Abstract
Platebedømmelser er fortsatt en av de mest nøyaktige metoder for direkte kvantifisering av infektiøse virus og antivirale stoffer gjennom telling av adskilte plakker (smittsomme enheter og cellulære døde soner) i cellekultur. Her viser vi hvordan du utfører en grunnleggende plakkassay, og hvordan ulik overlegg og teknikker kan påvirke plakk dannelse og produksjon. Vanligvis faste eller halvfaste overleggs substrater, slik som agarose eller karboksymetylcellulose, har blitt brukt til å begrense viral spredning, hindrer tilfeldig infeksjon gjennom det flytende vekstmedium. Immobiliserte overlegg begrense celleinfeksjon til det umiddelbart omgivende monolaget, slik at dannelsen av diskrete tellbar foci og påfølgende plakkdannelse. For å overvinne de vanskeligheter som ligger i å bruke tradisjonelle overlegg, har en ny væske overlegg å benytte mikrokrystallinsk cellulose og karboksymetylcellulose natrium blitt stadig mer brukt som en erstatning i standardenplakkanalyse. Flytende overlay platebedømmelser lett kan utføres i enten standard 6 eller 12 brønners plate formater som per tradisjonelle teknikker og krever ikke spesielt utstyr. På grunn av sin flytende tilstand og etterfølgende enkel påføring og fjerning, kan mikrokultur plateformater alternativt bli brukt som en hurtig, nøyaktig og høy gjennomstrømning alternativ til større skala virale titreringer. Bruk av et ikke oppvarmet viskøs væske polymer tilbyr muligheten for å effektivisere arbeidet, sparer reagenser, inkubatorplass, og øker driftssikkerheten når det brukes i tradisjonelle eller høy containment labs som ingen reagent oppvarming eller glass er nødvendig. Flytende overlegg kan også vise seg mer sensitiv enn tradisjonelle overlegg for visse varme labile virus.
Introduction
Den nøyaktige isolering og kvantifisering av levedyktige virusprøver har konsekvent vært en pågående forskning mål i virologi. Det var ikke før advent av plakk analysen i 1952 som et middel til å kvantitativt og kvalitativt beregne dyre virustiter ble først utviklet 1,2. Denne teknikken ble først tilpasset og modifisert fra fag-assays, som tidligere var blitt anvendt til å beregne titere av lager bakteriofager i plantebiologi 1,2. Selv om alternative midler for viral kvantifisering har senere blitt utviklet og tilpasset, for eksempel immunoanalyser, fluorescens og transmisjonselektronmikroskopi, avstembar resistive pulsføle (trps), strømningscytometri, rekombinante reportersystemer, og kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) disse metodene mislykkes i å identifisere og kvantifisere replikering kompetente virons 1,3. Mens fremskritt innen teknologi og teknikker fortsette å avgrense og endre landskapet; plaque-analyser fortsette å representere gullstandarden i å bestemme viruskonsentrasjoner for smittsomme lytiske virons 1,4.
Under en plaque-analysen, er et konfluent monolag av vertsceller infisert med et virus av lytisk en ukjent konsentrasjon som er blitt seriefortynnet til et tellbart område, typisk mellom 5 til 100 virioner. Infiserte monolag blir deretter dekket med en immobiliserende overlegg medium for å hindre viral infeksjon fra ukritisk sprer seg gjennom enten mekanisk eller convectional strømning av det flytende medium i løpet av viral propagering. Mens faste eller halvfaste overlegg slik som agarose, metylcellulose eller karboksymetylcellulose (CMC) har tradisjonelt vært benyttet, har flytende overlegg blitt et stadig mer attraktivt alternativ med utvikling av nye flytende overlegg for eksempel Avicel 5- 7. Platebedømmelser benytter flytende versus tradisjonelle overlegg har flere fordeler som overlegget kan være epleIED ved romtemperatur, og påføring og fjerning er betydelig enklere. Som flytende overlegg ikke krever oppvarming, kan delikate og varme labile virus også vise seg lettere å plakk.
Etter den innledende infeksjon og anvendelse av immobiliseringsinnretningen overlegg, individuelle plakker eller soner av celledød, vil begynne å utvikle seg som virusinfeksjon og replikasjon er begrenset til den omgivende monolag. Infiserte celler vil fortsette replikering-lysis-infeksjon syklus, videre spre infeksjonen, noe som resulterer i stadig mer distinkte og diskrete plakk. Avhengig av det virale vekstkinetikk og vertscelle som brukes, vil et synlig plakk danner normalt i løpet av 2-14 dager. Cellulære monolag kan så bli regnet med en standard lysfelt-mikroskop, eller mer typisk faste og motfarget med nøytral rød eller krystall voldelig for lett å kunne identifisere plaketter med det blotte øye. Det finnes et bredt utvalg av plakk mot flekker tilgjengelig, hver offer thEIR spesifikke fordeler og ulemper. Krystallfiolett blir typisk tilsatt på tidspunktet for innsamling og etter fiksering / fjerning av overlegget, og gir en rask og distinkt telleren flekken som gir mulighet for identifisering av meget små plakk når blandet morfologi er til stede. Nøytral rødt har fordelen av tidlig søknad og konstant kontakt med overlegg, noe som åpner for live overvåking av utviklingen plakkdannelse, noe som er spesielt nyttig når du arbeider med et ukjent virus eller replikering kinetikk. Vi har imidlertid funnet ut at farging er vanligvis ikke like tydelig når du bruker nøytral rødt. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) gir flere fordeler, da de gule fargede flekker fargestoff lever celler og mørk blå virus-plakk kan telles uten fjerning av overlegget så med nøytral rødt. Den høye kontrasten mellom levende og døde celler som gis av MTT tillater også påvisning av små plaketter på et tidligere tidspunkt etter infeksjon, Selv om lagring ville fortsatt kreve fjerning av overlegget 8. Som krystallfiolett kan rett og slett gjort i en løsning av vann og alkohol, og gir en høy grad av følsomhet for blandet plakkmorfologi, har vi valgt det som en foretrukket og forenklet teller flekken for protokollen demonstrert som vi benytter flere familier av godt karakteriserte virus.
Etter festing og flekker den infiserte cellemonolayer, er plaketter telles for å titrere virus lager prøver i form av plakkdannende enheter (PFU) per milliliter. En log fall bør bemerkes mellom seriefortynninger og, avhengig av platestørrelse, mellom 5-100 plakker talt, med en negativ kontroll som brukes som en referanse. Statistisk prøvene vil variere med 10% for hver 100 plaketter telles når man sammenligner utvalget gjentak 3. Fordelen ved å bruke plaque-assays for å bestemme virale titere ligger i deres evne til å kvantifisere det faktiske antallet infeksiøse viruspartikler wTVen på prøven. Som flere viruspartikler kan potensielt infisere en enkelt celle, er terminologien enheter versus virons brukt under plakk titreringer 1,2.
Plakkmorfologi kan variere dramatisk i henhold til forskjellige vekstbetingelser, og mellom virale arter. Plakk størrelse, klarhet, border definisjon, og fordelingen bør alle bli notert som de kan gi verdifull informasjon om vekst- og virulensfaktorer av viruset i spørsmålet.
Grunnleggende prinsipper plakkanalyse kan også tilpasses og modifiseres på en rekke forskjellige måter, for eksempel ved bruk av fokusdannende analyser (FFA). FFA ikke stole på cellelyse og kontra å påvise plakk dannelse, men heller ansette farging teknikker for å direkte påvise intracellulære virale proteiner gjennom merkede antistoffer. Økt følsomhet, redusert inkuberingstider etter smitte, og viktigst evne til å kvantifisere non-lytiske virus er all distinktFordelene ved ansettelse av FFA. Mens mye brukt, de kritiske begrensende faktorer i FFA i forhold til en tradisjonell plakkassay ligger i behovet for egnede antistoffer og evnen til bare å probe for virale protein subenheter versus faktiske 4 infektiøse virus.
For hensikten med denne studien, vil vi begrense oss til klassiske platebedømmelser og beskriver bruk av tradisjonelle faste og halvfaste overlegg (agarose og CMC), sammen med nye flytende Mikrokrystallincellulose overlegg.
Protocol
1. Utarbeidelse av celler og reagenser
- Dagen før analysen plate hensiktsmessige vertsceller for den aktuelle virus (tabell 1 og 2) ved 90 - 100% konfluens.
- Forbered feste løsning av 10% formaldehyd i dH 2 O. I eksempel, bland 5,56 ml av 36% aksje formaldehyd med 14,44 ml destillert H 2 O (dH 2 O).
MERK: Bruk passende sikker håndtering og ventilasjon ved bruk av formaldehyd. - Forbered krystallfiolett flekken: 1% Crystal Violet (CV) i 20% etanol og dH 2 O.
- Forbered 2x plakk media (celletype avhengig på 2x konsentrasjon, se tabell 2). Filter ved hjelp av en 0,2 mikrometer filter hvis noen reagenser er ikke steril.
- Utarbeidelse av immobilisere overlegg (Tabell 3)
- For flytende overlegg, lage en steril 2,4% løsning av Avicel i dH 2 O. For å unngå klumper, tilsett pulveret til en flaske som inneholder vann thved raskt å blande med en rørepinne, hell Avicel i sakte og rør raskt ved romtemperatur (RT). Når løsningen beviser for viskøs for en rørepinne til å homogenisere, bytte til en kolbe shaker for> 30 min med tung agitasjon for å sikre enda homogenisering.
MERK: Stamløsninger kan fremstilles ved lavere konsentrasjoner, men de løsninger som kan separere og må røres for å sikre homogenisering. Oppløsninger av virke Avicel kan brukes som strekker 0,6 til 3%. - Etter homogenisering, autoklaveres løsningen og oppbevar forseglet ved RT.
- For agarose og carboxymethylcellulose (CMC) overlegg, utarbeide en stamløsning i dH 2 O 2% CMC eller 0,6% agarose. Bland med en rørepinne og autoklav eller mikrobølgeovn til å bringe inn i løsningen.
- For flytende overlegg, lage en steril 2,4% løsning av Avicel i dH 2 O. For å unngå klumper, tilsett pulveret til en flaske som inneholder vann thved raskt å blande med en rørepinne, hell Avicel i sakte og rør raskt ved romtemperatur (RT). Når løsningen beviser for viskøs for en rørepinne til å homogenisere, bytte til en kolbe shaker for> 30 min med tung agitasjon for å sikre enda homogenisering.
2. Fortynninger og infeksjoner
- Dagen etter plating, visuelt sjekke confluency og levedyktighet av cellene før du starter analysen. Sørg standard cellular morfologi ennd en ~ 90% konfluent monoskikt er til stede.
- Utfør en tidoblet serie utvanning av smittsomme prøver. Bruk den cellulære vekstmedier for viral propagering som fortynningsmiddel (tabell 2). Varier antall fortynninger som kreves basert på forventet titer av virus i spørsmålet, og alltid bruke en infisert kontrollprøve til selvstendig sikre cellular levedyktighet og bistand i plakk identifikasjon.
- Fra de serielle fortynninger, infisere cellene i 45 min til 1 time (tabell 1). Bruke et tilstrekkelig volum av inokulum for å dekke cellene, samtidig holde volumet så lavt som mulig for å maksimere viral kontakt med monolaget (tabell 4). Forsiktig rockeplater hvert 20 min for å sikre jevn dekning og hindre cellemonolayer fra tørking.
- Etter infeksjonen, overlapper et passende volum av immobilisere medium direkte til Inoculum i brønnen (tabell 2) under anvendelse av en 1: 1 blanding av 2x plakk medier og den immobiliserteing overlegg av valg (CMC, agarose eller Avicel). Rist for å blande.
- For flytende overlegg, bland 1: 1 med varmet 2x plakk media og 1.2 til 2.4% RT lager Avicel å få en fungerende løsning 0,6-1,2% Avicel overlegg medium.
- For en agarose-overlegg, bruk av en 1: 1 blanding av varmet 2x plaque materiale og en stamløsning av oppvarmet 0,6% agarose, sted i et 56 ° C vannbad i 30 minutter for å ekvilibrere temperaturen oppnåelse av en endelig agarose / overlegg konsentrasjon på 0.3 %.
- For CMC, utarbeide en 2% stamløsning og behandles som beskrevet for agarose overlegg.
- Ved søknad overlegget til monolaget, alltid likevekt varmt agarose eller CMC i en 56 ° C vann for å unngå skade på monolaget. Sikre at løsningen er varmt, men ikke varmt å ta for å hindre celledød og reduserte virustiter. De fleste agarose overlegg vil begynne å stivne under 42 ° C, arbeide raskt og / eller forberede små grupper for å hindre størkning ved håndtering.
- Etter tilsetting av overlegg, inkuber plater for å produsere ulike plaketter som er klart tellbar. Plakkdannelse kan ta 2-14 dager, avhengig av viruset som blir analysert, tabell 1.
MERK: Når flytende overtrukket platene er plassert i kuvøse, ikke flytte dem. Bevegelse av flytende overlegg under inkubasjonstiden vil resultere i flekkete plakk. Agarose og CMC overlegg er semisolid og kan flyttes eller kontrolleres med jevne mellomrom under et lysmikroskop å overvåke plakk utvikling.
3. Feste og Farging Cells
- For å fikse cellene, hell av eller aspirer Avicel overlegg, og fikse celler ved bruk av 10% formaldehyd løsning for 30 min til over natten (<1 ml per brønn for en 6 brønn plate).
- For agarose eller CMC, direkte legge formaldehyd løsning på overlegget for 1 time til over natten.
MERK: Prøver kan oppbevares i lengre perioder i fiksativ såfremt det ikkeikke fordampe og tørke ut, da dette kan forvrenge monolaget.
- For agarose eller CMC, direkte legge formaldehyd løsning på overlegget for 1 time til over natten.
- Før farging og etter fiksering, kast formaldehyd og fjerne halvfaste plugger for agarosen og CMC med enten vann eller manuelt med en slikkepott. Skyll Avicel plaketter med vann for å fjerne gjenværende overlegget / fikseringsmiddel før farging.
- For farging, dekke cellene med en minimal mengde av krystallfiolett oppløsning ~ av 15 minutter. Rock plater om nødvendig for å sikre jevn dekning.
- Forsiktig vaske av krystallfiolett flekken med vann. Når fiksert, farget og tørket, lagre plaques på ubestemt tid for fremtidig analyse.
4. Bestemme virustiter
- Tell plakk i hver brønn, ta gjennomsnittet for eventuelle tekniske replikater av samme fortynning. For store plateformater, rabatt brønner med færre enn 5 eller høyere enn 100 plaketter. Ta note av plakk størrelse og morfologi. Den negative kontrollen skal ha en enhetlig monolayer ogkan brukes som en referansekontroll.
- Bestem den virale titer av bestanden prøven ved å ta det gjennomsnittlige antall plakker for en fortynning og den inverse av den totale fortynningsfaktor.
MERK: Som et eksempel, 30 og 32 plakk tellet for replikater av 1 x 10 -7 fortynning [31 (gjennomsnitt) / 10 -7 (fortynning) x 0,4 ml (inokulum)] ville gi en titer på 7,75 x 10 8 pfu / ml.
Representative Results
Muligheten av plakk-analyser for nøyaktig å vurdere viral titer er avhengig av tallrike faktorer: passende vertscelle, riktig valg medier og vekstbetingelser for cellulær og viral levedyktighet, immobilisert viral formering, og en nøyaktig bestemmelse av den virale inkubasjonsperiode for å tillate tilstrekkelig tid for distinkt og tellbar plakkdannelse.
For denne studien ble virus fra tre representative familier valgt å demonstrere forskjeller i: overlay utvalg, inkubasjonsperioder, og plakkmorfologi over ulike prøvetyper. Venezuelas Equine Encefalitt (VEEV) ble valgt som en (+) ssRNA viral modell, som kan forårsake betydelig sykdom hos hest arter og mennesker, og representerer Togaviridae familien. Influensa B Taiwan-stamme, et segmentert (-) ssRNA-viruset primært infiserer mennesker, representerer familien Orthomyxoviridae. Rift Valley fever virus (RVFV), en (-) ssRNA arthropod født viruset primært infiserer leddyr,drøvtyggere og mennesker, ble valgt som en representant for Bunyaviridae familien.
For RVFV (figur 1), ble titere bestemt fra en stamløsning av en rekombinant levende svekket stamme av RVFV MP12 i en 12 brønn plate-format anvendelse av CMC, agarose, eller Avicel overlegg som ble inkubert side-ved-side i 72 timer etter infeksjon (HPI). En representant plate som viser fortynninger fra 10 -4 til 10 -7 kan sees i panelet A. Plaques bruker CMC og agarose overlegg viste små, klare og tydelige plakk med en veldefinert sirkulær grensen. Plaketter med en flytende overlegg var litt mer rikelig og større i forhold til agarose og CMC plaketter, og gitt en mindre distinkt grensen. Virale titere ble sammenlignet i panel B med alle de overlegg å utføre forholdsvis flat.
For å oppnå en klarere visuell sammenligning mellom overlegg for MP12 sammen med en større prøvestørrelse for å bestemme reproduserendebilitet, en 6 brønners plate ble også trialed i triplikat (Fig 2). I 6 brønners plateformat, bruk av en CMC overlegg viste mindre enn plaques enten agarose eller flytende overlegg, som var sammenlignbare i størrelse til hverandre. Mens virustiter var lik mellom alle tre overlegg (Panel D), plaketter dannet i agarose og flytende overlegg viste seg lettere å telle på grunn av deres økte størrelse.
I motsetning til RVFV, VEEV titre og plakkmorfologi blant de ulike overlegg varierte markert (figur 3A). Plaques som dannes i CMC overlegg viste en klar og tydelig morfologi ved bruk av en 12 brønn plate-format, på bekostning av plakkstørrelse og følsomhet (panel B). I motsetning til CMC, bruk av agarose og væske overlegg resulterte i signifikant større plakker, som indikerer lavere viral inhibering og økt følsomhet for VEEV replikasjon. Dette ble tidligere bekreftet da utelukkende sammenligne agarose versus CMC i apaper publisert av Juarez et al. 4. Mens agarose og flytende overlegg produsert større plakk enn CMC, hadde plaketter dårlig definert grenser og var vanskelig å telle i en 12 brønners format, med flytende overlegg som gir størst grense diffusjon. Når plakk ble trialed i 6 brønners plater (figur 4), jo større seks godt format eliminert spørsmålet om åpenlyst store plaketter som var vanskelige å skille i 12 godt format, med agarose og flytende overlegg beviser overlegen til CMC overlegg i form av plakk definisjon og følsomt (figur 4D).
I forhold til RVFV eller VEEV, gir influensa flere unike utfordringer når plaquing, slik som kravet til en ekstern protease. Følsomheten av influensavirus til ulike overlay valgene har også blitt godt dokumentert i fortiden som vesentlige endringer har blitt bemerket når modifikasjoner som mindre som ulike merker av agarose har væreno brukt 9.
Interessant for Influensa B Taiwan belastning, bruk av CMC som et overlegg resulterte i markant mindre plakk som var vanskelig å telle, og viste seg vanskelig å pålitelig scorer (figur 5A). Bruken av en agarose-overlegg gitt de beste plakker (panel C), og resulterte i en mørkere bakgrunn flekk (sannsynligvis på grunn av øket monolag levedyktighet), og viste klarere og skarpere plakk i direkte forhold til bruken av den flytende overlegg (Panel B ).
En klar fordel med flytende polymerer enn faste og halvfaste overlegg, slik som agarose og CMC, ligger i den enkel fjerning og anvendelse. Halv-harde overlegg krever oppvarming, og størkning kan bevise problematisk ved håndtering og fjerning. For å kapitalisere på disse fordelene, og å bestemme praktiske utnytte Avicel i en high-throughput måte for RVFV, ble en 96 brønners plate format trialed på varierende overlay concentrations (figur 6). For RVFV MP-12, ble fortynninger utført i kvadruplikat i både 0,6 og 1,2% sluttkonsentrasjoner på Avicel. Overlay søknad og fjerning beviste enkel, med ingen åpenbare forskjeller mellom replikater eller mellom konsentrasjoner bemerket, viser en høy grad av reproduserbarhet. Når scoring, var plaketter distinkte og tellbar for det blotte øye, demonstrere gjennomførbarheten av å utnytte flytende overlegg i en høy gjennomstrømming måte for RVFV.
Figur 1:. RVFV plaque overleggs sammenligninger som anvender 12 brønners plater ble belagt Veros ved 2,5 x 10 5 celler i 12 brønners plater og infisert med 200 pl ved anvendelse av samme utgangs serielt fortynnet prøve av MP12. Etter infeksjon 1,5 ml overlegg på 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller 1% CMC (endelig concentrations), ble brukt for å direkte sammenligne overlegg som demonstrert i Panel A. Plaques ble talt opp og titered i Panel B.
Figur 2:. RVFV plaque overleggs sammenligninger som benytter seks brønns plater ble belagt ved Veros 5 x 10 5 celler i 6 brønners plater, og infisert med 400 pl ved anvendelse av samme utgangs serielt fortynnet prøve av MP12. Tre ml overlegg på 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller 1% CMC, ble anvendt for å direkte sammenligne overlegg som vist i panel A, B, og C. separate forsøk utført identisk som beskrevet for paneler AC, med plakk tellet og titrert i Panel D (N = 3).
Figur 3: <sterke> VEEV plaque overleggs sammenligninger som anvender 12-brønners plater. Veros ble platet ved 2,5 x 10 5 celler i 12 brønners plater og infisert med 200 pl ved anvendelse av samme utgangs serielt fortynnet prøve av VEEV TC-83 vaksinestammen. Etter infeksjon overlegg 1,5 ml av 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller 1% CMC, ble anvendt for å direkte sammenligne overlegg som vist i felt A. Plaques ble tellet og titrert i panel B.
Figur 4:. V EEV plakk overleggs sammenligninger som benytter seks brønns plater ble belagt Veros på 5 x 10 5 celler i 6 brønners plater, og infisert med 400 pl ved anvendelse av samme utgangsseriefortynnet prøve av VEEV TC-83. Etter infeksjon, 3 ml overlegg på 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller en 1% CMC, ble anvendt for å direkte sammenligne overlegg som demonstrerti Paneler A, B og C. separate forsøk utført identisk som beskrevet for Paneler A - C, med plakk tellet og titrert i Panel D (N = 3).
Figur 5: Influensa plaque overleggs sammenligninger MDCK-celler ble sådd ut i 5 x 10 5 celler i 6 brønners plater, og infisert med 400 pl av podestoff ved hjelp av den samme seriefortynnet prøve av utgangs Influensa B Taiwan.. Ingen føtalt bovint serum (FBS) ble anvendt i vekstmedier eller overlegg, som FBS kan inhibere Influensa forplantning gjennom hemming av visse proteaser som er nødvendige for viral fusjon. TPCK-trypsin ble lagt til alle overlegg før søknaden for å legge til rette for viral fusion og oppføring med vertscellene. Etter infeksjon ble 3 ml overlegg på 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller 1% CMC anvendt for å direkte sammenligneoverleggene Som vist i panel A, B og C. Separate forsøk ble utført identisk som beskrevet i Paneler A - C, med plakk tellet og titrert i Panel D (N = 3). Mens en gjennomsnittlig ble tatt for CMC plaketter beviste de er vanskelig å sikkert telle som de demonstrerte diffuse grenser og svært liten plakett størrelser.
Fig. 6: high throughput plakk overlegg En 96-brønners plate belagt med Veros på 3 x 10 4 celler pr brønn, ble infisert med 50 pl av podestoff ved hjelp av den samme seriefortynnet prøve av utgangs RVFV MP12 i 1 time, i kvadruplikat. For overleggene ble 0,6 og 1,2% sluttkonsentrasjoner på Avicel trialed for å bestemme gjennomførbarheten og reproduserbarheten av å utnytte flytende overlegg i en high-throughput måte, paneler A og B.
| RVFV | VEEV | Influensa B | |
| Celletype | Vero | Vero | MDCK |
| Infeksjon periode | 1 time | 1 time | 45 min |
| Inkubasjonstid | 3 dager | 2 dager | 3 dager |
Tabell 1: plakkassay Inokulering betingelser og celletyper
| RVFV | VEEV | Influensa B | |
| Celletype | Vero | Vero | MDCK |
| Vekst Type | DMEM 1 | DMEM 1 | DMEM 2 |
| Plakk Media | 2xEMEM A | 2xEMEM A | 2xEMEM B |
1. Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% L-glutamin, 1% Penicllin / streptomycin.
2. Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med 1% L-glutamin, 1% Penicllin / streptomycin, 0,2% bovint serumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50ug / ml.
A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) supplert med 5% FBS (25 ml), 1% minimum essensielle aminosyrer (5 ml), 1% natriumpyruvat (5 ml), 1% L-glutamin (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml).
B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) supplert med 0,2% bovin serum albumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-dekstran, TPCK-trypsin *
* Like før tilberedning, tilsett 1 mL per 25ml 2 mikrogram / ml lager av TPCK-Trypsin til delmengde du skal bruke til å blande med agarose for plakk.
Tabell 2: Plakk og Viral / Cellular Vekst Medias
| RVFV | VEEV | Influensa B | |
| Celletype | Vero | Vero | MDCK |
| Infeksjon periode | 1 time | 1 time | 45 min |
| Inkubasjonstid | 3 dager | 2 dager | 3 dager |
Overlay løsninger vil ikke utløper når laget så lenge som sterilitet opprettholdes.
Tabell 3: Overlegg Stock
| 6 godt | 12 godt | 96 vel | |
| # Av celler / brønn | 5 x 10 5 | 2,5 x 10 5 | 3 x 10 4 |
| Volum av inokulumet (pl) | 400 | 200 | 50 |
| volum av overlegget (ml) | 3 | 1.5 | 0.100 |
Tabell 4: Plate formater
Discussion
Den mest kritiske faktor for en vellykket plakkassay ligger i optimalisering av protokollen for den spesielle viruskultur aktuelle tilstander som kan variere betraktelig. Viktige punkter å ta hensyn til er: vert cellular kompatibilitet med viruset i spørsmålet, aktuelle virusvekstvilkår, tilstrekkelig fortynning områder for å klart skille plaketter, og korrekt overlay utvalg og farging for celler og virus i spørsmålet.
Mens VEEV og RVFV begge vokse under svært lignende betingelser under anvendelse av mange av de samme vertscelletyper, forskjeller i plakk-morfologi og vekstkinetikk kan variere betraktelig. Når du bruker Veroceller for platebedømmelser, som tradisjonelt har vært brukt som en forplantning og indikatorcellelinje for hemoragisk feber virus og alfavirus, VEEV vanligvis vokser til høyere titer enn RVFV og demonstrerer økt replikering kinetikk, utvikle store ensartede plaketter på 48 hpi 4, 10-12. I motsetning til VEEV, krever RVFV 72 hpi og demonstrerer plakk som vanligvis er mye mindre i størrelse og variabel.
I motsetning til RVFV og VEEV, er influensavirus sterkt spesifikk vertscelle, og kan være vanskelig å forplante seg gjennom vevskultur. For influensavirus, er viral inngang og sammensmelting normalt initiert ved binding av celleoverflate-reseptoren med viral glykoprotein hamagglutinin (HA), som medierer inntreden i målcellen gjennom binding med vertscellens α-sialinsyre overflatereseptoren. HA er en trimere glykoprotein som er tilstede i membranen omhylling av alle influensa virus og krever spalting inn i HA1 og HA2-underenhetene av en bestemt vertscelle-protease. For ytterligere å komplisere saken, kan disse spaltningsseter ofte varierer mellom virusstammer 13. Som ekspresjon av proteaser som er i stand til å spalte HA er begrenset til bestemte vev, proteaser are ofte tilsatt til cellekulturmedier for å lette viral fusjon og inntreden i den valgte vertscelle 13. TPCK-trypsin er ett eksempel på et vanlig brukt protease som anvendes i cellekultur med både MDCK og Vero-celler: legge til rette for multi-syklus replikasjon (i fravær av enhver inaktivering av trypsin serum) gjennom den proteolytiske aktivering av viral HA 14,15.
Som vist i denne studien og andre, kan forskjeller i viral livssyklus påvirker overlay valg, plateformater og innsamlings ganger, med betydelige variasjoner mellom ulike klasser og arter av virus. I vår studie, agarose overlegg demonstrert klarere plaketter på høyere titer enn enten CMC eller flytende overlegg for både RVFV og influensa B-virus, forsterke sin nytteverdi blant et bredt spekter av virus og celletyper. Ved hjelp av en lav endelig konsentrasjon av agarose sterkt hjulpet i å fjerne de solide plugger og forenklet farging. CMC generelle demonstrerte poorest effekt som et overlegg for alle tre virusene testet og produsert veldig små og utydelige plaketter for influensa B-virus. Selv om generelle CMC demonstrerte de minst ønskelige egenskaper, dets bruk i raskt voksende og svært virulente virus kunne bevise en fordel, da det synes å redusere plakk størrelse med bare en minimal reduksjon i titer. Den flytende overlegg viste seg å være den mest allsidige i at det var svært enkel å fremstille, økt brukervennlighet, og var sammenlignbare med agarose på tvers av alle de utvalgte virus. I en høyere gjennomstrømning 96-brønners plateformat, anvendelse og fjerning ikke ble inhibert på grunn av størkning som med tradisjonelle overlegg, og forutsatt nøyaktige og konsistente resultater. En betraktning når du bruker flytende overlegg ligger i ugjennomsiktig farge og manglende evne til å overvåke plakk dannelse som platene ikke kan flyttes til det punktet av samlingen, noe som begrenser denne tilpasningen til virus med tidligere karakteriserte replikering kinetikk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2x EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 °C |
| MEM 100x | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
References
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
