Summary
Nous décrivons comment visualiser macrophages C. neoformans (Cn) les interactions en temps réel, avec un accent particulier sur le processus d'exocytose non lytique en utilisant la microscopie numérique de la lumière. En utilisant cette technique individuellement macrophages infectés peuvent être étudiées pour déterminer différents aspects du phénomène.
Abstract
De nombreux aspects de l'infection des macrophages par Cryptococcus neoformans ont été largement étudiés et bien défini. Cependant, une interaction particulière qui n'est pas clairement comprise exocytose est non lytique. Dans ce procédé, des cellules de levure sont libérés dans l'espace extracellulaire par un mécanisme mal compris que les deux feuilles et le macrophage Cn viable. Ici, nous décrivons comment suivre un grand nombre de macrophages infectés individuellement pendant une période de 24 heures de l'infection par microscopie de temps écoulé. Macrophages infectés sont logés dans une chambre de chauffage avec une atmosphère de CO 2 fixé à un microscope qui offre les mêmes conditions qu'un incubateur de culture cellulaire. Microscopie numérique en direct peut fournir des informations sur les interactions dynamiques entre un hôte et l'agent pathogène qui n'est pas disponible à partir d'images statiques. Être capable de visualiser chaque cellule infectée peut fournir des indices sur la façon dont les macrophages traitent les infections fongiques, et vice versa. Cette technique isa un outil puissant dans l'étude de la dynamique qui se trouvent derrière un phénomène complexe.
Introduction
Les étapes d'une infection fongique entre les cellules et les macrophages cryptococcose sont bien documentés 1-3. Après que les cellules de levure sont ingérés par les macrophages, une variété d'interactions peuvent se produire: le macrophage peut lyser libérer sa charge fongique dans l'espace extracellulaire, ou il peut contrôler l'infection par le maintien des cellules de levure dans les limites de sa membrane cellulaire 4. Cependant, il ya quelques années, un nouveau résultat a été décrit de façon indépendante par deux groupes: exocytose non lytique, un processus dans lequel un macrophage radié partie ou la totalité des cellules cryptococcose dans l'environnement ou une cellule voisine et à la fois l'hôte et l'agent pathogène restent viables 5 -8. Plusieurs études ont tenté de comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de cette interaction, mais nous n'avons pas encore une compréhension complète sur ce qui motive ce phénomène.
La capacité de capturer des images en temps réel et d'analyser ensuite infecter multiplesed macrophages permet de répondre à de nombreuses questions sur les propriétés physiques entourant l'exocytose non lytique en ce qui concerne le calendrier, la capacité spatiale, le changement dans la morphologie et même le stress des macrophages lors d'une infection fongique. En permettant aux cellules d'être logés dans un environnement qui est comparable à celle d'un incubateur, on peut apercevoir la nature dynamique de l'interaction de cellules macrophages-fongique. Les chercheurs ont utilisé cette technique pour étudier les différentes composantes de ce processus. Le rôle du phagosome dans ce processus a été rendu évident en utilisant une coloration fluorescente et l'actine agents de blocage 9, tandis qu'un autre groupe a utilisé cette méthode pour montrer que l'exocytose non lytique a été bloqué dans les cellules qui ont eu le WASH nucléation des domaines protéiques supprimé 10. L'effet de la signalisation de cytokine a aussi été constatée en utilisant la microscopie en temps réel 11. Ce procédé n'est pas limité à C. neoformans comme il a également été observée avec Candida albicans, another pathogène fongique qui a la capacité d'infecter les macrophages 12. Ces résultats sont des exemples de la façon dont cette méthode peut fournir une mine d'informations pour une région que nous connaissons si peu.
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Protocol
Tous les travaux de l'animal a été fait en conformité avec les règlements et les lignes directrices de l'Institut d'études animales de l'Albert Einstein College of Medicine.
1. Conditions de croissance de C. neoformans H99 (sérotype A)
- Croissance individuelle C. neoformans (Cn) colonies sur des plaques de gélose Sabouraud.
- Un jour avant l'expérience, sélectionnez une colonie et inoculer 10 ml de bouillon de Sabouraud.
- Laisser la culture se développer pendant une nuit à 37 ° C sous agitation à une vitesse de 250 tours par minute.
2 Isolement et préparation des os primaire macrophages de C57 / BL6 souris
- Euthanasier les souris en plaçant l'animal dans une chambre de CO 2 jusqu'à ce qu'il ne respirait plus. Comme seconde mesure, disloquer cervicale du cou avant de commencer la dissection. Stériliser corps entier avec de l'alcool éthylique à 70%.
- Retirez les deux fémurs et tibias et place des os dans du DMEM stérile.
- Retirer l'excès de tissu musculaire et l'aide delicate lingettes jusqu'à ce que les os sont parfaitement propres.
- Placez les os ne intactes dans une boîte de Pétri contenant de l'alcool éthylique à 70% et incuber pendant 3 minutes pour tuer les micro-organismes associés. Retirez les os et les placer dans un plat de Pétri avec du DMEM stérile.
- Découpez soigneusement extrémités des os. Tenez os sur un tube conique de 50 ml vides placés sur de la glace et rincer soigneusement 10 ml de DMEM froid à l'aide d'une aiguille 25 G par chaque os.
REMARQUE: Chaque souris donnera quatre os (2 fémurs, tibias 2). Par conséquent, on devrait donner la souris environ 40 ml de suspension cellulaire. - Centrifuger la suspension de cellules à la température ambiante pendant 10 min à 650 x g.
- Au cours de cette centrifugation, préparer et stériliser par filtration des macrophages de la moelle osseuse alimentation médias qui se compose de DMEM supplémenté avec 20% L929, 10% de sérum de veau foetal, 10% de NCTC-109, 1% de Pen-Strep, 1% de HEPES, 1% de L-glutamine , 1% d'acides aminés non essentiels, 0,1% de 2-mercaptoéthanol.
- Resuspendre le culot résultant avec 10 ml d'alimentation médias. Passez suspens cellulairesions à travers une passoire 70 um de la cellule de perturber amas de cellules et d'éliminer les gros débris.
- Planche 1 ml de suspension cellulaire dans 10 ml de milieu d'alimentation dans des boîtes de Pétri qui sont spécifiés pour la culture de tissus (pour un total de 10 plaques).
- Permettre aux cellules d'adhérer à 37 ° C avec 10% de CO 2. Ajouter 5 ml de milieu d'alimentation frais le jour 3 Au jour 7, remplacer complètement les médias d'alimentation et les macrophages sont prêts à être utilisés.
- Le jour avant l'expérience, détacher les macrophages de la plaque en enlevant médias alimentation et ajouter 5 ml d'une cellule douce décapage réactif à l'assiette.
- Incuber pendant 5-10 min à 37 ° C et éliminer les macrophages avec pipetage doux.
- Cellules granulés par centrifugation à 650 g pendant 10 min.
- Remettre le culot dans 1 ml de l'alimentation du papier. L'utilisation d'une dilution de 1:20, le calcul de la concentration de macrophages par pipetage de 10 ul de suspension de cellules sur un hémocytomètre.
- Utilisation de 14 mm à fond de verre des boîtes de Pétri, déposer une feuille deconcentration de 1 x 10 5 macrophages directement sur le puits intérieur qui peut contenir un maximum de 200 pi, afin de prendre attention à ne pas dépasser ce volume comme le montre la figure 4.
- Permettre aux cellules d'adhérer à la boîte de Pétri en verre en plaçant les capsules dans un incubateur à 37 ° pendant 1 heure.
- Ajouter 1-2 ml de milieu supplémenté avec alimentation LPS à 1 mg / ml et IFNg à 500 u / ml et permettent aux cellules à incuber pendant une nuit.
3 co-incubation de macrophages murins primaires et C. neoformans
- Le jour de l'expérience, retirer 1 ml de cellules en culture pendant une nuit et culot levure inoculées par centrifugation pendant 5 min à 420 x g.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS stérile pour éliminer les médias et les produits cryptococciques extracellulaires comme le polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) à la vitesse et l'heure mentionnée ci-dessus.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de PBS stérile et faire une dilution de 1: 100. Pipette 10 ul de til dilution sur un hémocytomètre et compter les cellules. Ajouter les cellules de levure à une MOI de 1: 5. Par exemple, s'il existe une 10 x 5 macrophages / puits, faire une suspension de cellules de 5 x 10 6 / ml de Cn et ajouter 100 ul de cette solution à une quantité totale de 5 x 10 5 Cn.
- Ajouter le volume calculé de suspension cellulaire à une cryptococcose ml de milieu d'alimentation avec l'anticorps mAb 18B7 à une concentration de 10 pg / ml. Incuber la suspension de cellules à la température ambiante pendant 5 min.
- Retirez le support d'alimentation de verre à fond plat de Pétri et laver 1x avec du PBS stérile. Ajouter 100 ul de opsonisé Cn directement à bien.
- Laisser les cellules à incuber pendant 2 heures à 37 ° C avec 10% de CO 2.
- Après co-incubation, vérifier au microscope que les macrophages ont intériorisé Cn. Pour être considéré comme intériorisé, les cellules cryptococciques devraient être clairement visibles dans les limites de la macrophages.
- Laver boîte de Pétri 3x avec PBS stérile pour éliminer toute extracellular Cn.
- Ajouter 1-2 ml d'alimenter les médias sans l'ajout de l'anticorps monoclonal 18B7, et mettre en place microscope.
4 Visualisation non-lytique exocytose en temps réel utilisant Digital Light Microscopy
NOTE: Pour effectuer ces essais, un microscope qui comprend une chambre qui comprend l'incubation de joint livraison de CO 2 et une unité de chauffage est nécessaire.
- Avant l'expérience, de pré-chauffer la chambre à incuber pendant au moins 30 min à 37 ° C. Assurez-vous que l'unité de CO 2 lit 5% au début de l'expérience.
- Lieu fond de verre boîte de Pétri sur la plate-forme de microscope, couvrir avec du CO 2 couvercle, et fermer toutes les portes afin de s'assurer qu'aucune chaleur s'échappe.
- Utilisation de l'objectif 10X avec le microscope à contraste de phase, se concentrer sur un champ libre de macrophages infectés. Sur la base de l'expérience, de déterminer l'objectif utilisé par le nombre de macrophages doivent être étudiés.
- Configurer le logiciel de microscope à take une image toutes les 4 min pour une période de 24 heures.
- Après 24 h, l'expérience aura atteint la fin et un total de 361 images a été recueilli. Export de ces images comme .jpegs à une compression de 5%. Utilisation de logiciels Image J, visualiser les images d'une pile visuelle à 5 images par seconde. Si le film doit être vu pour publication ou une présentation, soit l'enregistrer comme un avi ou mov fichier selon le format qui fonctionne le mieux pour le spectateur.
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Representative Results
Les images que cette technique produit peuvent être analysées dans une variété de façons de recueillir des informations entourant ce qui se passe après que les cellules ont phagocyté C. neoformans. Comme on le voit sur la figure 1, il existe environ 100 qui sont soit les macrophages infectés ou non infectés. Chacun de ces macrophages donne au spectateur l'occasion d'étudier les interactions hôte-pathogène à un niveau très microscopique. Comme les Figures 2 et 3 montrent, il existe des résultats différents qui peuvent se produire entre une cellule de levure et de macrophages, et même entre les macrophages et de macrophages. Les macrophages peuvent être marqués comme subissant l'exocytose non lytique, le transfert de cellule à cellule, ou tout autre processus cellulaire qui pourrait se produire. Le calendrier de ces événements au cours de l'infection peut aussi être établie sur la base des paramètres définis lorsque le film est en cours d'enregistrement.
Figure 1:. Domaine de macrophages infectés Cette figure montre un champ entier de macrophages infectés individuellement au début d'une période de 24 heures de l'infection. Il convient de noter que le champ est libre de extracellulaire Cn et plus important encore, comment il est clair que les macrophages sont infectés (comme indiqué par une grande flèche) et qui ne contiennent pas de cellules fongiques (comme indiqué par une petite flèche). La barre d'échelle représente 50 um.
Film 1 : Visualisation des macrophages C. neoformans 24 h Période de l'infection. L'trame initiale du film montre de nombreux macrophages à travers le champ avec certains qui sont non infecté et d'autres qui ont phagocyté des quantités variables de cellules cryptococcoses. Comme le film progresse, les cellules are tous les mobiles et on peut le voir se déplacer sur le terrain. Nous sommes en mesure de suivre chacun de ces macrophages pour voir quel genre de processus cellulaire qu'ils subissent.
Figure 2:. Murine primaire macrophages subissant non-lytique exocytose Un macrophage infecté (Groupe A, indiqué par une flèche blanche) est considéré subir les premiers stades de l'exocytose non lytique. Le phagosome commence à agrandir (panneau BC) et de la charge fongique commence à changer. Plusieurs cellules Cn sont ensuite libérés dans l'espace extracellulaire comme on peut le voir dans les panneaux DE. Une deuxième macrophages infectés dans le Panneau de F, indiqué par une flèche blanche, subit également un événement de l'exocytose non lytique (Groupe GH). A la fin du processus, les macrophages sont laissés vides (groupe I), comme indiqué par les flèches blanches. La barre d'échelle représente 25 um.
Film 2 :. Visualisation murin primaire macrophages subissant non-lytique exocytose Dans ce film, il est clair que les cellules cryptococcose sont dans les limites d'un macrophages infectés. Le macrophage est agité et une cellule de levure peut être vu à l'intérieur de l'herbe phagosome. Cellules cryptococcose sont ensuite rapidement expurgés dans le milieu environnant. Un deuxième macrophage infecté subit exocytose non lytique et plus les cellules de levure sont libérés dans l'espace extracellulaire. Les cellules hôtes restent viables après l'exocytose cryptococcose, comme indiqué par leur capacité à continuer à se déplacer.
Figure 3:. Murine macrophages subissant primaire cellule-cellule de transfert autre process qui peut être capturée à l'aide de ce protocole est le transfert de cellule à cellule qui se produit lorsque les cellules cryptococcose sont transférés d'un macrophage à un macrophage voisin. Deux macrophages infectés sont situés à proximité les uns des autres est indiqué par des flèches blanches (panneau A) et de se déplacer encore plus proche de lancer un transfert de cellule à cellule (partie B). Un pont de cellule à cellule indiquée par les flèches rouges est formé entre les deux macrophages tels que les cellules cryptococcose sont pas exposés à l'environnement au cours du transfert (Groupe C, E). Après le transfert est terminé, les cellules se détachent (Groupe D, F). La barre d'échelle représente 25 um.
Film 3 :. Visualisation cellule-cellule Transfert entre les macrophages infectés À l'occasion, les macrophages vont interagir de manière qui facilite le transfert de cellule cryptococcose entre les cellules de l'hôte. Les cellules de levure ne sont pas exposésà l'environnement extracellulaire et les cellules hôtes rester viable. Dans ce film, deux macrophages infectés créer des ponts entre cellules à deux reprises à des cellules cryptococcose en navette de l'un à l'autre des macrophages.
Figure 4: Schéma de préparation démontrant des cellules.
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Discussion
Ici, nous avons décrit une méthode par laquelle les interactions fongiques macrophages peuvent être enregistrées et analysées en temps réel sur une période de 24 heures. Notre laboratoire a utilisé ce protocole pour étudier de nombreux aspects temporels de l'exocytose non lytique et continuera d'utiliser la microscopie en temps réel pour déterminer les composants morphologiques qui entourent ce processus.
Pour cette technique pour obtenir des résultats optimaux, une attention particulière devrait être accordée à certaines étapes du protocole. La densité cellulaire qui est plaquée la nuit avant est important, car un trop grand nombre de cellules peuvent créer un film qui n'est pas utilisable en tant que la visualisation de la circulation et les interactions des cellules individuelles est empêché, tandis que trop peu de cellules peuvent produire des données qui ne sont pas significatifs. L'objectif est de parvenir à un terrain régulièrement espacées de macrophages telles que les macrophages individuels peuvent être suivis pendant la durée de la période d'infection. Dans la même veine, emportant la Cn extracellulaire est une étape critique comme exintracellulaire Cn diviser le temps qui pourrait obscurcir le terrain et conduire à une perte de visibilité des macrophages. Selon la longueur du film, le cadre peut se déplacer hors du foyer qui rend les images inutilisables à étudier et par conséquent, l'enregistrement doit être vérifié à différents moments de l'infection.
Comme indiqué, il existe plusieurs façons cette technique peut être modifiée pour s'adapter à l'intérieur des paramètres des autres expériences. Beaucoup de différents colorants et marqueurs fluorescents peuvent être utilisés pour mettre en évidence la membrane et phagosome dynamique mais il faut être prudent de photo blanchiment et l'effet que cela peut avoir sur la remise en forme des cellules. Une variété de types de cellules peut également être utilisé comme J774.1 macrophages, des monocytes des cellules comme les amibes ou conjointement avec d'autres souches de champignons afin d'étudier les différences qui peuvent se produire. Nous vous suggérons d'utiliser un objectif de 10X parce que nos expériences nécessitent la collecte de données d'une grande quantité de cellules, mais on pourrait utiliser un plusobjectif d'étudier quelques cellules. Le moment choisi pour que chaque image est prise peut également être ajustée. Prendre une image toutes les 4 min pendant 24 heures donne un film qui fonctionne à peu près 1 minute pour quand tous les cadres ont été compressés. Augmenter ou l'autre aspect (la durée de l'infection ou le temps entre les images) augmente la quantité de fichiers qui doivent être stockés qui peuvent être un problème pour certains laboratoires.
Exocytose non-lytique est un processus dynamique qui se produit très rapidement et à différents intervalles de temps au cours de l'infection. Par conséquent, en essayant de capturer les macrophages subissant cette interaction en utilisant d'autres méthodes telles que la transmission et microscopie électronique à balayage peut être extrêmement rare. En raison de la nature de la manière dont les échantillons sont fixés et traités, on ne peut être certain que ce qui est lu est définitivement exocytose non-lytiques par rapport à d'autres processus cellulaires tels que la lyse ou l'apoptose. En outre, une caractéristique de l'exocytose non-lytique qui est l'hôte et l'agent pathogène via restent ble après qui est quelque chose qui ne peut être déduite à partir d'images fixes depuis ces méthodes ne peuvent produire des instantanés d'un processus à un moment donné.
Bien que ce protocole peut fournir d'innombrables images de processus cellulaires, il ya quelques limitations dans l'utilisation de cette technique pour étudier les interactions hôte-pathogène. L'objectif bas que nous utilisons pour étudier un grand nombre de macrophages en même temps ne permet pas une image à haute résolution suffisante pour visualiser l'interaction entre le phagosome et la membrane cellulaire, ce qui n'est pas un aspect bien connu de l'exocytose non lytique. Une fois que toutes les images ont été enregistrées, l'analyse de poste de nombreux macrophages suivantes peut être très fastidieux et chronophage. Les macrophages, même collé sur le verre, peut être très mobiles et se déplacer dans et hors du châssis très rapidement. Cela peut rendre difficile de suivre les macrophages individuelles du début à la fin, en particulier ceux qui sont près de la périphérie du cadre.
jove_content "> Malgré ces limites, ce n'est protocole peut être utilisé dans une variété de façons d'étudier les différents aspects des interactions hôte-pathogène.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent que nous n'avons pas les intérêts financiers concurrents ou d'autres conflits d'intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée en partie par NIH prix 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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