Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Обнаружение Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52139
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

Summary

Этот протокол показывает, как Пробирной Расстояние Лигирование может быть использован для обнаружения в точке белок-белковых взаимодействий на Drosophila личиночной нервно-мышечном соединении. С помощью этого метода, Диски большой и Ху-ли тай Шао показаны с образованием комплекса в постсинаптической области, ассоциация ранее выявленных в рамках совместного иммунопреципитацией.

Introduction

Drosophila Диски большой (DLG) является консервативный член мембраной связаны гуанилатциклазы семейства киназ лесов белков, которые помогают организовать сборку больших белковых комплексов в определенных участках плазматической мембраны. Первоначально идентифицирована как белка-супрессора опухоли, Dlg служит важным фактором, определяющим эпителия апикально-базальной полярности 1,2,3. Dlg также служит в качестве основного модуля лесов в нервно-мышечном соединении (НМС) глутаматэргических двигательных нейронов во время развития личинок 4. Dlg играет разные роли на личиночной НМС, и его pleiotropism зависит от его способности, чтобы связать с несколькими белками 5,6. Одним из таких белков является Ху-ли тай Шао (ВТСП), гомолог к adducins млекопитающих, которые в основном были описаны в отношении их роли в регулировании актин-спектринового цитоскелета 7. Ранее было показано, что Dlg и Hts может образовывать комплекс друг с другом на основе в пробирке 8. Один из недостатков этих результатов, однако, является то, что они не указывают, когда это сложные формы. С использованием иммуногистохимии, распределения и Dlg Hts наблюдаются перекрываться на постсинаптической мембране личиночных НМС, но они в комплексе в этой области 8? Как показал недавно и подробно описано здесь, Пробирной Расстояние Лигирование (PLA) используется для поиска в месте связи между Dlg и Hts специально на личиночной NMJ 27.

PLA является относительно новый метод используется в основном в клеточной и тканевой культуры, которая может обнаружить белок-белковых взаимодействий в месте 9. В этом анализе, первичные антитела против двух белков, представляющих интерес обнаружены с парой видоспецифических вторичных антител, называют PLA зондов, которые конъюгированы с олигонуклеотидами (1А, В). Если два белкас находятся в непосредственной близости друг от друга (т.е. в течение нескольких десятков нанометров), расстояние между прилагаемыми НОАК зондов можно преодолеть путем гибридизации двух дополнительных олигонуклеотидов Connector (рисунок 1в). В этой конформации, свободные концы соединительных олигонуклеотидов достаточно близки, чтобы вступить в контакт друг с другом, и закрыт круглой молекула ДНК может быть сформирован на месте в лигирования (фиг 1D). Круговой молекула ДНК служит в качестве матрицы для амплификации в месте прокатки круга, который заливают в одном из олигонуклеотидов, конъюгированных с зондами PLA (рис 1E). Последовательности в пределах результате усиленного concatemeric продукта ДНК могут быть визуализированы с флуоресцентно меченных комплементарных олигонуклеотидов (фиг 1F). Поскольку усиленный ДНК остается прикрепленной к одному из датчиков PLA, субклеточном локализации взаимодействия withi белок-белокна ткани могут быть легко установлены.

Некоторые методы широко используются для обнаружения белок-белковых взаимодействий в том числе в технике пробирке, такие как совместно иммунопреципитации, выпадающие анализы и дрожжи Двугибридный анализ и методам естественных условиях, таких как Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) и Бимолекулярные флуоресценции комплементации ( BiFC). Ловушка из методов в пробирке, что они не определить, где взаимодействие происходит эндогенно, в то время как вышеупомянутые в естественных условиях методы включают искусственный экспрессию слитых белков, которые могут не отражать родной поведение их эндогенных аналогов. Одно из главных преимуществ PLA является то, что способен определить в ткани на внутриклеточную локализацию эндогенных белков interactors, которые находятся в непосредственной близости друг от друга, и, скорее всего, образующих комплекс с степени близости, необходимой для генерирования сигнала, сравнимой с FRET и BiFC. PLA может обнаружить взаимодействие с высокой специфичностью и чувствительностью за счет сцепления распознавания антител и амплификации ДНК. Таким образом, анализ может генерировать дискретные, яркие сигналы в виде Puncta, которые показывают точное положение взаимодействия. Кроме того, почти видимые антигенов могут быть обнаружены. Наконец, PLA не относительно простой метод для выполнения, и он больше не принимает, чем стандартный иммуногистохимического процедуру для завершения. Поэтому, PLA технические преимущества по сравнению с другими анализами взаимодействия белок-белковых, которые часто сталкивается с длительным временем подготовки и обширной устранения неполадок.

Этот протокол показывает, как PLA могут быть применены к Drosophila личинок НМС с целью обнаружения эндогенных белок-белковых взаимодействий на месте. Здесь PLA осуществляется на личиночных мышц стенки тела препаратов, где Dlg и Hts показаны на самом деле существует в комплексе в постсинаптической области НМС, Народно-освободительная армия ранее не использовалась для изучения личинок НМС, и есть в настоящее время только несколько опубликованных работ, которые использовали эту пробу у дрозофилы ткани. Он выразил надежду, что в дальнейшем экспозиция НОАК сообщества дрозофилы приведет к его увеличению использования в качестве дополнительного инструмента в дополнение к другим, более часто используемые анализы белок-белкового взаимодействия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Тело Wall Подготовка

Примечание: Получение третьей возрастной стадии стенок тела личинки (для изучения НМС, которые иннервируют мышцы стенки тела) проводили, как описано ранее в Brent и др 10, или Рамачандрана и Будник 11,12, но с некоторыми изменениями..

  1. Рассечение
    1. Повышение мухи запасов и кресты при 25 ° С в течение 5:55 дней с использованием стандартных процедур 13.
    2. Выберите ползет личинок третьей возрастной стадии от флаконах или бутылках с использованием тонких щипцов.
    3. Промыть личинок в небольшом чашку Петри, содержащую фосфатный буфер солевом растворе (PBS), чтобы удалить любые частицы пищи.
    4. Поместите одну личинку на Sylgard диска и погрузить его в нескольких капель ледяной PBS. Использование ледяной PBS поможет ошеломить личинку делает его легче манипулировать. На протяжении вскрытия, убедитесь, что препарат всегда погружен в PBS, чтобы предотвратить его от высыхания.
    5. Установите ЛаRVA с его спинной стороной вверх, так что две трахеи участки открыты при вскрытии микроскопа (фиг.2а). Используя пинцет, чтобы схватить minutien штифт, контактный личинку вниз на заднем конце вблизи дыхальца (рис 2b). С другой штифт, проколоть через кутикулу на переднем конце вблизи устья крючки. Осторожно потяните личинку из продольно, то вывод его вниз (рис 2б).
    6. Использование микродиссекции ножницы, щепотка задний конец рядом булавку, чтобы создать небольшое отверстие. Разрез должен быть достаточно поверхностным просто передать через кутикулу.
    7. Размещение кончик нижнего лезвия ножниц в разрез, разрез вдоль всей длины средней линии спины между двумя трахеи путей (фиг.2с). Укажите лезвия ножниц слегка вверх при резке, чтобы избежать повреждения вентральной мускулатуры стенки тела.
    8. Сделайте небольшой горизонтальный разрез немного впереди на должностьeriorly расположенный штифт (рис 2С). Сделайте еще ​​один аналогичный разрез немного кзади от впереди размещенных штифта (рис 2С). Разрезы должны просто пройти через кутикулу.
      Примечание: Три разрезы от шагов 1.1.7 и 1.1.8 в сочетании должна напоминать " "После завершения, т.е. левой и правой заслонки на спинной стороне тела личинки должны быть произведены.
    9. Тщательно очистить внутренние органы с помощью пинцета. Добавление нескольких силовых капель PBS поможет вытеснить органы из тела личинки, тем самым облегчая их удаление. Избегайте тыкать тела личинки, как это может привести к повреждению стенки тела мышц.
    10. Развернуть тела личинки открыты и прикрепить уголки вниз (рис 2D). Когда пиннинга растянуть стенки тела и по горизонтали, и по вертикали, чтобы сформировать равномерно натянута прямоугольник (SEд Рис 2G для формы), стараясь не порвать стенки тела мышцы в процессе.
    11. Завершите удаление любых оставшихся внутренних органов (рис 2E).
  2. Фиксация и пермеабилизирующего
    1. Погрузитесь закрепленного стенки кузова в нескольких капель раствора Буэна. Инкубировать в течение 15 мин на льду. Кроме того, использование 4% параформальдегида (PFA) в качестве альтернативы фиксатором; инкубировать в течение 30 мин.
    2. Промыть три раза с помощью забуференного физраствора с Triton (PBT).
    3. Использование тонких щипцов, тщательно удалить контакты и передать стенки кузова от их углов в силицированного 0,65 мл микроцентрифужных трубки.
    4. не хранить стенки кузова в PBT при 4 ° С до готовности к PLA. Для достижения оптимальных результатов, начните иммуноокрашивания стенки кузова в течение дня или двух вскрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить на реагенты и обеспечить, чтобы все стены тела имеют равные во время теста, различные генотипы могут быть помещены в единыйтруба. Генотипы можно выделить за счет сокращения углы стен тела по-разному (рис 2F для примеров).

2. Иммуногистохимия

Примечание: Иммуноокрашивание третьей возрастной стадии стенок тела личинки проводили, как описано ранее в Brent др 14 и Рамачандрана и Будник 11, но с некоторыми изменениями. 11,14.
Примечание: Выполнить все шаги при комнатной температуре и при легком перемешивании, если не указано иное.

  1. Блокировки
    1. Вымойте стенки кузова с PBT три раза в течение 10 минут каждый.
    2. Блок 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 1 часа.
  2. Иммуноокрашивание
    1. Инкубируйте стенки кузова с помощью мыши и кролика первичных антител против двух белков, представляющих интерес (разведенного в 1% BSA) в течение 2 ч при комнатной температуре, или в течение ночи при 4 ° С. В этом случае используйте 1:10 мышиное анти-DLG и 1: 250 кроликуNTI-HtsM 15,16. Антитела против маркеров, которые не сделанных в мышь или кролика также могут быть включены - например, использовать 1: 200 козий анти-HRP, чтобы очертить нейронные мембраны.
    2. Промыть PBT три раза в течение 10 мин каждый.
    3. Инкубируйте с флуорофором-конъюгированные вторичные антитела для выявления маркеров (разбавленный в 1% BSA) в течение 2 ч при комнатной температуре, или в течение ночи при 4 ° С. Поскольку сигнал НОА впоследствии визуализированы с красным флуорофором, другой флуорофор должен быть использован для обнаружения маркера - например, использовать 1: 200 FITC-конъюгированного анти-козел для обнаружения козьего анти-HRP-антитела. В связи с использованием светочувствительных реагентов, держать трубки в темноте с этой точки и далее.
      Примечание: Комплект, который используется позволяет PLA быть выполнены между первичными антителами у мышей и кроликов, с сигналом отображаются на красном канале в соответствии с конфокальной микроскопии. Если желательно, другие комплекты доступны, что позволяет анализа должно быть сделано с примаRy антитела, индуцированные у других видов, и сигнал визуализируется на других каналах.

3. Пробирной Расстояние Лигирование

Примечание: Выполнить все шаги при комнатной температуре и при легком перемешивании, если не указано иное.

  1. PLA зонды
    1. Вымойте стенки кузова с PBT три раза в течение 10 минут каждый.
    2. Инкубируйте с PLA зондов (разведение 1: 5, каждый на 1% BSA) в течение 2 ч при 37 ° С. В этом случае используйте 40 мкл PLA зонда анти-мыши минус, 40 мкл PLA зонда анти-кролика плюс и 120 мкл 1% BSA в целях обеспечения надлежащего погружение и перемешивание 5-10 стенах тела. До разведении зондов PLA 1:25 все еще ​​может привести к адекватной отношение сигнал-шум (то есть, для этого эксперимента).
  2. Перевязка
    1. Вымойте стенки кузова промывочным буфером дважды в течение 5 минут каждый.
    2. Инкубируют при лигирования раствора (1:40 разбавление в лигазы буфера дл лигировани) в течение 1 ч Ат 37 ° C. В этом случае используйте 5 мкл лигазы 40 мкл 5 буфера для лигирования и 155 мкл воды высокой степени чистоты для обеспечения надлежащего погружение и перемешивание 5-10 стенах тела.
  3. Усиление
    1. Вымойте стенки кузова промывочным буфером дважды в течение 2 мин каждый.
    2. Инкубируйте раствором усиления (1:80 разбавление полимеразы в буфере Amplification) в течение 2 ч при 37 ° С. В этом случае используйте 2,5 мкл полимеразы, 40 мкл 5 Amplification буфера и 157,5 мкл воды высокой степени чистоты для обеспечения надлежащего погружение и перемешивание 5-10 стенах тела.
  4. Подготовка для работы с изображениями
    1. Вымойте стенки кузова промывочным буфером В два раза по 10 минут каждый.
    2. Промыть 0.01x промывочного буфера B один раз в течение 1 мин.
    3. Равновесие в несколько капель раствора для монтажа по меньшей мере, 30 мин до начала монтажа, или хранить в течение ночи при 4 ° С.
    4. Использование тонких щипцов, тщательно передачи стенки кузова на платформе слайд шIth их кутикулы вниз. Расположите стенки кузова в рядах и в той же ориентации в пределах или две капли mountant. Поставьте 22 мм х 40 мм покровным за подготовкой, стараясь не произвести пузырьки воздуха, плотно закройте слайд с прозрачным лаком для ногтей.
    5. Храните слайды в темноте при -20 ° С до готовности для конфокальной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В дикого типа третьего возраста личинок НМС, Dlg в основном находится на постсинаптической мембране типа I глутаматергических бутонов, а уровни иммунореактивности DLG быть более выражен в вида И. Б. бутонов, чем типа является бутоны (3А) 4. Hts присутствует на всей мышцы, а концентрируется на постсинаптической области с Hts уровни иммунореактивности появляться одинаковые по типу I бутоны, и также обнаружили пресинаптически (3А ") 8,17. Следует отметить, что распределение Dlg и Hts основном перекрываются в постсинаптической области (фиг.3А '') 8.

Чтобы определить, Dlg и Hts существуют в комплексе в НМС, PLA между двумя белков проводили на тела личинки стенки мышечных препаратов. Для этого анализа, мышиное анти-Dlg антитела, которые обнаруживает второй домен PDZ на N-конце и кролика против антител HtsMкоторый обнаруживает область MARCKS-гомологии на С-конце были использованы 15,16. В дикого типа, сигнал PLA между Dlg и Hts наблюдалось конкретно на НМС (фиг.3С-C ''). Сигнал в основном локализованы по окружности на пресинаптической мембраны I бутонов типа, который был демаркированы с HRP, таким образом, указывая, что Dlg и Hts находятся в непосредственной близости друг от друга и, вероятно, образуют комплекс в постсинаптической области. В результате было установлено, что удельная как наш отрицательного контроля, включая HTS 01103 мутантные NMJs, которые не имеют HTS иммунореактивности (3В-В ''), не показали заметного PLA сигнал (фиг 3D) 8,17,18. Кроме того, PLA производится без добавления кроличьей анти-антитело HtsM не дали сигнал (данные не показаны). Высокие просмотров увеличением в бутонах показали, что Dlg и Hts иммунореактивности грубо перекрываются постсинаптической области (рис 3E), В то время как PLA между двумя белками в результате дискретного Puncta о том, что только часть от общего Dlg и HTS белков в комплексе (рис 3F).

Для дальнейшей проверки достоверности PLA в качестве инструмента для изучения личинок НМС, но также оценивали взаимодействия между серин / треонин p21-активируемой киназы, Пак и других синаптических белков 19. Предыдущие эксперименты со-иммунопреципитации показали, что Пак является членом комплекса Scribble, из которых Dlg также является членом 20. В НМС дикого типа, Пак локализуется в постсинаптической плотности (фиг.4а, С), где это необходимо для локализации Dlg 15,21. Иммунореактивные распределения Пак и Dlg перекрываются в постсинаптической области (фиг.4А ''), и PLA между двумя белками привело к положительным сигналом специально в НМС (фиг.4В). Эти результаты показывают, что эти два белка в C теряет близости друг от друга, и, скорее всего, формируя комплекс в этой области. Еще синаптической белок Мы проверили Пак комплекса связывание Wingless (РГ), лиганд Drosophila Wnt, который играет множество ролей в НМС 22. В дикого типа, РГ, обогащенный на пресинаптических и постсинаптических сторон типа I бутонов, но также присутствует в Puncta всей мышечной цитоплазме (фиг 4C ') 23. Интересно, что несмотря на то, иммунореактивных распределения Пак и Wg, частично перекрываются на постсинаптической области (фиг.4С ''), PLA между двумя белками не дали наблюдаемый сигнал (рис 4D). Таким образом, Пак и Wg не находятся в непосредственной близости друг от друга в НМС. Этот результат показывает, что не все белки, которые показывают перекрывающиеся immunoreactivities с помощью традиционных экспериментов совместной локализации будет генерировать сигнал PLA, и служит в качестве дополнительного отрицательного контроля.

ЛОР "FO: Keep-together.within-страницу =" всегда "> Рисунок 1
Рисунок 1: Принципиальная схема Пробирной Расстояние Лигирование. (A) Первичные антитела связываются с двумя представляющих интерес белков с использованием стандартных процедур иммуногистохимических. (Б) первичные антитела детектировали с парой видоспецифических вторичных антител, называют PLA зондов, которые конъюгированы с олигонуклеотидами. (С) Если эти два белка находятся в непосредственной близости друг к другу, расстояние между прикрепленными PLA зондов можно преодолеть путем гибридизации двух дополнительных соединительных олигонуклеотидов. (D) В этой конформации, соединитель олигонуклеотиды могут образовывать замкнутую круговую молекулу ДНК на месте в лигирования . (Е) круглой молекула ДНК служит в качестве матрицы для прокатки на месте окружность усиление, которое заливают в одном из Олиgonucleotides конъюгированные с зондами PLA. (F) последовательности в пределах амплифицированного продукта ДНК затем обнаружены с флуоресцентно меченных комплементарных олигонуклеотидов. Обратите внимание, что цифра была основана на Weibrecht и др. 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.

Фиг.2
Рисунок 2: Получение третьей возрастной стадии стенок тела личинки. (AF) чертежи, представляющие стенки тела рассечение. () Поместите одну личинку на Sylgard диска с спинной стороной вверх так, чтобы два трахеи участки видны. (B) Контакт личинка вниз на передней и задней сторон с minutien булавки, растягивая личинку из продольно в процессе. (C) (D) развернуть тела личинки открыты и прикрепить уголки вниз, растягивая стенки тела и по горизонтали, и по вертикали в процессе формирования равномерно натянута прямоугольник. (E) Очистить все оставшиеся внутренние органы. (F) показаны примеры различных способов сократить угол стены тела для того, чтобы различать разные генотипы. (G) Посмотреть натянутой подготовки стенки тела после их завершения. Снимок был сделан с помощью цифровой камеры, установленной на вскрытии микроскопом. Бар Шкала в панели F представляет 1 мм. Обратите внимание, что цифра была основана на Рамачандрану и Будник, 2010 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.


Рисунок 3: Dlg и Hts существуют в комплексе на постсинаптической области личинок НМС (AB '') Распределения Dlg (красный) и СНД (зеленый) в дикого типа и HTS мутантных NMJs (AA. '') В дикой природе. -типа NMJs, Dlg встречается преимущественно в постсинаптической мембране I бутонов типа, а уровни DLG является более выраженным в типе Ib, чем бутоны. Hts присутствует на всей мышцы, но также концентраты вокруг постсинаптической области, а уровни Hts быть одинаковым в обеих типа I бутонов. Распределения Dlg и Hts перекрываются постсинаптической области. (BB '') NMJs мутант ВТСП не хватает HTS иммунореактивности. Обратите внимание, что HTS 01103 мутации эффекты NMJ ветвления 8. (CD '') PLA между Dlg и СНД (красный) Проводили на дикого типа и мутантных HTS NMJs. HRP используется для обозначения нейрональные мембраны (зеленый). Показаны высокие просмотров увеличением несколько бутонов. (CC '') в дикого типа, сигнал НОАК наблюдается именно в НМС. Сигнал в основном локализованы по окружности на пресинаптической мембраны I бутонов типа, указывающий, что Dlg и Hts находятся в непосредственной близости друг от друга и существуют в комплексе в постсинаптической области. (D) НМС, мутантные по HTS не показали заметного сигнала PLA. (EF) Показаны высокие виды увеличением отдельных бутонов. (Е) СНД и Dlg иммунореактивность сильно перекрываются в постсинаптической области. (F), PLA между Dlg и HTS приводит к отчетливым Puncta о том, что только часть из белков в комплексе , Бар Масштаб на панели В '' представляет 40 мкм (AB ''); бар масштаб в панели D '' представляет 10 мкм (CD ''); SCALе-бар в панели F представляет 5 мкм (EF). Все NMJs Указаны от мышц 6/7 в брюшном сегменте 4. Снимки были сделаны в объединенных стопок с помощью Nikon A1R лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с программным обеспечением NIS-Elements, и обработанных с Adobe Photoshop. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию фигура.

Рисунок 4
Рисунок 4: Пак существует в комплексе с Dlg, но не РГ постсинаптической области личинок НМС (AD) Показаны высокие просмотров увеличением несколько бутонов (АА '') Распределения Пак (зеленый) и Dlg (.. красный) в НМС дикого типа. Пак локализуется в постсинаптической плотности. Обратите внимание, что иммунореактивные распределения Пак и Dlg перекрываются постсинаптической области. (B) PLA бetween Пак и Dlg (красный) выполнены на НМС дикого типа. Сигнал PLA наблюдается именно в НМС, указывая, что эти два белка находятся в непосредственной близости друг к другу в этой области. (CC '') Распределения Пак (зеленый) и РГ (красный) в НМС дикого типа. РГ обогащенного как на пресинаптических и постсинаптических стороны НМС, но также присутствует в Puncta по всей мышце. Следует отметить, что иммунореактивный распределение Pak также наблюдается частично перекрываться с Wg в постсинаптической области. (D), PLA между Пак и WG (красный) выполнены на НМС дикого типа. Никаких конкретных сигналов PLA не наблюдалось, что свидетельствует о том, что эти два белка не находятся в непосредственной близости друг от друга на НМС, несмотря на их перекрывающихся распределений. Бар Шкала в панели D представляет 5 мкм (AD). Все NMJs иннервируют мышцы 6/7 в брюшном сегменте 4. Изображения были взяты в качестве присоединяемых стеков с помощью Nikon A1R лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с программным обеспечением NIS-Elements, и проcessed с Adobe Photoshop. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот отчет показывает, как PLA могут быть применены к дрозофилы личиночной НМС. Анализ проводят на личиночных стенки тела препаратов мышечных с целью обнаружения эндогенных белок-белковых взаимодействий, присутствующих в НМС. С помощью этого метода, Dlg и Hts показаны, чтобы быть в непосредственной близости друг от друга, и, таким образом, существуют в комплексе, в частности, в постсинаптической области 27. В поддержку этого результата, предыдущее исследование предоставило доказательства их связи со следующими данными: 1) иммунореактивные распределения Dlg и Hts перекрываются постсинаптической области личинок НМС, 2) Dlg и Hts образуют комплекс основанного на сотрудничестве иммунопреципитации эксперименты с участием все взрослое летать лизатов, и 3) Dlg и Hts взаимодействовать как в эпителиальных и синаптической щели 8. Сигнал PLA постсинаптической области также наблюдается между Dlg и Пак, взаимодействия ранее выявленных в других исследованиях, тем самым обеспечивая дальнейшее Credeсть использования этого теста на НМС 15,20,21. Интересно, PLA между Пак и РГ не привело к наблюдаемой сигнала, хотя их иммунореактивные распределения перекрываются в НМС. Этот результат показывает, что не все белки, которые показывают перекрывающие иммунореактивных распределения будет генерировать сигнал PLA, таким образом показывая, что PLA обеспечивает высокое разрешение при обнаружении белок-белковых взаимодействий, чем традиционные исследований совместной локализации.

Несколько были внесены изменения исходного протокола PLA для того, чтобы оптимизировать анализ для личиночной НМС (данные не показаны) 9,25. Во-первых, было установлено, что 1% БСА лучший блокирующий агент для стен тела вместо, представленной блокирующим раствором. Во-вторых, для получения сильного сигнала к шуму соотношение, правильное погружение и перемешивание стен тело в реакционных растворов имеет решающее значение. Минимум 200 мкл от пяти до десяти стенки кузова в 0,65 мл микроцентрифужных трубки был признан подходящие,ле когда инкубации с PLA зонды, лигазы или полимеразы, хотя объемы могут быть увеличены соответственно при обработке более стен тела. Сила сигнала были также расширены за счет увеличения времени реакции 30 минут на рекомендованного времени. В-третьих, последовательный тест разбавление зондов PLA проводили, чтобы оптимизировать баланс между сохранением реагента и силы сигнала. Для экспериментов, выполненных в данном отчете, до разведения 1:25 - от рекомендуемой разведение 1: 5 - по-прежнему может производить разумное соотношение сигнал-шум. Следует отметить, что оптимизация лигирования и амплификации реакций не проводились. Наконец, как PLA могут быть чувствительны к мельчайшим изменениям, настоятельно рекомендуется, что различные генотипы одного эксперимента помещают в одну пробирку так, чтобы элементы управления и эксперименты относятся одинаково во время теста. Генотипы можно выделить за счет сокращения углы стен тела по-разному.

СевераМетоды л используются для обнаружения Drosophila белок-белковых взаимодействий, включая дрожжей Двугибридный анализ, совместное иммунопреципитации и разъедать. Но как сравнить эти методы против НОАК и его способности визуализировать белок-белковых взаимодействий на месте? Дрожжи двугибридная может обнаружить прямое связывание между Drosophila белков, экспрессированных в дрожжах, и она была использована в высокой пропускной генома экранов. Хотя многие из выявленных взаимодействий биологически значимым, так анализ часто приводит к ложных результатов. Кроме того, ложные негативы может произойти по нескольким причинам: белки слиты с доменов транскрипционных факторов, которые могут препятствовать связыванию, много взаимодействий требует пост-трансляционные модификации, которые не встречаются в дрожжах, и ядро ​​(где анализ имеет место), может не быть подходящей средой для некоторых взаимодействий правильно сформировать. Такие вопросы не встречаются с НОАК, поскольку она касается эндогенных белков в родном проблемам окружающейзаключения. Один из методов, который может быть использован для обнаружения взаимодействия между эндогенных белков совместно иммунопреципитации. Эксперименты с участием Drosophila лизатов может выявить ткани и этап в жизненном цикле, в котором происходит взаимодействие. Однако, как образование лизат включает разрушения клеток, чтобы извлечь белки, клетки в ткани, в которой происходит взаимодействие, в, а также его внутриклеточной локализации, не могут быть оценены - в отличие от PLA. Кроме того, совместное иммунопреципитации обнаруживает белковый комплекс связывания и не может отличить, какие белки в комплексе находятся в непосредственной близости друг от друга. Существуют методы, такие как FRET, доступные для Drosophilists, которые позволяют визуализировать белок-белковых взаимодействий в клетке. Однако, лада включает в себя избыточную экспрессию трансгенных белков, слитых с флуоресцентными метками и может не соответствовать эндогенного поведение белка как в НОАК.

Несмотря на свои преимущества, есть некоторые limitatионы при использовании PLA. Одним из таких ограничений является наличие первичных антител против белков, представляющих интерес, которые изготовлены в различных видов. Эта проблема может быть легко обойти с использованием меченых трансгенных белков, хотя они не могут быть действительно представитель эндогенного взаимодействия. Другая проблема заключается в том, что НОАК может дать ложные негативы, например, когда два первичных антител пространственно мешать друг другу или когда эпитоп одного из первичных антител включает в себя сайт белок-белковых взаимодействий. Кроме того, хотя PLA обнаруживает белки, которые находятся в непосредственной близости друг от друга, это не делает различий между прямых и косвенных белок-белковых взаимодействий, в отличие от раскрывающихся анализов и дрожжей двух гибридных скрининга. Кроме того, PLA между эндогенных белков не определяет, какие домены отвечают за взаимодействие. Таким образом, другие анализы белок-белкового взаимодействия будет по-прежнему необходимо, чтобы полностью охарактеризовать взаимодействие molecularlу.

Исследователи начали использовать супер-разрешения микроскопии для отображения пространственной архитектуры Drosophila личинок НМС, с разрешением в десятки нанометров достигается 26. PLA, с сопоставимой молекулярной разрешением, должны обеспечивать низкую стоимость, технически простым дополнением к этих исследований, которые помогут в создании подробный вид организации многочисленных белков в НМС.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Блумингтон дрозофилы фондовый центр для обеспечения запасов лету. Мы также благодарим Развивающие Studies гибридомы банк и Линн Кули (Йельский университет) для предоставления антител. Особая благодарность идет к AhHyun Ю за помощь в рукописи. Эта работа была поддержана грантами от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (Кригер), Уильяма и Ада Изабель стали фонда (Кригер), и Канадского института исследований в области здравоохранения (Харден).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps (fine #5) Almedic A10-704
Sylgard Disc World Precision Instruments SYLG184 Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60 x 15 mm Petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter) Fine Science Tools 26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine) Fine Science Tools 15200-00
Platform Slides Glue two 22 x 22 mm2 coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20 mm gap in between for sample mounting.
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 3605
hts01103 Bloomington Drosophila Stock Center 10989 Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7.0 NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
Name Company Catalog Number Comments
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large) Developmental Studies Hybridoma Bank 4F3 Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao) Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase) Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless) Developmental Studies Hybridoma Bank 4D4 Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase) Jackson              ImmunoResearch 123-065-021 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat Jackson             ImmunoResearch 705-095-003 Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red Sigma-Aldrich DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2 M Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7.5 Sigma-Aldrich DUO82049 Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich DUO82040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
  2. Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
  3. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
  4. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
  5. Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
  6. Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
  7. Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
  8. Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
  9. Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
  10. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  11. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  12. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  13. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
  14. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  16. Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
  17. Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
  18. Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
  19. Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
  20. Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
  21. Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
  22. Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  23. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
  24. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  25. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
  26. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
  27. Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).

Tags

Neuroscience выпуск 95 adducin стены рассечение тела биологии развития Диски большой, иммуногистохимия нервно-мышечного соединения неврологии белок-белковое взаимодействие Пробирной Расстояние Лигирование личинок третьей возрастной стадии
Обнаружение<em&gt; На месте</em&gt; белок-белковых комплексов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок нервно-мышечного соединения, используя Пробирной Расстояние Лигирование
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, S., Yoo, S., Kim, H. y., Wang, … More

Wang, S., Yoo, S., Kim, H. y., Wang, M., Zheng, C., Parkhouse, W., Krieger, C., Harden, N. Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (95), e52139, doi:10.3791/52139 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter