमसी) के उपयोग का वर्णन.
Protocol
कोशिकाओं और अभिकर्मकों के 1. तैयारी
- 100% confluency - दिन पहले प्रश्न में वायरस के लिए परख, थाली उपयुक्त मेजबान कोशिकाओं (तालिका 1 और 2) 90 पर है.
- DH 2 ओ में 10% formaldehyde के फिक्सिंग समाधान तैयार उदाहरण में, 14.44 मिलीलीटर आसुत एच 2 ओ (DH 2 हे) के साथ 36% शेयर formaldehyde के 5.56 मिलीलीटर मिश्रण.
नोट: का प्रयोग उचित सुरक्षित हैंडलिंग प्रथाओं और वेंटिलेशन formaldehyde का उपयोग करते समय. - क्रिस्टल बैंगनी दाग तैयार: 1% क्रिस्टल वायलेट (सीवी) 20% इथेनॉल में और DH 2 ओ
- 2x पट्टिका मीडिया (2x एकाग्रता पर निर्भर सेल प्रकार, 2 टेबल देखें) तैयार करें. किसी भी अभिकर्मकों बाँझ नहीं कर रहे हैं अगर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर.
- Immobilizing ओवरले की तैयारी (तालिका 3)
- तरल ओवरले के लिए, DH 2 ओ में Avicel की एक बाँझ 2.4% समाधान करना Clumping को रोकने के लिए, वीं पानी युक्त एक कुप्पी को पाउडर शामिलतेजी से हलचल पट्टी के साथ मिश्रण है, पर धीरे-धीरे में Avicel डालना और कमरे के तापमान (आरटी) में तेजी से हलचल. समाधान एक हलचल बार homogenize करने के लिए बहुत चिपचिपा साबित होता है, तो भी homogenization में सुनिश्चित करने के लिए भारी आंदोलन के साथ> 30 मिनट के लिए एक फ्लास्क प्रकार के बरतन करने के लिए स्विच.
नोट: शेयर समाधान कम सांद्रता में बनाया जा सकता है, लेकिन समाधान अलग हो सकता है और homogenization में सुनिश्चित करने के लिए रीमिक्स किया जा आवश्यकता होगी. Avicel का कार्य समाधान 0.6-3% से लेकर इस्तेमाल किया जा सकता है. - Homogenization के बाद, आरटी पर सील समाधान और दुकान आटोक्लेव.
- Agarose और Carboxymethyl सेलूलोज़ (सीएमसी) ओवरले के लिए, DH 2 2% सीएमसी या 0.6% agarose के ओ में एक शेयर समाधान तैयार है. समाधान में लाने के लिए एक हलचल पट्टी और आटोक्लेव या माइक्रोवेव के साथ मिलाएं.
- तरल ओवरले के लिए, DH 2 ओ में Avicel की एक बाँझ 2.4% समाधान करना Clumping को रोकने के लिए, वीं पानी युक्त एक कुप्पी को पाउडर शामिलतेजी से हलचल पट्टी के साथ मिश्रण है, पर धीरे-धीरे में Avicel डालना और कमरे के तापमान (आरटी) में तेजी से हलचल. समाधान एक हलचल बार homogenize करने के लिए बहुत चिपचिपा साबित होता है, तो भी homogenization में सुनिश्चित करने के लिए भारी आंदोलन के साथ> 30 मिनट के लिए एक फ्लास्क प्रकार के बरतन करने के लिए स्विच.
2. dilutions और संक्रमण
- दिन चढ़ाना के बाद, नेत्रहीन परख शुरू करने से पहले कोशिकाओं की confluency और व्यवहार्यता की जांच. मानक सेलुलर आकृति विज्ञान एक सुनिश्चितएन डी एक ~ 90% मिला हुआ monolayer मौजूद है.
- संक्रामक नमूनों की एक दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करना. मंदक (तालिका 2) के रूप में वायरल प्रचार के लिए सेलुलर विकास मीडिया का प्रयोग करें. प्रश्न में वायरस की उम्मीद है और अनुमापांक के आधार पर आवश्यक dilutions की संख्या में भिन्नता है, और हमेशा स्वतंत्र रूप से पट्टिका पहचान में सेलुलर व्यवहार्यता और सहायता सुनिश्चित करने के लिए एक असंक्रमित नियंत्रण नमूना का उपयोग करें.
- धारावाहिक dilutions से, 1 घंटा (1 टेबल) के लिए 45 मिनट के लिए कोशिकाओं को संक्रमित. जितना संभव हो कम मात्रा रखने monolayer (तालिका 4) के साथ वायरल संपर्क को अधिकतम करने के लिए है, जबकि कोशिकाओं को कवर करने के inoculum की पर्याप्त मात्रा का प्रयोग करें. धीरे रॉक प्लेटें हर 20 मिनट कवरेज भी सुनिश्चित करने और सुखाने से सेलुलर monolayer को रोकने के लिए.
- 2x पट्टिका मीडिया और immobiliz की 1 मिक्स: संक्रमण के बाद, एक 1 का उपयोग अच्छी तरह से (तालिका 2) में inoculums सीधे मध्यम immobilizing का एक उपयुक्त मात्रा उपरिशायीचुनाव के ओवरले आईएनजी (सीएमसी, agarose या Avicel). धीरे मिश्रण करने के लिए रॉक.
- 0.6-1.2% Avicel ओवरले माध्यम की एक काम समाधान प्राप्त करने के लिए 2.4% आरटी शेयर Avicel - गरम 2x पट्टिका मीडिया और 1.2 के साथ 1: तरल ओवरले के लिए, 1 मिश्रण.
- 0.3 की एक अंतिम agarose / ओवरले एकाग्रता प्राप्त करने तापमान संतुलित करने के लिए 30 मिनट के लिए एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गरम 2x पट्टिका मीडिया के 1 मिश्रण और गर्म 0.6% agarose के एक शेयर समाधान, जगह: एक agarose ओवरले के लिए, एक 1 का उपयोग %.
- सीएमसी के लिए, एक 2% शेयर समाधान तैयार और agarose ओवरले के लिए वर्णित के रूप में व्यवहार करते हैं.
- Monolayer के लिए ओवरले आवेदन, हमेशा monolayer के नुकसान को रोकने के लिए एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी में गर्म agarose या सीएमसी संतुलित करना. समाधान गर्म है सुनिश्चित करें, लेकिन कोशिका मृत्यु और कम वायरल titers को रोकने के लिए स्पर्श करने के लिए गर्म नहीं. अधिकांश agarose ओवरले, 42 डिग्री सेल्सियस से नीचे जमना शुरू हो जल्दी से काम करते हैं और / या निपटने जबकि दृढ़ीभवन को रोकने के लिए छोटे समूहों को तैयार करना होगा.
- ओवरले के बाद इसके अलावा, स्पष्ट रूप से गणनीय हैं कि अलग सजीले टुकड़े का उत्पादन करने के लिए प्लेटें सेते हैं. पट्टिका गठन, वायरस के आधार पर 2-14 दिनों का विश्लेषण किया जा रहा है 1 टेबल ले सकते हैं.
नोट: तरल मढ़ा प्लेटें इनक्यूबेटर में रखा जाता है एक बार, उन्हें कदम नहीं है. ऊष्मायन अवधि के दौरान तरल ओवरले के आंदोलन लिप्त सजीले टुकड़े में परिणाम होगा. Agarose और सीएमसी ओवरले semisolid हैं और चले गए या पट्टिका विकास पर नजर रखने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत समय-समय पर चेक किया जा सकता है.
3. फिक्सिंग और धुंधला प्रकोष्ठों
- , कोशिकाओं को ठीक टपकना या Avicel ओवरले महाप्राण, और (एक 6 अच्छी तरह से थाली के लिए <1 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) रात भर के लिए 30 मिनट के लिए 10% formaldehyde समाधान का उपयोग कोशिकाओं को ठीक करने के लिए.
- Agarose या सीएमसी के लिए, सीधे 1 घंटा रातोंरात करने के लिए ओवरले के लिए formaldehyde समाधान जोड़ें.
नोट: नमूने लगानेवाला में समय की विस्तारित अवधि के लिए रखा जा सकता है यह करता है प्रदान कीलुप्त हो जाना और इस monolayer विकृत कर सकते हैं के रूप में बाहर सूखी नहीं.
- Agarose या सीएमसी के लिए, सीधे 1 घंटा रातोंरात करने के लिए ओवरले के लिए formaldehyde समाधान जोड़ें.
- पहले धुंधला हो जाना और निर्धारण के बाद, formaldehyde के त्यागने और एक रंग के साथ मैन्युअल पानी चल रहा है या किसी के साथ agarose और सीएमसी के लिए semisolid प्लग हटा दें. धुंधला करने से पहले अवशिष्ट ओवरले / लगानेवाला दूर करने के लिए पानी के साथ Avicel सजीले कुल्ला.
- धुंधला के लिए, ~ 15 मिनट के लिए क्रिस्टल बैंगनी समाधान की एक न्यूनतम राशि के साथ कोशिकाओं को कवर किया. रॉक प्लेटें यदि आवश्यक हो तो भी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए.
- धीरे पानी के साथ क्रिस्टल बैंगनी दाग से धो लें. एक बार, तय दाग, और भविष्य के विश्लेषण के लिए अनिश्चितकाल के लिए, दुकान सजीले सूख गया.
4. वायरल titers निर्धारण
- एक ही कमजोर पड़ने के किसी भी तकनीकी प्रतिकृति के लिए औसत ले रही है, प्रत्येक कुएं में सजीले टुकड़े गणना. बड़ी थाली प्रारूपों के लिए, 100 सजीले टुकड़े से अधिक 5 से कम या अधिक से अधिक डिस्काउंट कुओं. पट्टिका आकार और आकृति विज्ञान का ध्यान रखना. नकारात्मक नियंत्रण एक समान monolayer होना चाहिए औरएक संदर्भ नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक कमजोर पड़ने और कुल कमजोर पड़ने कारक का उलटा लिए सजीले टुकड़े की औसत संख्या लेकर शेयर नमूना के वायरल अनुमापांक निर्धारित करते हैं.
नोट: एक उदाहरण के रूप में, 30 और 32 सजीले 1 एक्स 10 -7 कमजोर पड़ने [31 (औसत) / 10 -7 (कमजोर पड़ने) x 0.4 मिलीलीटर (inoculum)] 7.75 की एक अनुमापांक उपज होता एक्स 10 8 pfu की प्रतिकृति के लिए गिना / एमएल.
Representative Results
सही रूप में वायरल titers का आकलन करने के लिए पट्टिका assays के क्षमता कई कारकों पर निर्भर करता है: उपयुक्त मेजबान सेल चयन, उचित मीडिया और सेलुलर और वायरल व्यवहार्यता के लिए विकास की स्थिति, स्थिर वायरल प्रसार, और वायरल ऊष्मायन अवधि का सही निर्धारण अलग के लिए पर्याप्त समय की अनुमति और गणनीय पट्टिका गठन.
नमूना प्रकार भिन्न भर ओवरले चयन, ऊष्मायन अवधि, और पट्टिका आकृति विज्ञान: इस अध्ययन के लिए, तीन प्रतिनिधि परिवारों से वायरस में मतभेद प्रदर्शित करने के लिए चुने गए हैं. वेनेजुएला इक्वाइन इन्सेफेलाइटिस (VEEV) घोड़े प्रजातियों और मानव में महत्वपूर्ण रोग का कारण और Togaviridae परिवार का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं जो एक (+) ssRNA वायरल मॉडल के रूप में चयनित किया गया था. इन्फ्लुएंजा बी ताइवान तनाव, एक खंडों (-) मुख्य रूप से मनुष्यों को संक्रमित ssRNA वायरस, Orthomyxoviridae परिवार का प्रतिनिधित्व करता है. दरार घाटी बुखार वायरस (RVFV), एक (-) मुख्य रूप से आर्थोपोड्स संक्रमण ssRNA सन्धिपाद का जन्म वायरस,जुगाली करने और मानव, Bunyaviridae परिवार के एक प्रतिनिधि के रूप में चयनित किया गया था.
RVFV (चित्रा 1) के लिए, titers 72 घंटे के बाद संक्रमण के लिए पक्ष द्वारा साइड incubated रहे थे जो सीएमसी, agarose, या Avicel ओवरले का उपयोग एक 12 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में RVFV के संयोजक लाइव तनु MP12 तनाव का एक शेयर समाधान से निर्धारित किया गया है (HPI). से 10 -4 10 -7 को लेकर dilutions के दिखा एक प्रतिनिधि थाली सीएमसी का उपयोग पैनल ए सजीले टुकड़े में देखा और agarose ओवरले एक अच्छी तरह से परिभाषित परिपत्र सीमा के साथ, छोटे स्पष्ट, और विशिष्ट सजीले दिखाया जा सकता है. एक तरल ओवरले के साथ सजीले टुकड़े से थोड़ा अधिक प्रचुर मात्रा में और सीएमसी सजीले agarose और की तुलना में बड़े थे, और एक कम विशिष्ट सीमा प्रदान की है. वायरल titers ओवरले के सभी तुलनात्मक प्रदर्शन के साथ पैनल बी में तुलना की गई.
Reproduc निर्धारित करने के लिए एक बड़ा नमूना आकार के साथ MP12 के लिए ओवरले के बीच एक स्पष्ट दृश्य तुलना प्राप्त करने के लिएibility, एक 6 अच्छी तरह से थाली भी तीन प्रतियों (चित्रा 2) में trialed गया था. 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में, एक सीएमसी ओवरले का उपयोग एक-दूसरे के आकार में बराबर थे जो agarose या तरल ओवरले, या तो की तुलना में छोटे सजीले दिखाया. वायरल titers सभी तीन ओवरले (पैनल डी) के बीच समान थे, agarose और तरल ओवरले में गठित सजीले टुकड़े के कारण उनकी वृद्धि की आकार को गिनने के लिए आसान साबित हुआ.
स्पष्ट रूप से विविध (चित्रा 3 ए) भिन्न ओवरले के बीच RVFV, VEEV titers और पट्टिका आकृति विज्ञान के साथ इसके विपरीत. पट्टिका आकार और संवेदनशीलता (पैनल बी) की कीमत पर, एक 12 अच्छी तरह से थाली प्रारूप का उपयोग करते समय सीएमसी ओवरले में गठित सजीले टुकड़े एक स्पष्ट और विशिष्ट आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया. सीएमसी के विपरीत, agarose और तरल ओवरले का उपयोग VEEV प्रतिकृति को कम वायरल निषेध और वृद्धि की संवेदनशीलता का संकेत है, में काफी बड़ा सजीले हुई. केवल एपी में सीएमसी बनाम agarose की तुलना करते हैं तो यह पहले से तय हुई थीकोल जुआरेज एट अल. 4 द्वारा प्रकाशित. Agarose और तरल ओवरले सीएमसी से बड़ा सजीले टुकड़े का उत्पादन करते हैं, सजीले खराब सीमाओं परिभाषित और सबसे बड़ी सीमा प्रसार उपलब्ध कराने तरल ओवरले के साथ, एक 12 अच्छी तरह प्रारूप में गिनती के लिए मुश्किल थे. सजीले 6 अच्छी तरह प्लेटें (चित्रा 4) में trialed थे, बड़ा 6 अच्छी तरह से प्रारूप के संदर्भ में सीएमसी ओवरले के लिए बेहतर साबित agarose के साथ, 12 अच्छी तरह प्रारूप में अंतर करना मुश्किल थे कि खुलकर बड़े सजीले और तरल ओवरले का मुद्दा नकार दिया पट्टिका परिभाषा और संवेदनशीलता (चित्रा 4D).
इसकी तुलना में RVFV या इस तरह के एक बाहरी प्रोटीज की आवश्यकता के रूप में, plaquing जब VEEV, इन्फ्लूएंजा कई अद्वितीय चुनौतियों प्रदान करता है. agarose के ब्रांडों भिन्न रूप में मामूली संशोधनों होना है जब महत्वपूर्ण परिवर्तन का उल्लेख किया गया है के रूप में अलग-अलग ओवरले चयन करने के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस की संवेदनशीलता भी अच्छी तरह से अतीत में दर्ज़ किया गया हैएन 9 इस्तेमाल किया.
दिलचस्प बात यह है इन्फ्लुएंजा बी ताइवान तनाव के लिए, ओवरले के रूप में सीएमसी का उपयोग गिनती करना मुश्किल थे और (चित्रा 5A) मज़बूती से स्कोर करने के लिए मुश्किल साबित हुआ है कि स्पष्ट रूप से छोटे सजीले टुकड़े में हुई. एक agarose ओवरले का उपयोग सबसे अच्छा सजीले टुकड़े (पैनल सी) प्रदान की है, और (वृद्धि हुई monolayer व्यवहार्यता की संभावना की वजह से) एक गहरे रंग की पृष्ठभूमि दाग में हुई, और तरल ओवरले का उपयोग (पैनल बी को प्रत्यक्ष तुलना में साफ और तेज सजीले टुकड़े से पता चला ).
ऐसे agarose और सीएमसी के रूप में ठोस और semisolid ओवरले अधिक तरल पॉलिमर, की एक विशिष्ट लाभ, हटाने और आवेदन के आराम में निहित है. Semisolid ओवरले हीटिंग की आवश्यकता होती है, और हैंडलिंग और हटाने जब दृढ़ीभवन समस्याग्रस्त साबित हो सकता है. इन फायदों को भुनाने के लिए और RVFV के लिए एक उच्च throughput ढंग से Avicel के उपयोग की व्यावहारिकता का निर्धारण करने के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप अलग ओवरले concentrati पर trialed गया थाऑन (चित्रा 6). RVFV सांसद-12 के लिए, dilutions के Avicel के दोनों 0.6 और 1.2% अंतिम सांद्रता में चार प्रतियों में प्रदर्शन किया गया. ओवरले आवेदन और हटाने reproducibility के एक उच्च स्तर का प्रदर्शन, प्रतिकृति के बीच में या विख्यात सांद्रता के बीच कोई स्पष्ट अंतर के साथ, सरल साबित कर दिया. स्कोरिंग करते हैं, सजीले RVFV के लिए एक उच्च throughput ढंग से तरल ओवरले के उपयोग की व्यवहार्यता का प्रदर्शन, नग्न आंखों के लिए अलग और गणनीय थे.
चित्रा 1:. 12 अच्छी तरह प्लेटें उपयोग RVFV पट्टिका ओवरले तुलना Veros 12 अच्छी तरह प्लेटें में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं पर चढ़ाया और MP12 की इसी क्रमानुसार पतला शुरू करने नमूना का उपयोग कर 200 μl से संक्रमित थे. संक्रमण 0.3% agarose के 1.5 मिलीलीटर ओवरले, 0.6% Avicel, या 1% सीएमसी (अंतिम सी के बादपैनल ए सजीले टुकड़े में प्रदर्शन गिना और पैनल बी में titered थे के रूप में oncentrations), सीधे ओवरले तुलना करने के क्रम में लागू किया गया.
चित्रा 2:. 6 अच्छी तरह प्लेटों के उपयोग RVFV पट्टिका ओवरले तुलना Veros 6 अच्छी तरह प्लेटों में 5 x 10 5 कोशिकाओं पर चढ़ाया और MP12 की इसी क्रमानुसार पतला शुरू करने नमूना का उपयोग कर 400 μl से संक्रमित थे. पैनलों एसी के लिए वर्णित के रूप में पैनल में प्रदर्शन के रूप में 0.3% agarose के तीन मिलीलीटर ओवरले, 0.6% Avicel, या 1% सीएमसी, सीधे ओवरले तुलना करने के क्रम में लागू किया गया, बी, और सी अलग प्रयोगों के साथ, हूबहू किए गए सजीले गिना और पैनल डी (एन = 3) में titered.
चित्रा 3: <12 अच्छी तरह प्लेटें उपयोग मजबूत> VEEV पट्टिका ओवरले तुलना. Veros 12 अच्छी तरह प्लेटें में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं पर चढ़ाया और VEEV टीसी-83 टीका तनाव की इसी क्रमानुसार पतला शुरू करने नमूना का उपयोग कर 200 μl से संक्रमित थे. पैनल ए सजीले टुकड़े में प्रदर्शन के रूप में संक्रमण के बाद 0.3% agarose के 1.5 मिलीलीटर ओवरले, 0.6% Avicel, या 1% सीएमसी, पैनल बी में गिना और titered थे सीधे ओवरले तुलना करने के क्रम में लागू किया गया
चित्रा 4:. 6 अच्छी तरह प्लेटों के उपयोग वी EEV पट्टिका ओवरले तुलना Veros 6 अच्छी तरह प्लेटों में 5 x 10 5 कोशिकाओं पर चढ़ाया और 400 μl VEEV टीसी-83 का एक ही क्रमानुसार पतला शुरू करने नमूना का उपयोग से संक्रमित थे. प्रदर्शन के रूप में संक्रमण के बाद, 0.3% agarose के 3 मिलीग्राम ओवरले, 0.6% Avicel, या एक 1% सीएमसी, सीधे ओवरले तुलना करने के क्रम में लागू किया गयासी गिना और पैनल डी में titered सजीले टुकड़े के साथ, (एन = 3) - पैनल के लिए वर्णित के रूप में पैनल में, बी और सी अलग प्रयोगों हूबहू किए गए.
चित्रा 5: इन्फ्लुएंजा पट्टिका ओवरले तुलना MDCK कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटों में 5 x 10 5 कोशिकाओं पर चढ़ाया और इन्फ्लूएंजा बी ताइवान की इसी क्रमानुसार पतला शुरू करने नमूना का उपयोग inoculum के 400 μl से संक्रमित थे.. FBS के वायरल फ्यूजन के लिए आवश्यक हैं जो कुछ प्रोटिएजों के निषेध के माध्यम से इन्फ्लुएंजा के प्रसार को बाधित कर सकते हैं के रूप में कोई भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), विकास मीडिया या ओवरले में इस्तेमाल किया गया था. TPCK-ट्रिप्सिन मेजबान कोशिकाओं के साथ वायरल फ्यूजन और प्रवेश की सुविधा के लिए आवेदन करने से पहले ओवरले के सभी को जोड़ा गया है. संक्रमण के बाद, 0.3% agarose के 3 मिलीग्राम ओवरले, 0.6% Avicel, या 1% सीएमसी सीधे तुलना करने के क्रम में लागू किया गयासी, पैनल डी में गिना और titered सजीले टुकड़े के साथ (एन = 3) - पैनल में वर्णित के रूप में पैनल ए, बी और सी अलग प्रयोगों में प्रदर्शन के रूप में ओवरले हूबहू किए गए. एक औसत सीएमसी सजीले टुकड़े के लिए लिया गया था जबकि वे फैलाना सीमाओं और बहुत छोटे पट्टिका आकार प्रदर्शन के रूप में वे मज़बूती से गिनती करने के लिए मुश्किल साबित हुआ.
चित्रा 6:. उच्च throughput पट्टिका ओवरले Veros की एक 96 अच्छी तरह से थाली चार प्रतियों में, 1 घंटे के लिए RVFV MP12 की इसी क्रमानुसार पतला शुरू करने नमूना का उपयोग inoculum के 50 μl से संक्रमित थे, अच्छी तरह से प्रति 3 एक्स 10 4 कोशिकाओं पर चढ़ाया. ओवरले के लिए, Avicel की 0.6 और 1.2% अंतिम सांद्रता एक उच्च throughput ढंग, पैनलों ए और बी में तरल ओवरले के उपयोग की व्यवहार्यता और reproducibility निर्धारित करने के क्रम में trialed गया.
| RVFV | VEEV | इन्फ्लुएंजा बी | |
| सेल प्रकार | वेरो | वेरो | MDCK |
| संक्रमण अवधि | 1 घंटा | 1 घंटा | 45 मिनट |
| ऊष्मायन समय | 3 दिन | 2 दिन | 3 दिन |
तालिका 1: पट्टिका परख टीका शर्तें और सेल प्रकार
| RVFV | VEEV | इन्फ्लुएंजा बी | |
| सेल प्रकार | वेरो | वेरो | MDCK |
| ग्रोथ के प्रकार | DMEM 1 | DMEM 1 | DMEM 2 |
| फलक मीडिया | 2xEMEM एक | 2xEMEM एक | 2xEMEM बी |
1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% एल Glutamine, 1% Penicllin / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक.
2. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 1% एल Glutamine, 1% Penicllin / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.2% गोजातीय सीरम albumin, 0.025% HEPES, DEAE-dextran 50ug / एमएल के साथ पूरक.
5% FBS के (25 मिलीग्राम), 1% न्यूनतम आवश्यक अमीनो एसिड (5 एमएल), 1% सोडियम पाइरूवेट (5 एमएल), 1% एल Glutamine (5 एमएल) के साथ पूरक ए 2x न्यूनतम आवश्यक मीडिया (500 मिलीलीटर), 2% पेन / Strep (10 एमएल).
0.2% गोजातीय सीरम albumin, 1% न्यूनतम आवश्यक अमीनो एसिड (5 एमएल), 50ug / एमएल, 0.025% HEPES, DEAE-dextran, trypsin-TPCK के साथ पूरक बी 2x न्यूनतम आवश्यक मीडिया (500 मिलीलीटर) *
* तैयारी करने के लिए बस से पहले, 25 प्रति 1 μl जोड़नेविभाज्य 2 माइक्रोग्राम प्रति TPCK-trypsin के / एमएल शेयर की मिलीलीटर आप सजीले टुकड़े के लिए agarose के साथ मिश्रण करने के लिए उपयोग किया जाएगा.
तालिका 2: फलक और वायरल / सेलुलर विकास Medias
| RVFV | VEEV | इन्फ्लुएंजा बी | |
| सेल प्रकार | वेरो | वेरो | MDCK |
| संक्रमण अवधि | 1 घंटा | 1 घंटा | 45 मिनट |
| ऊष्मायन समय | 3 दिन | 2 दिन | 3 दिन |
इतने लंबे समय के बाँझपन बनाए रखा है के रूप में बनाया जब ओवरले समाधान समाप्त नहीं होगा.
तालिका 3: ओवरले शेयर
| 6 अच्छी तरह से | 12 अच्छी तरह से | 96 | |
| कोशिकाओं की # / अच्छी तरह से | 5 एक्स 10 5 | 2.5 एक्स 10 5 | 3 एक्स 10 4 |
| Innoculum की मात्रा (μl) | 400 | 200 | 50 |
| ओवरले की मात्रा (एमएल) | 3 | 1.5 | 0.100 |
सारणी 4: प्लेट प्रारूप
Discussion
स्थितियों में काफी भिन्न हो सकते हैं के रूप में एक सफल पट्टिका परख के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक प्रश्न में विशेष वायरल संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन में निहित है. ध्यान में रखना महत्वपूर्ण बातें हैं: स्पष्ट रूप से सजीले अंतर करने के क्रम में प्रश्न में वायरस, उचित वायरल विकास की स्थिति, पर्याप्त कमजोर पड़ने पर्वतमाला के साथ सेलुलर अनुकूलता की मेजबानी, और प्रश्न में कोशिकाओं और वायरस के लिए सही ओवरले चयन और धुंधला हो जाना.
VEEV और RVFV दोनों ही मेजबान सेल प्रकार के कई उपयोग बहुत समान परिस्थितियों में बढ़ने जबकि, पट्टिका आकृति विज्ञान और विकास कैनेटीक्स में मतभेद काफी भिन्नता है. परंपरागत रूप से रक्तस्रावी बुखार वायरस और alphaviruses के लिए एक प्रचार और सूचक सेल लाइन के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो पट्टिका assays के लिए वेरो कोशिकाओं का उपयोग करते समय, VEEV आम तौर पर RVFV से अधिक titers तक की होती है और 48 HPI 4 में बड़ी वर्दी सजीले टुकड़े के विकास, प्रतिकृति कैनेटीक्स वृद्धि हुई दर्शाता है, 10-12. VEEV के विपरीत, RVFV 72 HPI की आवश्यकता है और आम तौर पर आकार में बहुत छोटे और चर रहे हैं कि सजीले टुकड़े को दर्शाता है.
RVFV के विरोध और VEEV में, इन्फ्लूएंजा वायरस बेहद मेजबान सेल विशिष्ट है और टिशू कल्चर के माध्यम से प्रचार करने के लिए मुश्किल हो सकता है. इन्फ्लूएंजा वायरस के लिए, वायरल प्रविष्टि और फ्यूजन आम तौर पर मेजबान सेल के α-सियालिक एसिड सतह रिसेप्टर के साथ बंधन के माध्यम से लक्ष्य कोशिका में प्रवेश mediates जो वायरल ग्लाइकोप्रोटीन hamagglutinin (हेक्टेयर), के साथ सेल सतह रिसेप्टर के बंधन से शुरू की है. हा सभी इन्फ्लुएंजा वायरस की झिल्ली लिफाफे में मौजूद है और एक विशिष्ट मेजबान सेल प्रोटीज द्वारा सब यूनिटों HA1 और HA2 में दरार की आवश्यकता है कि एक trimeric ग्लाइकोप्रोटीन है. आगे मुद्दा जटिल, इन दरार साइटों को अक्सर वायरल उपभेदों 13 के बीच भिन्न हो सकते हैं. विशिष्ट ऊतकों तक ही सीमित है हा cleaving में सक्षम proteases की अभिव्यक्ति के रूप में, गिरफ्तारी proteasesई अक्सर चयनित मेजबान सेल 13 में वायरल फ्यूजन और प्रवेश की सुविधा के क्रम में सेल संस्कृति मीडिया में जोड़ा. वायरल हा 14,15 के प्रोटियोलिटिक सक्रियण के माध्यम से (किसी भी trypsin निष्क्रिय सीरम की अनुपस्थिति में) बहु-चक्र प्रतिकृति की सुविधा: TPCK-ट्रिप्सिन MDCK और वेरो कोशिकाओं दोनों साथ सेल संस्कृति में प्रयोग किया जाता है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटीज का एक उदाहरण है.
इस अध्ययन और दूसरों में प्रदर्शन के रूप में, वायरल जीवन चक्र में मतभेद भिन्न वर्गों और वायरस के प्रजातियों के बीच महत्वपूर्ण प्रसरण साथ ओवरले चयन, थाली प्रारूपों, और संग्रह टाइम्स, प्रभावित कर सकते हैं. हमारे अध्ययन में, agarose ओवरले वायरस और सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला के बीच में अपनी उपयोगिता मजबूत, सीएमसी या RVFV और इन्फ्लूएंजा बी वायरस दोनों के लिए तरल ओवरले या तो अधिक से अधिक titers पर स्पष्ट सजीले टुकड़े का प्रदर्शन किया. बहुत ठोस प्लग और सरलीकृत धुंधला को दूर करने में सहायता प्राप्त agarose की एक कम अंतिम एकाग्रता का उपयोग करना. सीएमसी समग्र पी का प्रदर्शनइन्फ्लुएंजा बी वायरस के लिए सभी तीन का परीक्षण वायरस और उत्पादन बहुत छोटे और अस्पष्ट सजीले टुकड़े के लिए एक ओवरले के रूप में oorest प्रभावकारिता. समग्र सीएमसी कम से कम वांछनीय विशेषताओं का प्रदर्शन हालांकि, तेजी से बढ़ रही है और यह अनुमापांक में केवल एक न्यूनतम कमी के साथ पट्टिका आकार को कम करने के लिए प्रकट किया था अत्यंत ज़हरीले वायरस, फायदेमंद साबित हो सकता है में इसके उपयोग के. तरल ओवरले यह उपयोग में आसानी वृद्धि हुई है, तैयार करने के लिए बेहद आसान था कि में सबसे बहुमुखी साबित हुई, और चयनित वायरस के सभी भर agarose के बराबर था. एक उच्च throughput 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप, आवेदन और हटाने में पारंपरिक ओवरले के साथ के रूप में दृढ़ीभवन की वजह से हिचकते हैं, और सटीक और अनुरूप परिणाम प्रदान नहीं किया गया. प्लेटों पहले विशेषता प्रतिकृति कैनेटीक्स के साथ वायरस के लिए इस अनुकूलन सीमित संग्रह के बिंदु तक स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है के रूप में तरल ओवरले का उपयोग करते समय एक विचार अपारदर्शी रंग और पट्टिका गठन की निगरानी के लिए अक्षमता में निहित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2x EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 °C |
| MEM 100x | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
References
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