Abstract
सेल, एक प्रक्रिया बुलाया ध्रुवीकरण में उनके गोल आकार खोने से और कई प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण बदलकर उत्तेजना केमोकाइन का जवाब। क्लासिक इमेजिंग तकनीक इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, वे आकृति विज्ञान और कोशिकाओं के दसियों का धुंधला की सह स्थानीयकरण के समय लेने वाली मात्रा का ठहराव द्वारा पीछा कई कोशिकाओं के मार्गदर्शन के अधिग्रहण की आवश्यकता है। इधर, एक तेजी से और शक्तिशाली तरीका एक कोशिकामापी के उन लोगों के साथ एक खुर्दबीन के लाभों को जोड़ती है कि प्रौद्योगिकी cytometry के एक इमेजिंग प्रवाह का उपयोग कोशिकाओं के कई हजारों से मिलकर नमूनों पर इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए वर्णित है। MHC वर्ग मैं अणुओं और filamentous actin के लिए CCL19 और धुंधला के साथ प्रेरित टी lymphocytes का उपयोग करना, एक gating रणनीति एक साथ आकार परिवर्तन की डिग्री और CCL19 संकेतन से प्रभावित हैं कि मार्कर के सह स्थानीयकरण की सीमा को मापने के लिए प्रस्तुत किया है। इसके अलावा, इस gating रणनीति observ करने के लिए हमें की अनुमति दीई CXCL12 उत्तेजना के बाद ध्रुवीकृत टी कोशिकाओं में (मोर्चे पर) filamentous actin और (रियर में) phosphorylated एज़रिन-Radixin-Moesin (phospho-एर्म) प्रोटीन का अलगाव। Par6 / असामान्य पीकेसी संकेतन मार्ग की म्यूटेंट के एक औषधीय अवरोध करनेवाला और अभिव्यक्ति द्वारा actin के polymerization के निषेध: इस तकनीक को भी दो अलग-अलग तत्वों के ध्रुवीकरण पर अवरुद्ध प्रभाव निरीक्षण करने के लिए उपयोगी था। इस प्रकार, सबूत इस तकनीक रूपात्मक परिवर्तन और प्रोटीन पुनर्वितरण में दोनों का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है कि दिखाया गया है।
Introduction
Chemokines विशेष स्थानों के लिए 1 कोशिकाओं को आकर्षित कि छोटे घुलनशील प्रोटीन होते हैं। इसलिए, वे ऊतकों में कोशिकाओं की सही स्थिति, विकास और शरीर विज्ञान में एक महत्वपूर्ण समारोह में भाग लेते हैं। यह एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट करने के लिए संगीत कार्यक्रम में जो कार्य के कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं की कार्रवाई पर निर्भर करता है के रूप में प्रतिरक्षा प्रणाली को इस नियम के लिए कोई अपवाद नहीं है। विदेशी एंटीजन का पता चला और निष्प्रभावी किया जा सकता से पहले एक दिए गए राज्य में एक प्रतिरक्षा सेल प्रकार का विशिष्ट स्थान को नियंत्रित करके, chemokines पूर्व आवश्यक हैं।
विशेष रूप से टी lymphocytes में, chemokines टी सेल गतिशीलता 2,3 के पक्ष में है कि सगाई की बात है, कई इंट्रासेल्युलर संकेतों को प्रकाश में लाना है, जो विशिष्ट सतह रिसेप्टर्स (कैल्शियम वृद्धि, ERK फास्फारिलीकरण, रो GTPases सक्रियण, integrins आत्मीयता और cytoskeletal परिवर्तन में वृद्धि) करने के लिए बाध्य। सेलुलर स्तर पर, एक केमोकाइन उत्तेजना पर हासिल रूपात्मक परिवर्तन का निरीक्षण कर सकते हैं।सेल आकार में ये परिवर्तन टी कोशिकाओं में विशेष रूप से नाटकीय हैं: रक्त प्रवाह में जब यात्रा आराम टी कोशिकाओं एक मनका-तरह गोल आकृति विज्ञान है। मोर्चे पर एक अग्रणी धार: हालांकि, भड़काऊ साइटों में या ल्य्म्फोइड अंगों की निकटता में chemokines के उपस्थिति की संवेदन अब एक द्विध्रुवी फार्म से मिलकर एक ठेठ "हाथ-दर्पण" आकृति विज्ञान को अपनाने जो टी कोशिकाओं के आकार में परिवर्तन करने जा रहा है और वापस 4 में एक अनुगामी किनारे, या uropod,। इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर घटकों प्रवास को बनाए रखने के लिए एक polarized टी सेल के इन दो विपरीत क्षेत्रों में अलग कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, केमोकाइन उत्तेजना 5 और polymerized एक्टिन पर एक्टिन तंतु polymerization के बढ़ जाती है एक polarized टी सेल 2 के मोर्चे पर जम जाता है। दूसरी ओर, इस तरह के कॉर्टिकल एफ actin cytoskeleton के लिए प्लाज्मा झिल्ली लिंक जो एज़रिन-Radixin-Moesin (एर्म) परिवार के phosphorylated प्रोटीन के रूप में कई प्रोटीन, ध्रुवीकृत की uropod पर फिर से स्थानीय बनानाटी कोशिकाओं 6। दिलचस्प बात यह है कि हम और दूसरों को इस ध्रुवीकरण की प्रक्रिया टी सेल प्रवास के लिए आवश्यक है कि पता चला है। दरअसल, ध्रुवीकरण के साथ हस्तक्षेप है कि किसी भी उपचार सेलुलर गतिशीलता को बाधित करेगा। उदाहरण के लिए, असामान्य प्रोटीन के सदस्यों की गतिविधि का निषेध सी (पीकेसी) परिवार, PKCζ और PKCι ब्लॉक टी सेल ध्रुवीकरण और वृक्ष के समान कोशिकाओं 7 के अपने प्रवासी स्कैनिंग की प्रक्रिया kinases। टी सेल ध्रुवीकरण भी रो GTPases द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हमने हाल ही में वर्णित Fam65b प्रोटीन से RhoA गतिविधि के मॉडुलन एक Transwell परख 6 में विस्थापित करने के लिए टी सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन और उनकी क्षमता के साथ हस्तक्षेप दिखाया है। ध्रुवीकरण सेलुलर गतिशीलता के लिए एक शर्त कदम है, यह केमोकाइन प्रतिक्रियाओं का एक मुख्य readout के रूप में इसे यों के लिए सक्षम होने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है। सेल आकार परिवर्तन पहले से मैन्युअल 8 मापा गया। हालांकि, मात्रा का ठहराव के इस तरह के बहुत समय लेने वाली है, कि आम तौर पर केवल कुछ ही इतनीकोशिकाओं के दसियों को ध्यान में रखा जाता है।
इधर, एक नई विधि तेजी से उत्तेजना केमोकाइन उजागर करने के लिए टी lymphocytes के आकार परिवर्तन की डिग्री यों के लिए प्रस्तुत किया है। प्रौद्योगिकी cytometry के एक इमेजिंग प्रवाह केमोकाइन उत्तेजना के विभिन्न परिस्थितियों में कुशलता से ध्रुवीकृत कोशिकाओं की राशि यों के लिए एक प्रवाह cytometer और एक माइक्रोस्कोप 9 के लाभों को जोड़ती है, जो प्रयोग किया जाता है (विशिष्ट अभिकर्मकों / उपकरण की तालिका देखें)। एक इस तकनीक के साथ मजबूती उपाय कर सकते हैं कि रूपात्मक परिवर्तन की मात्रा का ठहराव के अलावा, यह केमोकाइन सिगनल पर कुछ प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए भी संभव है।
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Protocol
टी lymphocytes के 1. तैयारी
- 10,11 वर्णित के रूप में प्राथमिक माउस या मानव टी कोशिकाओं को तैयार।
- 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल - 2 के घनत्व पर 10% मानव सीरम एबी के साथ पूरा RPMI माध्यम में मानव टी कोशिकाओं खेती।
नोट: संस्कृति में मानव टी कोशिकाओं का एक बड़ा अंश का सहज ध्रुवीकरण बटोर सकते हैं भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के बजाय मानव सीरम का उपयोग करें। इस अवधि के दौरान किसी भी समय 5 दिन और आगे की प्रक्रिया के लिए उन्हें - 4 के लिए संस्कृति में इन कोशिकाओं रखें। - इसी तरह की एक सेल घनत्व में 10% एफसीएस के साथ पूरक पूरा RPMI माध्यम में माउस टी कोशिकाओं को बनाए रखें। 10 एनजी / एमएल IL7 की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर सही दूर या अगले दिन, एक हे / एन संस्कृति के बाद का उपयोग करें।
- पूरा RPMI 10% एफसीएस के साथ पूरक में यूके मानव टी सेल लाइन खेती।
2. केमोकाइन उत्तेजना
- 10 मिमी Hepe के साथ पूरक गर्म HBSS के माध्यम में प्रयोगात्मक हालत प्रति 5 x 10 5 कोशिकाओं को धो लेंएस। कुछ प्रयोगों के लिए, 2 माइक्रोग्राम प्रति pmaxGFP और 8 माइक्रोग्राम प्रति pcDNA3.1 (+ खाली वेक्टर, नियंत्रण), मृत PKCζ काइनेज, या एन टर्मिनल Par6 plasmids के साथ पहले दिन प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं सह transfect।
- गर्म HBSS-Hepes के मध्यम में सेल गोली Resuspend (प्रयोगात्मक शर्तों के 0.3 मिलीलीटर एक्स नंबर का उपयोग करें)।
- 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं को वितरित करें।
नोट: इसलिए, एक एकल प्रायोगिक हालत को इसी एक ट्यूब में 0.3 मिलीलीटर HBSS-Hepes के माध्यम में 5 x 10 5 कोशिकाओं में शामिल होंगे। कुछ प्रयोगों के लिए, 500 एनएम Latrunculin एक या वाहन (DMSO) जोड़ने और केमोकाइन उत्तेजना से पहले 30 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं। - प्रत्येक ट्यूब में 10 एनजी / एमएल CCL19 या CXCL12 केमोकाइन 500 में जोड़ें।
नोट: हम आम तौर पर 10 उपयोग - मानव टी कोशिकाओं के लिए 200 एनजी / एमएल केमोकाइन। यूके कोशिकाओं CCL19 कि बांध CCR7 रिसेप्टर व्यक्त नहीं करते। इसलिए, यूके कोशिकाओं केवल एक CXCL12 उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हो जाएगा। 500 एन - इसके अलावा, उच्च केमोकाइन सांद्रता (300 उपयोगजी / एमएल) माउस टी कोशिकाओं फूट डालना। - ट्यूब कई बार पलटें और क्रमश: प्राथमिक टी कोशिकाओं या Cem के लिए 8 या 10 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उन्हें सेते हैं।
- प्रत्येक ट्यूब 2% paraformaldehyde (पीएफए) और पीबीएस में 10 मिमी HEPES युक्त एक गर्म समाधान के 0.3 मिलीलीटर जोड़कर ध्रुवीकरण की प्रक्रिया बंद करो। ट्यूब पलटें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं।
3. Stainings
- ट्यूब प्रवाह cytometry को microcentrifuge ट्यूब से कोशिकाओं स्थानांतरण।
- 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), 0.5 मिमी EDTA और पीबीएस में 10 मिमी HEPES युक्त एक आर टी समाधान के साथ पूरी तरह से ट्यूबों भरें।
- 4 मिनट के लिए 460 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस में 5% एफसीएस युक्त एक आर टी समाधान के 100 μl में कोशिकाओं resuspend।
- प्रकाश से दूर, भंवर उन्हें, प्रत्येक ट्यूब में FITC-विरोधी एचएलए-एबीसी के 5 μl जोड़ें, और आरटी पर 30 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं।
- पीबीएस 5% एफसीएस को रोकने के साथ एक बार कोशिकाओं को धो एकएक बार ही पीबीएस के साथ एन डी।
- आरटी पर: तो 1% बीएसए, 0.5 मिमी EDTA और पीबीएस में 10 मिमी HEPES युक्त समाधान के साथ कोशिकाओं को धोने, 10 मिनट के लिए सेते हैं, 500 μl 1% पीएफए जोड़ें।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें पीबीएस 0.2% बीएसए, 0.1% सैपोनिन, 0.5 मिमी EDTA और 10 मिमी HEPES (permeabilization के बफर) युक्त का एक समाधान के साथ पूरी तरह से ट्यूबों भरें।
- इस माध्यम में कोशिकाओं को दो बार धोएं।
- मध्यम हटाने और सेल गोली अलग कर देना करने के लिए उन्हें भंवर ट्यूब फ्लिप।
- प्रत्येक ट्यूब विरोधी पी-एर्म एंटीबॉडी के 100 कमजोर पड़ने, भंवर उन्हें और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं: और / या एक एक 0.25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / TRITC-Phalloidin जोड़ें।
- Permeabilization के बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें। एक फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी यदि आवश्यक हो तो साथ सेते हैं।
- 200 μl पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend और microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण।
नोट: प्रकोष्ठों के अधिग्रहण के लिए तैयार हैं। ट्यूब प्रति 200 μl की एक अधिकतम कुल मात्रा रखते हुए वैकल्पिक रूप से, एक अंतिम 1% करने के लिए केंद्रित पीएफए जोड़नेकोशिकाओं आगे की प्रक्रिया के लिए एक ही दिन में इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं क्रम में एकाग्रता stainings संरक्षित करने के लिए।
4. छवियाँ अधिग्रहण और विश्लेषण
- तंत्र (विशिष्ट अभिकर्मकों / उपकरण की तालिका देखें) पर स्विच और यह निर्माता के निर्देशों के अनुसार खुद को जांचना करते हैं।
नोट: प्रेरित सॉफ्टवेयर एक 40x उद्देश्य (0.75 एनए) के साथ इस्तेमाल किया गया था। विचारों 3.0 सॉफ्टवेयर सभी रिपोर्ट quantifications के लिए इस्तेमाल किया गया था। - भविष्य प्रयोगों के लिए एक टेम्पलेट में बचाया जा सकता है, जो अधिग्रहण खिड़कियों की एक श्रृंखला तैयार करें। आरएमएस ढाल मूल्यों यों कि histograms ड्रा। आरएमएस ढाल हिस्टोग्राम पर चयनित "फोकस में" जनसंख्या, से, क्षेत्र के एक हिस्टोग्राम पर "एकल कोशिका" जनसंख्या हदबंदी करना। Microcentrifuge ट्यूब मशीन में डाला गया है, एक बार, व्यक्ति की कोशिकाओं पर गेट लेजर शक्ति को समायोजित करने और 5000 टी lymphocytes अधिग्रहण।
- मुलायम विचारों मेंबर्तन, अधिग्रहण फ़ाइल को खोलने और प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए प्राप्त उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के लिए ढाल आरएमएस मूल्य के मूल्य दिखा देंगे कि एक हिस्टोग्राम (चैनल 1) बना। 57 से ऊपर आरएमएस ढाल मूल्य का प्रदर्शन कोशिकाओं मानता है कि आरएमएस ढाल हिस्टोग्राम पर एक गेट ड्रा।
नोट: आरएमएस ढाल के विश्लेषण के फोकल हवाई जहाज़ में हैं कि केवल टी lymphocytes में ध्यान में रखते हुए की अनुमति देता है। हम 57 से बेहतर एक आरएमएस ढाल मूल्य का प्रदर्शन व्यक्ति की कोशिकाओं फोकल हवाई जहाज़ में हैं, और इसे सही माना जा सकता है कि अनुभव से निर्धारित किया है। - विश्लेषण / मास्क मेनू में, 2 पिक्सल का घिस brightfield छवियों एम 01, पर आकृति विज्ञान नकाब से (M01,2) इरोड कहा जाता है, एक नया मुखौटा बना। तो फिर, विश्लेषण / इरोड (M01,2) मुखौटा पर गणना क्षेत्र की एक नई सुविधा बनाने के लिए, मेनू सुविधाओं। पिछले गेट में चयनित कोशिकाओं से, इस नव निर्मित मुखौटा का उपयोग कोशिकाओं का क्षेत्रफल दिखा हिस्टोग्राम खुला।
नोट: द्वारा उपलब्ध हैं कि आकृति विज्ञान मास्कडिफ़ॉल्ट सेल का वास्तविक आकार से भी बड़ा है। इस प्रकार, यह दो पिक्सल करने के लिए इसे नष्ट करने के लिए और अधिक सटीक है। - अंशांकन माला और मलबे (छोटे क्षेत्र) और दोहरी (बड़े क्षेत्र) को छोड़कर, व्यक्तिगत टी कोशिकाओं पर एक गेट ड्रा। प्रत्येक अधिग्रहण पर इस गेट को समायोजित करें।
नोट: सेल आकार में बदलाव गेट की स्थिति को प्रभावित करेगा। माउस टी कोशिकाओं को खुद यूके कोशिकाओं की तुलना में छोटे होते हैं जो मानव टी कोशिकाओं की तुलना में छोटे होते हैं, प्रत्येक कोशिका प्रकार का क्षेत्र इसके आकार के लिए आनुपातिक हो जाएगा। - पिछले चरणों में gated गया कि एकल, में फोकस कोशिकाओं को देखते हुए, phalloidin पर कच्चे मैक्स पिक्सेल के एक समारोह के रूप में एचएलए-एबीसी धुंधला पर कच्चे मैक्स पिक्सेल की (2 चैनल, एक्स अक्ष) मिलकर एक डॉट साजिश खोलने धुंधला (चैनल 4, वाई अक्ष)। बेदाग या संतृप्त फ्लोरोसेंट घटनाओं बाहर करने के लिए एक गेट बनाएँ। कच्चे मैक्स एचएलए-एबीसी के लिए पिक्सेल (2 चैनल) और phalloidin (चैनल 4) stainings दिखा ओपन दो histograms।
- विश्लेषण / मास्क मेनू, creat मेंदो पिक्सल के घिस एचएलए-एबीसी दाग कोशिकाओं (2 चैनल), की आकृति विज्ञान नकाब से (M02,2) इरोड बुलाया ईए नया मुखौटा,। तो फिर, विश्लेषण / इरोड (M02,2) पर गणना घेरा पैरामीटर से मिलकर एक नई सुविधा, बनाने के लिए, मेनू सुविधाओं।
नोट: इस पैरामीटर एक चक्र से सेल आकार के विचलन के उपाय। इसलिए, एक पूरी तरह गोल टी सेल एक कम घेरा सूचकांक प्रदर्शन करेंगे लम्बी ध्रुवीकृत कोशिकाओं जबकि एक उच्च घेरा मूल्य होगा। - बाद में, पहले से gated कोशिकाओं से घेरा सुविधा के मूल्यों को रिपोर्ट करेंगे कि एक और हिस्टोग्राम पैदा करते हैं। सीधे प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए घेरा के मूल्य के अनुसार एक व्यक्ति, में फोकस सेल की आबादी का वितरण साजिश करने के लिए इस हिस्टोग्राम का प्रयोग करें।
- गैर प्रेरित कोशिकाओं के लिए हिस्टोग्राम के आकार को देखते हुए, घेरा सीमा मूल्य अप करने के लिए सबसे कम घेरा मूल्य पर शुरू, ध्रुवीकृत कोशिकाओं के लिए एक गेट आकर्षित जहां गैर प्रेरित कोशिकाओं के सबसेप्लॉट किए जाते हैं। Gated आबादी के बीच ध्रुवीकृत कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए आँकड़े प्रदर्शन को देखो (% Gated)।
नोट: हम 13 से नीचे घेरा सूचकांक मूल्यों के लिए इस गेट का गठन किया है। - कोशिकाओं में actin धुंधला के ध्रुवीकरण को देखने के लिए आदेश में, एचएलए-एबीसी धुंधला (2 चैनल) और phalloidin धुंधला तुलना, तेज विस्तार से समानता R3 के मूल्य के लिए एक हिस्टोग्राम साजिश (चैनल 4)।
नोट: बड़ा इस सुविधा का मूल्य अधिक दो stainings हैं आरोपित। - पहले की तरह ही gating रणनीति का प्रयोग, ध्रुवीकृत एक्टिन धुंधला के साथ कोशिकाओं के प्रतिशत से पता चलता है कि अलग धुंधला के लिए गैर-प्रेरित कोशिकाओं पर एक गेट साजिश है।
- जब पूरा हो, MHC वर्ग मैं और phalloidin stainings, एक साथ एसडी ± सभी कोशिकाओं का घेरा और समानता अनुक्रमित का मतलब मूल्यों के साथ ध्रुवीकृत कोशिकाओं के प्रतिशत के वितरण में एक अलगाव का प्रदर्शन कोशिकाओं का प्रतिशत corresp में दिखाया जाता हैonding आँकड़े पैनल।
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Representative Results
यहाँ चुना पहला उदाहरण CCL19 के साथ प्रेरित मानव प्राथमिक टी lymphocytes के उपयोग से संबंधित है। हालांकि, एक ही रणनीति प्राथमिक माउस टी कोशिकाओं, टी सेल लाइनों या केमोकाइन उत्तेजना के लिए उत्तरदायी किसी भी अन्य प्रकार की कोशिका के साथ प्रयोग किया जा सकता है। यहाँ प्रस्तुत gating रणनीति ध्यान केंद्रित घटनाओं, तो एकल कक्षों का चयन करें कि खिड़कियों की एक श्रृंखला शामिल है। (चित्रा 1) या CCL19 उत्तेजित (चित्रा 2) टी lymphocytes आराम के लिए MHC वर्ग मैं एचएलए-एबीसी और filamentous एक्टिन: अंत में प्रतिदीप्ति तीव्रता की सीमा दो मार्करों पर यहाँ एक उदाहरण के रूप में पीछा किया जाता है।
सबसे पहले, घेरा सूचकांक अनुपचारित (चित्रा 1) या CCL19 उत्तेजित (चित्रा 2) टी lymphocytes में मापा जाता है। आराम कोशिकाओं को एक उच्च घेरा सूचकांक मूल्य के साथ एक प्रमुख एकल शिखर तथ्य यह है कि सबसे कोशिकाओं गोल करने के करीब हैं कि इंगित करता है। हालांकि, यह CCL19 उत्तेजना ओ उपस्थिति elicits स्पष्ट है किएक कम घेरा सूचकांक के साथ कोशिकाओं के एफए दूसरा उप-जनसंख्या। इस उप-जनसंख्या एक polarized आकृति विज्ञान को अपनाया है कि कोशिकाओं शामिल हैं। एचएलए-एबीसी और एफ actin धुंधला के बीच तेज विस्तार से समानता सूचकांक का प्रतिनिधित्व इसके अलावा, जब एक कुछ कोशिकाओं दोनों मार्करों सह स्थानीयकरण के एक डिग्री कम दिखाने का संकेत है कि, CCL19 उपचार पर इस सूचकांक के मूल्य में एक बूंद कि प्रदर्शन का निरीक्षण कर सकते हैं । डॉट भूखंडों पहले से प्रस्तुत से दिलचस्प है, एक। एक brightfield छवि और प्रदर्शन किया stainings से प्रत्येक के लिए एक छवि से मिलकर सेल की एक तस्वीर प्राप्त करने के लिए किसी विशेष डॉट पर curser की स्थिति इस प्रकार CCL19 के उदाहरण टी प्रेरित प्रस्तुत करता है 3 आंकड़ा कर सकते हैं गैर ध्रुवीकृत (चित्रा 3 ए) या ध्रुवीकरण (3B चित्रा) कोशिकाओं के गेट में गिर जाते हैं कि लिम्फोसाइटों। एक स्पष्ट रूप से दोनों उप-जनसंख्या के बीच आकृति विज्ञान में मतभेद कल्पना कर सकते हैं। आंकड़े 1 से घेरा histograms के नीचे आँकड़े टेबल से 2, एक अनुपस्थिति या CCL19 की उपस्थिति (चित्रा -3 सी) में ध्रुवीकृत गेट में गिर जाते हैं कि कोशिकाओं का प्रतिशत साजिश कर सकते हैं। जैसी कि उम्मीद थी, यह केमोकाइन उत्तेजना (11.2% से 50.6% करने के लिए) polarized टी कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ जाती है कि स्पष्ट है। एक भी दोनों स्थितियों (चित्रा 3 डी) में प्राप्त पूरे सेल की आबादी का मतलब घेरा सूचकांक साजिश कर सकते हैं। CCL19 उत्तेजना इस सूचकांक में एक बूंद elicits। केवल आधा कोशिकाओं ध्रुवीकृत हैं लेकिन, जैसा कि CCL19 उत्तेजना पर मनाया मतलब घेरा सूचकांक में परिवर्तन छोटा है।
इसी तरह, चित्रा 4 एचएलए-एबीसी और एफ actin दोनों stainings (चित्रा -4 ए) करते हैं या (4B चित्रा) colocalize नहीं है जिसमें CCL19 उत्तेजित कोशिकाओं, के उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है। आंकड़े 1 और 2 में दिखाया तेज विस्तार से समानता histograms के नीचे आँकड़े टेबल से, एक अनुपात प्राप्त कर सकते हैंएचएलए-एबीसी और एफ actin के बीच सह स्थानीयकरण का एक बहुत कम डिग्री प्रदर्शन है कि कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व 1.5 नीचे एक सूचकांक मूल्य प्रदर्शन है कि कोशिकाओं की। चित्रा 4C से पता चलता है कि CCL19 उत्तेजना पर इस गेट बढ़ जाती है में गिर जाता है कि कोशिकाओं के अंश ( 3.4%) से 13.9% करने के लिए। प्रत्येक व्यक्ति के सेल के सूचकांक के मूल्यों का संग्रह, एक भी दोनों स्थितियों (चित्रा 4D) में प्राप्त पूरे सेल की आबादी का मतलब तेज विस्तार से समानता सूचकांक साजिश कर सकते हैं। CCL19 हालांकि, पहले के रूप में एक ही कारण के लिए, परिवर्तन छोटे हैं, सूचकांक में एक बूंद elicits। सह स्थानीयकरण एफ actin सेल के एक पोल में एफ actin के क्लस्टरिंग के लिए मुख्य कारण है - इसी कोशिकाओं की छवियों को देख कर, यह एचएलए-एबीसी में इस गिरावट है कि प्रतीत होता है। इसके विपरीत, एचएलए-एबीसी MHC वर्ग मैं अणुओं के subcellular वितरण निहायत CCL19 उत्तेजना से प्रभावित होने की नहीं लगती।
यही कारण है कि हम अगले आगे का परीक्षण करने का फैसला किया है कारण हैनाम से जाना जाता दो मार्कर (एफ actin और phospho-एर्म) का विश्लेषण करके कार्यप्रणाली केमोकाइन उत्तेजित टी कोशिकाओं के डंडे के विरोध में अलग करने के लिए। (50 एनजी / एमएल CXCL12 साथ उत्तेजना के 8 मिनट के बाद 5.95% से 79.10% ध्रुवीकृत कोशिकाओं के लिए) पहले से ही gating रणनीति के साथ चित्रा 5A में मात्रा के रूप में CXCL12 के साथ प्रेरित मानव टी कोशिकाओं, दृढ़ता से polarized। एफ actin और phospho-एर्म CXCL12 उत्तेजना के बाद कम colocalize जिसका अर्थ है कि आंकड़े 5 ब और 5D में दिखाया गया है कि इन स्थितियों में, मतलब तेज विस्तार से समानता सूचकांक में एक मजबूत कमी आई है। जैसी कि उम्मीद थी, यहाँ चुना मार्करों के अलगाव का प्रदर्शन कोशिकाओं का प्रतिशत पहले से अध्ययन वाले (14%, चित्रा 4C) की तुलना में (48%, चित्रा 5C) अधिक है। तदनुसार, प्रत्येक शर्त का मतलब समानता सूचकांक में गिरावट भी (चित्रा 5D) और अधिक स्पष्ट है। इसलिए, यहाँ प्रस्तुत इमेजिंग फ्लो तकनीक सु हैitable अलग सेटिंग्स में दो stainings के सह स्थानीयकरण की डिग्री यों की।
अंत में, हम किस हद तक कुछ cytoskeletal तत्व या केमोकाइन उत्तेजना पर टी सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है संकेतन मार्ग की गड़बड़ी को वर्णन करने का फैसला किया है, प्रवाह cytometry इमेजिंग से मापा जा सकता है। नियंत्रण टी कोशिकाओं पहले ए (चित्रा 6A) latrunculin एक्टिन-खलल न डालें दवा के साथ pretreated कुछ के साथ तुलना की गई। प्रकोष्ठों प्रवाह cytometry इमेजिंग द्वारा फ्लोरोसेंट phalloidin के साथ दाग और विश्लेषण किया, CXCL12 साथ प्रेरित किया गया। एफ actin धुंधला कच्चा मैक्स पिक्सेल तीव्रता दिखा histograms दोनों सेल आबादी (चित्रा 6A, ऊपर) के लिए दिखाए जाते हैं। एक्टिन तंतु की ओर latrunculin ए के विच्छेद गतिविधि से उम्मीद थी, phalloidin धुंधला की तीव्रता वाहन DMSO के (बाएं पैनल) के साथ इलाज टी lymphocytes नियंत्रण की तुलना में इन कोशिकाओं (सही पैनल) में कम है। इसके अलावा, एक-TR latrunculineated टी कोशिकाओं वे नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 6A, नीचे) से राउंडर रहना यह दर्शाता है कि एक बड़ा घेरा सूचकांक दिखा रहे हैं। इस रूपात्मक परिवर्तन दिखा रहे हैं कि कोशिकाओं के प्रतिशत को मापने के लिए histograms पर सेट एक गेट से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। नियंत्रण कक्षों की 32% इस हालत में ध्रुवीकृत मिलता है, एक -treated टी latrunculin का केवल 10% प्रदर्शनी किसी भी आकार में परिवर्तन (चित्रा 6B) लिम्फोसाइटों। इसलिए, यह एक इस घटना में कुछ cytoskeletal तत्वों की संभावित प्रभाव का अध्ययन करता है जब प्रौद्योगिकी cytometry इमेजिंग प्रवाह रूपात्मक संशोधनों में मतभेद को मापने के लिए उपयुक्त है कि यहाँ दिखाया गया है।
दूसरे, इस विधि के साथ कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का अधिग्रहण भी एक अल्पसंख्यक के रूप में मौजूद कोशिकाओं के तेजी से छोटे सबसेट का विश्लेषण करने की संभावना को खोलता है। हमारे विश्लेषण के लिए विशेष रूप से टी कोशिकाओं के व्यवहार को सह transfect करने के लिए प्रतिबंधित है, जहां आकृति 7 में एक उदाहरण प्रस्तुत किया हैpolarity के जटिल Par6 / PKCζ के प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट के लिए एन्कोडिंग plasmids के साथ मिलकर GFP के साथ एड। गैर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को इसी हिस्टोग्राम विशेष रूप से प्रासंगिक + GFP टी कोशिकाओं (चित्रा 7A, बाएं) पर गेट करने के लिए हमें अनुमति दी गई है। 2 चैनल के प्रतिदीप्ति तीव्रता का वितरण यों कि histograms के रूप में मापा GFP की तीव्रता वास्तव में पूरे सेल की आबादी का केवल एक छोटा सा अंश (चित्रा 7A) ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है कि पता चलता है। इन ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की रूपात्मक ध्रुवीकरण की डिग्री तो GFP + कोशिकाओं (चित्रा 7B) का ही घेरा सूचकांक को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था। घेरा से कम मूल्यों का प्रदर्शन टी कोशिकाओं के लिए एक अतिरिक्त गेट प्रत्येक हालत (चित्रा 7C) में ध्रुवीकृत कोशिकाओं के प्रतिशत के आकलन की अनुमति दी। परिणाम Par6 / PKCζ संकेतन मार्ग के समारोह के विघटन टी सेल polarizati हिचकते बताते हैं किहमारे पिछले निष्कर्ष 7 के साथ लाइन में, दोनों CCL19 और CXCL12 chemokines द्वारा प्रेरित पर।
चित्रा प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं पर 1. प्रतिनिधि गैर प्रेरित धुंधला परिणाम है। ऊपरी बाएँ पैनल (चैनल 1) उज्ज्वल क्षेत्र छवियों पर एम 01 मुखौटा के साथ गणना की ढाल आरएमएस के हिस्टोग्राम repartition से पता चलता है। ऊपरी सही पैनल पिछले साजिश से gated में फोकस कोशिकाओं के brightfield छवियों पर आधारित दो पिक्सल के घिस एम 01 मुखौटा के क्षेत्र (चैनल 1) से पता चलता है। मध्य पैनलों व्यक्ति के लिए एचएलए-एबीसी और Phalloidin stainings (क्रमशः चैनल 2 और 4), या तो एक डॉट साजिश (बाएं पैनल) के रूप में या histograms (मध्य और सही पैनल) के रूप में दोनों कच्चा अधिकतम पिक्सेल मूल्यों को दिखाने के, आय पिछले चरण में चयनित कोशिकाओं ध्यान केंद्रित। सही धुंधला के साथ व्यक्तिगत, में फोकस कोशिकाओं की इस आबादी से, एचएलए-एबीसी और Phalloidin stainings के बीच समानता की डिग्री दिखा एचएलए-एबीसी धुंधला (निचले बाएँ पैनल) और तेज विस्तार से समानता R3 सुविधा (निचले सही पैनल) के 2 पिक्सल के घिस एम 02 मुखौटा पर घेरा सुविधा गणना की जाती है । इन दोनों के नवीनतम भूखंडों के लिए, जनसंख्या का repartition का संकेत आँकड़ों के नीचे एक तालिका में संकेत कर रहे हैं (gated%, फीचर, एसडी का मतलब है)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: 1। चित्रा को 8 मिनट के लिए 200 एनजी / एमएल CCL19 के साथ प्रेरित प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं पर प्रतिनिधि धुंधला परिणाम पैनल लेआउट और gating रणनीति समान हैं।जेपीजी "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: CCL19 द्वारा प्रेरित टी lymphocytes की रूपात्मक स्थिति की मात्रा। (ए, बी) चित्रा 2 के बाहर या "ध्रुवीकृत" गेट में से कोशिकाओं के उदाहरण, CCL19 के अभाव में प्राप्त ध्रुवीकृत टी कोशिकाओं का प्रतिशत दिखा क्रमश: (सी) हिस्टोग्राम। (चित्रा 1 -) या 200 एनजी के साथ / मिलीलीटर CCL19 (चित्रा 2 +) व्यक्ति में एसई ± घेरा सूचकांक का मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व (डी) हिस्टोग्राम, अनुपस्थिति में में फोकस सेल की आबादी। - CCL19 की या उपस्थिति (+) ()। *** पी <0.001। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एचएलए-एबीसी और phalloidin stainings के बीच सह स्थानीयकरण की डिग्री के चित्रा 4. मात्रा। (ए, बी) चित्रा 2 बाहर या तेज विस्तार से क्रमशः समानता हिस्टोग्राम, से "colocalized नहीं" गेट में से कोशिकाओं के उदाहरण हैं। (सी) संयुक्त राष्ट्र में दोनों मार्करों के बीच कोई सह स्थानीयकरण का प्रदर्शन टी कोशिकाओं का प्रतिशत दिखा हिस्टोग्राम (-) को प्रेरित किया। या CCL19 उत्तेजित (+) की स्थिति व्यक्ति में एसई ± समानता सूचकांक का मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व (डी) हिस्टोग्राम, अनुपस्थिति में में फोकस सेल की आबादी - CCL19 की या उपस्थिति (+) ()। *** पी <0.001। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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एफ actin चित्रा 5. विश्लेषण - मानव प्राथमिक टी कोशिकाओं की CXCL12 उत्तेजना पर phospho-एर्म बहिष्कार। CXCL12 (10 या 50 एनजी / एमएल) के अभाव या उपस्थिति में ध्रुवीकरण टी कोशिकाओं की (ए) का प्रतिशत। (बी) के तेज विस्तार से समानता सूचकांक के अनुसार अलग-अलग, में फोकस सेल की आबादी का repartition दिखा histograms cytometry इमेजिंग प्रवाह का कोई सह स्थानीयकरण का प्रदर्शन कोशिकाओं के अनुपात की कि CXCL12 के अभाव में या 10 एनजी / एमएल या 50 एनजी / एमएल CXCL12 साथ, phospho-एर्म और phalloidin stainings के बीच सह स्थानीयकरण की हद तुलना करता है। (सी) मात्रा पर्म और टी कोशिकाओं में phalloidin stainings प्रेरित है या नहीं CXCL12 साथ। हर हालत में एसई ± समानता सूचकांक का मतलब मूल्यों का (डी) मात्रा। *** पी <0.001।/ 52,140 / 52140fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "अपलोड> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
टी सेल ध्रुवीकरण पर actin के polymerization के 6 चित्रा प्रभाव। (ए) एफ actin तो Latrunculin ए (500 एनएम, 30 मिनट) या DMSO के साथ इलाज किया और प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं की धुंधला तीव्रता (ऊपरी पैनल) और घेरा (कम पैनल) 8 मिनट के लिए 100 एनजी / एमएल CXCL12 साथ प्रेरित किया। ( बी) CXCL12 साथ उत्तेजना के 8 मिनट के बाद DMSO के या Latrunculin एक साथ इलाज polarized टी कोशिकाओं का प्रतिशत दिखा हिस्टोग्राम। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा PKCζ काइनेज मृत उत्परिवर्ती या CCL19 या CXCL12 उपचार के बाद Par6 ब्लॉक टी सेल ध्रुवीकरण के एन टर्मिनल उत्परिवर्ती 7. अभिव्यक्ति। गैर ट्रांसफ़ेक्ट प्राथमिक टी कोशिकाओं या प्राथमिक टी कोशिकाओं सह ट्रांसफ़ेक्ट GFP और एक खाली वेक्टर (नियंत्रण) या PKCζ की काइनेज मृत उत्परिवर्ती या साथ एन टर्मिनल में GFP की अभिव्यक्ति तीव्रता दिखा histograms cytometry (ए) इमेजिंग प्रवाह, Par6 का हिस्सा (बी) बेसल स्तर पर विभिन्न निर्माणों को व्यक्त GFP पॉजिटिव सेल की आबादी का घेरा सूचकांक का प्रतिनिधित्व histograms cytometry इमेजिंग प्रवाह (एन एस: नहीं उत्तेजना)। या CCL19 या CXCL12 उत्तेजना (100 के बाद एनजी / एमएल 8 मिनट के लिए )। (सी) बेसल स्तर पर या CCL19 या CXCL12 उत्तेजना के बाद विभिन्न निर्माणों व्यक्त आकृति विज्ञान ध्रुवीकृत टी कोशिकाओं का प्रतिशत की मात्रा। कृपया यहाँ क्लिक करें देखें एक बड़ा देखने के लिएइस आंकड़े के सायन।
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Discussion
Cytometry, एक तेजी से और सूचनात्मक gating रणनीति केमोकाइन उत्तेजना से प्रेरित सेलुलर और आणविक घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए इमेजिंग प्रवाह के एक हाल ही में प्रौद्योगिकी का उपयोग कर प्रस्तुत किया जाता है। केमोकाइन उत्तेजना और ध्रुवीकरण की प्रक्रिया के दौरान विभिन्न प्रोटीन के subcellular वितरण द्वारा प्रेरित सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन: एक ही प्रयोग से, एक सूचना के दो मुख्य प्रकार प्राप्त कर सकते हैं। दिलचस्प है, सबूत भी सांख्यिकीय मजबूती और पूरे सेल की आबादी का एक छोटा सा अंश के प्रासंगिक विश्लेषण की अनुमति देता है जो कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है, का विश्लेषण करने की संभावना के लिए प्रदान की जाती है। जैसा कि रिपोर्ट, इस तकनीक को भी प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन 12 के संदर्भ में आणविक पुनर्वितरण की घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, एक समान सेट अप पहले से ही SDF1 उत्तेजित टी कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन दो मार्करों के बीच सह स्थानीयकरण की डिग्री का कोई विश्लेषण 13 प्रदान की गई है।
हालांकिइस तकनीक को इस तरह कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त हो सकता है, पक्षपाती कोशिकाओं सीधे विश्लेषण नहीं किया जा सकता है और निलंबन में कोशिकाओं से पहले अधिग्रहण तय होने की जरूरत है। मशीन के इन आंतरिक सीमाओं के अलावा, यह उन्हें उत्तेजक जब 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इस तरह के आकार में परिवर्तन है कि ड्राइव actin के polymerization है, के रूप में cytoskeletal परिवर्तन, तापमान पर बहुत निर्भर कर रहे हैं के बाद से तापमान वास्तव में उचित टी सेल ध्रुवीकरण को प्राप्त करने की कुंजी है। Latrunculin एक इलाज कोशिकाओं के साथ हमारे प्रयोगों के लिए एक सेल इसकी पूरी तरह से ध्रुवीकृत राज्य को प्राप्त करने के लिए केमोकाइन उत्तेजना से प्रेरित उचित actin के remodeling के वास्तव में महत्वपूर्ण है कि इस बात की पुष्टि। इस दवा के साथ यहाँ उपलब्ध कराए गए आंकड़ों के अलावा, हम भी Par6 / PKCζ संकेतन मार्ग बाधित कि उत्परिवर्ती प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट मानव प्राथमिक टी lymphocytes के साथ इमेजिंग फ्लो प्रौद्योगिकी का परीक्षण किया। लगातार हमारे पहले प्रकाशित परिणाम 7 के साथ, यह यहाँ दिखाया गया है कि इस polarity के जटिल चटी सेल ध्रुवीकरण avors।
केमोकाइन उत्तेजना पर, टी कोशिकाओं एक polarized आकार को अपनाने के लिए उनके दौर आकारिकी खो देते हैं। हम उन रूपात्मक परिवर्तन यों के लिए सबसे सटीक होना करने के लिए घेरा पैरामीटर मिल गया है। हालांकि, आकार में परिवर्तन का वर्णन अन्य मानकों ऐसे पहलू अनुपात या Elongatedness के रूप में, विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रस्तावित कर रहे हैं। इसलिए, एक बड़ी आसानी से इस प्रक्रिया में एक विशेष संकेतन मार्ग के योगदान या एक विशिष्ट प्रोटीन का परीक्षण कर सकते हैं।
इस अध्ययन में, हम हमेशा एक रूपात्मक ध्रुवीकरण का प्रदर्शन कोशिकाओं का प्रतिशत आणविक ध्रुवीकरण के लिए एक से अधिक है कि मनाया है। इस मार्कर की बड़ी आणविक पुनर्वितरण में मौजूद नहीं है आकृति विज्ञान में एक परिवर्तन को अपनाने कि कोशिकाओं के एक अंश का अध्ययन किया है कि इंगित करता है। यह है कि वे स्पष्ट रूप से एक leadin नहीं दिखाते, हालांकि वे एक कम घेरा सूचकांक का प्रदर्शन तो कुछ कोशिकाओं को उनके गोल आकार खो देते हैं कि इस तथ्य से पैदा हो सकताजी बढ़त और एक uropod। ये आंशिक रूप से ध्रुवीकृत टी कोशिकाओं को अभी भी ठेठ मार्करों के स्पष्ट आणविक पुनर्वितरण में पेश बिना आकृति विज्ञान ध्रुवीकृत टी कोशिकाओं के गेट में गिर सकता है। मार्करों भी इन मतभेदों को समझा सकता है आकार परिवर्तन के लिए की तुलना में पुनर्वितरण के लिए इसके अलावा, केमोकाइन संकेत दहलीज में मतभेद अधिक हो सकता है।
यह भी एचएलए-एबीसी मार्कर ध्रुवीकृत टी कोशिकाओं में relocalized नहीं है और CCL19 उत्तेजना पर इस धुंधला की तीव्रता में कोई बदलाव नहीं आया है कि यहाँ दिखाया गया है। इसके विपरीत, एक पुष्टिकरण यहाँ प्रदान की जाती है कि CCL19 उपचार पर एफ actin धुंधला बढ़ जाती है (आंकड़े 1 और 2) केमोकाइन उत्तेजना actin के polymerization के पाँच सक्रिय हो जाता है के बाद से पहले से ही जाना जाता है, के रूप में। इसके अलावा, यह ध्रुवीकरण कोशिकाओं के मोर्चे पर relocalized मिलता है कि एक्टिन तंतु दिखाया गया है। दोनों मा के बीच सह स्थानीयकरण की हद तक है कि उपायों नतीजतन, तेज विस्तार से समानता सूचकांकrkers CCL19 उत्तेजना पर कम करने के लिए जाता है। एक तुलना के रूप में, इस तरह के एक विश्लेषण सेल सामने से बाहर रखा गया है कि मिल phospho-एर्म प्रोटीन के साथ सह स्थानीयकरण एफ actin की डिग्री के लिए यहाँ प्रदान की जाती है। एफ actin प्रदर्शन केमोकाइन उत्तेजित टी कोशिकाओं का प्रतिशत - एफ actin मोर्चे पर relocalizes और बाद phospho-एर्म (14% बनाम क्रमशः 48%,) - MHC वर्ग मैं अलगाव एफ actin के लिए एक तुलना में बहुत कम है MHC वर्ग मैं अणुओं की repartition केमोकाइन उत्तेजना से प्रभावित नहीं है, जबकि polarized टी कोशिकाओं के पीछे में phospho-एर्म प्रोटीन,। यह उज्ज्वल विस्तार से समानता सूचकांक में इस प्रकार व्यवस्थित ढंग polarized टी कोशिकाओं में दो मार्करों के वितरण की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, इस तकनीक का एक व्यापक सेल की आबादी में मौजूद दुर्लभ घटनाओं पर, संभवतः एक बड़ी कोशिकाओं की संख्या या, पर सह स्थानीयकरण या दो अलग अलग मार्करों के सह-बहिष्कार की डिग्री यों के लिए बहुत उपयुक्त है।
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।
Acknowledgments
लेखकों बहुत पियरे Bourdoncle, थॉमस Guilbert और कोचीन इमेजिंग सुविधा के लुईस Rimbault स्वीकार करते हैं। इस काम Inserm, CNRS और लीग नेशनल contre Le कैंसर (Equipe labellisée) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
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