Abstract
Celler svare kemokin stimulering ved at miste deres runde form i en proces kaldet polarisation, og ved at ændre den subcellulære lokalisering af mange proteiner. Klassiske billeddannende teknikker er blevet anvendt til at undersøge disse fænomener. De krævede imidlertid manuel erhvervelse af mange celler efterfulgt af tidskrævende kvantificering af morfologi og co-lokalisering af farvning af snesevis af celler. Her er en hurtig og effektiv metode, der er beskrevet til at studere disse fænomener på prøver bestående af flere tusinde celler under anvendelse af en billeddannende flowcytometri teknologi, der kombinerer fordelene ved et mikroskop med dem af en cytometer. Brug af T-lymfocytter stimuleret med CCL19 og farvning for MHC klasse I molekyler og trådformede actin, er en gating blev fremlagt for at måle samtidigt graden af formen ændringer og omfanget af co-lokalisering af markører, der er berørt af CCL19 signalering. Desuden denne gating strategi tilladt os at ligeholdee adskillelse af trådformede actin (forrest) og phosphoryleret Ezrin-Radixin-moesin (phospho-ERM) proteiner (på bagsiden) i polariserede T-celler efter CXCL12 stimulation. Denne teknik var også nyttigt at observere blokerende effekt på polarisering af to forskellige elementer: hæmning af actinpolymerisation ved en farmakologisk inhibitor og udtryk for mutanter af Par6 / atypiske PKC-signalvejen. Således beviser vist, at denne teknik er nyttigt at analysere både morfologiske ændringer og protein omfordelinger.
Introduction
Kemokiner er små opløselige proteiner, der tiltrækker celler til specialiserede steder 1. Derfor er de deltager i den korrekte placering af celler i væv, en afgørende funktion i udvikling og fysiologi. Immunsystemet er ingen undtagelse fra denne regel, da den er afhængig af virkningen af mange forskellige celletyper, der virker i forening at montere et effektivt immunrespons. Ved at styre den specifikke placering af en immun celletype i en given tilstand, chemokiner er præ-påkrævet før fremmede antigener kan detekteres og neutraliseres.
I T-lymfocytter i særdeleshed, chemokiner binder til specifikke overfladereceptorer, som ved indgreb, fremkalder mange intracellulære signaler (calcium Rise, ERK phosphorylering, Rho GTPaser aktivering, stigning i integriner affinitet og cytoskeletale ændringer), der begunstiger T cellemotilitet 2,3. På celleniveau, kan man iagttage morfologiske ændringer fremkaldt ved chemokin stimulation.Disse ændringer i celleformer er særligt dramatisk i T-celler: hvilende T-celler har en vulstagtig runde morfologi, når de rejser i blodet. Imidlertid er sensing af tilstedeværelsen af kemokiner i inflammatoriske steder eller i nærheden af lymfoide organer vil ændre formen af T-celler, som nu vedtage en typisk "hånd-spejl" morfologi bestående af en bipolær måde: en ledende kant forrest og en bagkant, eller uropod på bagsiden 4. Desuden kan intracellulære komponenter adskille ind i disse to modstående regioner af et polariseret T-celle for at opretholde migration. For eksempel actinfilamenter polymerisationsbetingelser stigninger upon chemokin stimulation 5 og polymeriseret actin akkumuleres på forsiden af en polariseret T-celle 2. På den anden side, flere proteiner, såsom phosphorylerede proteiner fra Ezrin-Radixin-moesin (ERM) -familien, som forbinder plasmamembranen til den korticale F-actin cytoskeleton, re-lokalisere på uropod af polariseretT-celler 6. Interessant nok har vi og andre vist, at denne polarisering proces er nødvendig for T-celle-migration. Faktisk vil en hvilken som helst behandling, der interfererer med polarisering hæmme cellulær motilitet. For eksempel inhibering af aktiviteten af medlemmer af atypiske protein kinaser C (PKC) familien, PKCζ og PKCι blokerer T-celle polarisering og deres vandrende scanningen af dendritiske celler 7. T-celle polarisering er også reguleret af Rho GTPaser. Vi har vist, at modulering af RhoA aktivitet ved den nyligt beskrevne Fam65b protein interfererer med T-celle forandringer i morfologi og deres evne til at migrere i en Transwell assay 6. Som polarisering er en forudsætning skridt for cellulær motilitet, er det derfor afgørende at være i stand til at sætte tal på det som en vigtigste udlæsning af chemokin svar. Celleform ændringer er tidligere målt manuelt 8. Men denne type kvantificering er meget tidskrævende, så der normalt kun fåsnesevis af celler tages i betragtning.
Her er en ny metode præsenteres hurtigt kvantificere graden af form ændringer af T-lymfocytter udsættes for kemokin stimulation. En imaging flowcytometri teknologi (se tabel for specifikke reagenser / udstyr) anvendes, som kombinerer fordelene ved et flowcytometer og et mikroskop 9 at kvantificere effektivt mængden af polariserede celler i forskellige forhold af chemokin stimulation. Ud over kvantificering af de morfologiske ændringer, at man kan måle robust med denne teknologi, er det også muligt at vurdere ændringer i den subcellulære lokalisering af nogle proteiner upon kemokinsignalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af T-lymfocytter
- Forbered primær mus eller humane T-celler, som beskrevet 10,11.
- Dyrk humane T-celler i komplet RPMI-medium med 10% humant serum AB med en densitet på 2 - 3 x 10 6 celler / ml.
BEMÆRK: Anvendelse af føtalt kalveserum (FCS) i stedet for human-serum kan fremkalde spontan polarisering af en stor fraktion af humane T-celler i kultur. Opbevar disse celler i kultur i 4 - 5 dage, og videre proces dem når som helst i løbet af denne periode. - Oprethold muse-T-celler i komplet RPMI-medium suppleret med 10% FCS ved en lignende celletæthed. Brug højre væk eller den næste dag, efter en O / N-kulturen ved 37 ° C i nærvær af 10 ng / ml IL7.
- Dyrk CEM human T-cellelinie i komplet RPMI suppleret med 10% FCS.
2. Chemokine Stimulation
- Vask 5 x 10 5 celler pr eksperimentel betingelse i varmt HBSS medium suppleret med 10 mM Hepes. For nogle forsøg co-transfektion af primære humane T-celler dagen før med 2 ug pmaxGFP og 8 ug pcDNA3.1 + (tom vektor, kontrol), PKCζ kinase død, eller N-terminale Par6 plasmider.
- Resuspender cellepelleten i varmt HBSS-Hepes-medium (bruge 0,3 ml x antal eksperimentelle betingelser).
- Fordel cellerne i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Derfor vil et rør, der svarer til en enkelt eksperimentel betingelse indeholde 5 x 10 5 celler i 0,3 ml HBSS-Hepes-medium. For nogle eksperimenter tilsættes 500 nM Latrunculin A eller vehikel (DMSO), og der inkuberes cellerne i 30 minutter før chemokin stimulation. - Tilsæt 10 til 500 ng / ml CCL19 eller CXCL12 kemokin i hvert rør.
BEMÆRK: Vi bruger normalt 10-200 ng / ml kemokin for humane T-celler. CEM-celler udtrykker ikke CCR7 receptor, som binder CCL19. Derfor vil CEM-celler kun kunne reagere på en CXCL12 stimulation. Desuden anvende højere chemokin koncentrationer (300-500 ng / ml) til at polarisere muse T-celler. - Flip rørene flere gange og inkubere dem i et 37 ° C vandbad i 8 eller 10 min for primære T-celler eller CEM hhv.
- Stop polarisering proces ved til hvert rør 0,3 ml af en varm opløsning indeholdende 2% paraformaldehyd (PFA) og 10 mM Hepes i PBS. Flip rørene og inkubere dem ved 37 ° C i 5 minutter.
3. farvninger
- Overførsel af cellerne fra mikrocentrifugerør flowcytometri rør.
- Fyld rørene helt med en RT opløsning indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA og 10 mM Hepes i PBS.
- Centrifuger rørene ved 460 xg i 4 min.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 100 pi af en RT opløsning indeholdende 5% FCS i PBS.
- Tilsæt 5 pi FITC-anti-HLA-ABC i hvert rør, vortex dem, og inkubere dem i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Vask cellerne én gang med PBS indeholdende 5% FCS, ennd gang med kun PBS.
- Ved stuetemperatur: tilføj 500 pi 1% PFA, inkuberes i 10 minutter, derefter vaskes cellerne med en opløsning indeholdende 1% BSA, 0,5 mM EDTA og 10 mM HEPES i PBS.
- Supernatanten, fylde rørene helt med en opløsning af PBS indeholdende 0,2% BSA, 0,1% saponin, 0,5 mM EDTA og 10 mM Hepes (permeabilisering buffer).
- Vask cellerne to gange i dette medium.
- Flip rørene for at fjerne medium og vortex dem at dissociere cellepelleten.
- Tilføj 0,25 ug / ml TRITC-Phalloidin og / eller en 1: 100 fortynding af anti-P-ERM antistof til hvert rør, vortex dem og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne med permeabilization buffer. Inkuberes med et fluorescerende sekundært antistof, hvis nødvendigt.
- Resuspender cellerne i 200 pi PBS og overføre dem til mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Celler er klar til overtagelse. Alternativt, medens en maksimal samlet volumen på 200 pi pr rør tilsættes koncentreret PFA til en endelig 1%koncentration for at bevare de farvninger hvis cellerne ikke skal bruges samme dag til videre forarbejdning.
4. Billeder indsamling og analyse
- Tænd for apparatet (se tabel af specifikke reagenser / udstyr), og lad det kalibrere sig selv i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: Inspire software blev brugt med en 40X mål (0,75 NA). Ideerne 3,0 software blev anvendt til alle de rapporterede tal på. - Forbered en række erhvervelse vinduer som kan gemmes i en skabelon for fremtidige eksperimenter. Tegn histogrammer, der kvantificerer RMS gradient værdier. Fra "i fokus" befolkning, som udvælges på RMS gradient histogram, afgrænse de "Single celle" befolkning på et histogram af området. Når mikrocentrifugerør er blevet indsat i maskinen, skal du justere laser magt, gate på enkelte celler og erhverve 5.000 T-lymfocytter.
- I Idéer blødeware, åbne købet filen og oprette et histogram, der viser værdien af gradienten RMS værdi for lyse felt billeder (Kanal 1) opnået for hver enkelt celle. Tegn en port på RMS gradient histogram, der mener celler udviser RMS gradient værdi over 57.
BEMÆRK: RMS gradient tillader under hensyntagen til analysen kun de T-lymfocytter, der er i brændplanet. Vi har bestemt empirisk, at enkelte celler, der udviser en RMS gradient værdi overlegen til 57 er i brændplanet og præcist kan overvejes. - I analysen / Masker menu, oprette en ny maske, kaldet Erode (M01,2) fra morfologi maske på lysfelt billeder M01, eroderet af 2 pixels. Så i Analysis / Egenskaber menuen, oprette en ny funktion i området, beregnet på Erode (M01,2) maske. Fra det valgte i forrige gate celler, åbne en histogram der viser det område af celler ved hjælp af denne nyoprettede maske.
BEMÆRK: morfologi masker, der er tilgængeligestandard er meget større end den faktiske størrelse af cellen. Således er det mere præcist at udhule det op til 2 pixels. - Tegn en gate på de individuelle T-celler, bortset fra kalibrering perler og snavs (lille område) og dubletter (stort område). Juster denne port ved hvert køb.
BEMÆRK: Variationer i cellestørrelse vil påvirke positionen af porten. Som muse-T-celler er mindre end humane T-celler, som selv er mindre end CEM-celler, vil arealet af hver celletype være proportional med dens størrelse. - I betragtning af de enkelte, i fokus celler, som blev gated ved de foregående trin, åbne en dot-plot, der består af Raw Max pixel på HLA-ABC-farvning (kanal 2, x-akse) som en funktion af den ufortyndede Max pixel på phalloidin farvning (Channel 4, y-akse). Opret en gate til at udelukke de ufarvede eller mættede fluorescerende begivenheder. Åbne to histogrammer viser Raw Max Pixel for HLA-ABC (Kanal 2) og phalloidin (Channel 4) farvninger.
- I analysen / Masker menuen createa ny maske, kaldet Erode (M02,2) fra morfologi maske af HLA-ABC farvede celler (Kanal 2), eroderet af 2 pixels. Så i Analysis / Egenskaber menuen, oprette en ny funktion, der består af Cirkulariteten parameter, beregnet på Erode (M02,2).
BEMÆRK: Denne parameter måler afvigelsen af cellen form fra en cirkel. Derfor vil en perfekt rund T-celle har en høj cirkelform værdi henviser aflange polariserede celler vil udvise en lav cirkelform indeks. - Efterfølgende oprette en anden histogram, der vil rapportere værdierne for Cirkulariteten funktionen fra tidligere gated celler. Brug dette histogram direkte plotte fordelingen af et individ, i fokus cellepopulation ifølge værdien af Cirkulariteten for hver enkelt celle.
- Ser man på formen af histogrammet for ikke-stimulerede celler, tegne en gate for polariserede celler, der starter ved den laveste cirkularitet værdi op til cirkularitet grænseværdi, hvor de fleste af de ikke-stimulerede cellerer afbildet. Ser på statistikken display for procentdelen af polariserede celler blandt gated befolkningen (% Gated).
BEMÆRK: Vi har sat denne gate for cirkularitet indeksværdier under 13. - For at se på polarisering af actin-farvning i cellerne, plotte et histogram for Bright Detail Similarity R3 værdi, sammenligner HLA-ABC-farvning (kanal 2) og phalloidin-farvning (Channel 4).
BEMÆRK: Jo større værdien af denne funktion, jo mere overlejret de to farvninger er. - Brug af samme gating-strategi som før, plotte en port på den ikke-stimulerede celler til særskilt farvning, der viser procentdelen af celler med polariseret actin farvning.
- Når det er gennemført, er procentdelen af celler, der udviser en adskillelse i fordelingen af MHC klasse I og phalloidin farvninger, procentdelen af polariserede celler sammen med de gennemsnitlige værdier af cirkularitet og Similarity indeks over alle celler ± SD vises i CORRESPonding statistik paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det første eksempel er valgt her, vedrører anvendelsen af humane primære T-lymfocytter stimuleret med CCL19. Imidlertid kan den samme strategi anvendes med primære muse-T-celler, T-cellelinier eller enhver anden celletype reagerer på chemokin stimulation. Den gating, der fremlægges her, omfatter en række vinduer, der vælger de fokuserede begivenheder, derefter de enkelte celler. Endelig række fluorescensintensitet følges her som et eksempel på to markører: MHC klasse I HLA-ABC og filamentøs actin til hvile (figur 1) eller CCL19-stimulerede (figur 2) T-lymfocytter.
Først Cirkulariteten indekset målt i ubehandlet (figur 1) eller CCL19-stimulerede (figur 2) T-lymfocytter. Den omstændighed, at hvilende celler har en større enkelt top med en høj Cirkulariteten indeks værdi indikerer, at de fleste celler er tæt på at runde. Det er imidlertid klart, at CCL19 stimulation fremkalder udseendet ofa anden delpopulation af celler med et lavt Cirkulariteten indeks. Denne subpopulation omfatter celler, der har indført en polariseret morfologi. Også, når repræsenterer Bright Detail Similarity indeks mellem HLA-ABC og F-actin-farvning, kan man iagttage, at nogle celler udviser et fald i værdien af dette indeks på CCL19 behandling, hvilket indikerer, at begge markører viser en lavere grad af co-lokalisering . Interessant fra dot-plots præsenteret tidligere, kan man placere markøren på et bestemt punkt for at få et billede af cellen består af et lysfelt billede og et billede for hvert af de farvninger udføres. Figur 3 således viser eksempler på CCL19 stimulerede T lymfocytter, der falder i indgangen af ikke polariseret (figur 3A) eller polariseret (figur 3B) celler. Man kan tydeligt visualisere forskelle i morfologi mellem de to subpopulationer. Af statistikken tabeller under de cirkularitet histogrammer fra figur 1 2, kan man plotte procentdelen af celler, der falder i den polariserede gate i fravær eller nærvær af CCL19 (figur 3C). Som forventet, er det klart, at chemokin stimulation øger procentdelen af polariseret T-celler (fra 11,2% til 50,6%). Man kan også plotte middelværdien Cirkulariteten indeks af hele cellepopulationen opnået i begge betingelser (figur 3D). CCL19 stimulation fremkalder et fald i dette indeks. Da kun halvdelen af cellerne er polariseret, ændringen i den gennemsnitlige Cirkulariteten indeks observeret efter CCL19 stimulation er lille.
Tilsvarende Figur 4 repræsenterer eksempler på CCL19-stimulerede celler, hvor både HLA-ABC og F-actin farvninger aktiviteter (figur 4A) eller ikke colocalize (figur 4B). Af statistikken tabeller under de Bright Detail Similarity histogrammer er vist i figur 1 og 2, kan man få den andelaf celler, der udviser en index-værdi på under 1,5, som repræsenterer celler, der udviser en meget lav grad af co-lokalisering mellem HLA-ABC og F-actin. Figur 4C viser, at fraktionen af celler, der falder i denne port stiger upon CCL19 stimulation ( fra 3,4% til 13,9%). Indsamling værdierne af indeks for hver enkelt celle, kan man også plotte middelværdien Bright Detail lighed indeks af hele cellepopulationen opnået i begge betingelser (figur 4D). CCL19 fremkalder et fald i indekset, men for de samme grunde som tidligere ændringer er små. Ved at kigge på billederne af de tilsvarende celler, fremgår det, at dette fald i HLA-ABC - F-actin co-lokalisering er primært på grund af ophobning af F-actin i den ene pol af cellen. Omvendt betyder subcellulære fordeling af HLA-ABC MHC klasse I molekyler ikke at være groft påvirket af CCL19 stimulation.
Det er grunden til, at vi næste besluttede at teste yderligeremetoden ved at analysere to markører (F-actin og phospho-ERM) vides at adskille i at modsætte poler chemokin-stimulerede T-celler. Humane T-celler stimuleret med CXCL12 polariseret stærkt, som kvantificeret i figur 5A med samme gating strategi end før (fra 5,95% til 79,10% polariserede celler efter 8 min af stimulation med 50 ng / mL CXCL12). Under disse omstændigheder er der et stærkt fald i den gennemsnitlige Bright Detail Similarity indeks som vist i figur 5B og 5D, hvilket betyder, at F-actin og phospho-ERM colocalize mindre efter CXCL12 stimulation. Som forventet, procentdelen af celler, der udviser en adskillelse af markører valgt her er højere (48%, figur 5C) sammenlignet med dem, der tidligere er undersøgt (14%, figur 4C). Følgelig fald i den gennemsnitlige Similarity indekset af hver betingelse er også mere indlysende (figur 5D). Derfor imaging flowcytometri teknik præsenteres her er suudenom at kvantificere graden af co-lokalisering af to farvninger i forskellige sammenhænge.
Endelig besluttede vi at illustrere, i hvilket omfang den forstyrrelse af nogle cytoskeletal element eller signalvejen vides at påvirke ændringer i T-celle morfologi upon chemokin stimulation, kan måles ved billeddannelse af flowcytometri. Kontrol T-celler blev først sammenlignet med nogle forbehandlet med actin forstyrrelser lægemiddel latrunculin A (figur 6A). Celler blev stimuleret med CXCL12, farvet med fluorescerende phalloidin og analyseres ved afbildning af flowcytometri. Histogrammer viser Raw Max Pixel intensiteten af F-actin-farvning er vist for begge cellepopulationer (figur 6A, øverst). Som forventet ud fra adskillelsesorganet aktivitet latrunculin A mod actinfilamenter, intensiteten af phalloidin-farvning er lavere i disse celler (højre panel) i forhold til at styre T-lymfocytter behandlet med køretøjet DMSO (venstre panel). Desuden latrunculin A-trprettet T-celler udviser en større Cirkulariteten indeks indikerer, at de forbliver rundt end kontrolceller (figur 6A, nederst). Dette kan kvantificeres ved en gate indstillet på histogrammer at måle procentdelen af celler, der udviser morfologiske ændringer. Selvom 32% af kontrol celler får polariseret i denne tilstand, kun 10% af latrunculin En -behandlet T-lymfocytter udviser nogen form ændringer (figur 6b). Derfor er det her vist, at den billeddannende flowcytometri teknologi er egnet til at måle forskelle i morfologiske ændringer, når man studerer den potentielle virkning af nogle cytoskeletale elementer i dette fænomen.
For det andet åbner erhvervelse af et stort antal celler med denne fremgangsmåde også mulighed for hurtigt at analysere små undergrupper af celler til stede som en minoritet. I figur 7 er et eksempel præsenteret hvor vores analyse er specifikt begrænset til adfærd af T-celler co-transficereed med GFP sammen med plasmider, der koder for dominante negative mutanter af polariteten kompleks Par6 / PKCζ. Histogrammet svarende til de ikke-transficerede celler har tilladt os at gate specifikt på det relevante GFP + -T-celler (figur 7A, til venstre). Intensiteten af GFP målt som histogrammer, der kvantificerer fordelingen af fluorescensintensiteten af kanal 2 faktisk viser, at kun en lille brøkdel af hele cellepopulationen er blevet transficeret (figur 7A). Graden af morfologiske polarisering af disse transficerede celler blev derefter kvantificeret ved måling kun Cirkulariteten indeks af GFP + -celler (Figur 7B). En yderligere gate for T-celler, der udviser lave værdier af Cirkulariteten tilladt estimering af procentdelen af polariserede celler i hver tilstand (figur 7C). Resultaterne viser, at afbrydelse af funktionen af Par6 / PKCζ signalvejen hæmmede T-celle polarizatipå induceret af både CCL19 og CXCL12 kemokiner, i overensstemmelse med vores tidligere resultater 7.
Figur 1. Repræsentative ikke-stimuleret farvningsresultater på primære humane T-celler. Det øverste venstre panel viser histogrammet fordelingen af Gradient RMS beregnes med M01 maske på den lyse felt billeder (Kanal 1). Den øverste højre panel viser det område af M01 masken eroderet af 2 pixels, på grundlag af de lysfelt billeder (kanal 1) af de i Fokus celler gated fra den tidligere plot. De midterste paneler viser Raw Max pixelværdier både HLA-ABC og phalloidin farvninger (kanal 2 og 4, henholdsvis) enten som en punktdiagram (venstre panel) eller som histogrammer (midten og højre paneler) for den enkelte, in- fokus celler valgt i det foregående trin. Fra denne population af individuelle, i fokus celler med korrekt farvning beregnes den Cirkulariteten funktionen på M02 maske eroderet af 2 pixels i HLA-ABC-farvning (nederste venstre panel) og Bright Detail Similarity R3 funktionen (nederste højre panel), der viser graden af lighed mellem HLA-ABC og phalloidin farvninger . For disse to seneste plots, statistikker, der viser fordelingen af befolkningen (% gated, gennemsnit af de træk, SD) er angivet i en tabel nedenfor. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Repræsentative farvningsresultater på primære humane T-celler stimuleret med 200 ng / ml CCL19 for 8 min Panelet layout og gating strategi er identiske med figur 1.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af morfologiske status af T-lymfocytter stimuleret med CCL19. (A, B) Eksempler på celler fra figur 2 uden for eller i "polariseret" gate henholdsvis (C) Histogram, der viser procentdelen af polariserede T-celler opnået i fravær af CCL19. (Figur 1, -) eller med 200 ng / ml CCL19 (Figur 2, +) (D) Histogram repræsenterer middelværdier af cirkularitet indeks ± SE i individet, i fokus cellepopulation i fravær. (-) eller nærvær (+) af CCL19. *** P <0,001. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Kvantificering af graden af co-lokalisering mellem HLA-ABC og phalloidin farvninger. (A, B) Eksempler på celler fra figur 2 uden for eller i "ikke colocalized" gate fra Bright Detail Similarity histogram, henholdsvis. (C) Histogram, der viser procentdelen af T-celler udviser ingen co-lokalisering mellem begge markører i un- stimuleret (-). eller CCL19-stimuleret (+) forhold (D) Histogram repræsenterer middelværdier af ligheden indekset ± SE i individet, i-fokus cellepopulation i fravær (-) eller tilstedeværelse (+) af CCL19. *** P <0,001. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
p-together.within-side = "altid"> 
Figur 5. Analyse af F-actin - phospho-ERM udelukkelse upon CXCL12 stimulering af humane primære T-celler. (A) Procentdel af polariseret T-celler i fravær eller nærvær af CXCL12 (10 eller 50 ng / ml). (B) Imaging flowcytometri histogrammer viser fordelingen af enkelte, i fokus cellepopulation ifølge Bright Detail Similarity indeks der sammenligner omfanget af co-lokalisering mellem phospho-ERM og phalloidin farvninger, i fravær af CXCL12 eller med 10 ng / ml eller 50 ng / ml CXCL12. (C) Kvantificering af andelen af celler, der udviser ingen co-lokalisering af Perm og phalloidin farvninger i T-celler stimuleret eller ikke med CXCL12. (D) Kvantificering af middelværdierne af ligheden indekset ± SE i hver tilstand. *** P <0,001.upload / 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Virkning af actinpolymerisation på T-celle-polarisering. (A) F-actin farvningsintensitet (øverste paneler) og cylindrisk (nedre paneler) af det primære humane T-celler behandlet med Latrunculin A (500 nM, 30 min) eller DMSO og derefter stimuleret med 100 ng / ml CXCL12 for 8 min. ( B) Histogram viser procentdelen af polariseret T-celler behandlet med DMSO eller Latrunculin A efter 8 min af stimulation med CXCL12. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7. Ekspression af PKCζ kinase-dead mutant eller den N-terminale mutant af Par6 blokke T-celle polarisering efter CCL19 eller CXCL12 behandling. (A) Imaging flowcytometri histogrammer viser ekspressionen intensiteten af GFP, i ikke-transficerede primære T-celler eller primære T-celler co-transficeret med GFP og en tom vektor (kontrol) eller kinase-dead mutant af PKCζ eller N-terminale del af Par6 (B) Imaging flowcytometri histogrammer repræsenterer Cirkulariteten indekset af GFP-positive cellepopulation, der udtrykker de forskellige konstruktioner på det basale niveau (NS: Ingen stimulering). eller efter CCL19 eller CXCL12 stimulation (100 ng / ml i 8 minutter ). (C) Kvantificering af den procentdel af morfologisk polariserede T-celler, der udtrykker de forskellige konstruktioner på det basale niveau eller efter CCL19 eller CXCL12 stimulation. Klik her for at se et større verdelse af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af en ny teknologi til billeddannelse flowcytometri til en hurtig og informativ gating strategi analysere cellulære og molekylære begivenheder induceret af chemokin stimulation præsenteres. Fra et enkelt eksperiment, kan man opnå to hovedtyper af information: ændringerne i cellemorfologi induceret af chemokin stimulering og den subcellulære fordeling af forskellige proteiner i løbet af polarisering proces. Interessant er beviser også mulighed for at analysere et stort antal celler, som giver statistisk robusthed og relevant analyse af en lille brøkdel af hele cellepopulationen. Som rapporteret, kan denne teknik også anvendes til analyse af molekylære omfordeling begivenheder i forbindelse med den immunologiske synapse 12. Derudover har et lignende sæt op allerede blevet anvendt til SDF1-stimulerede T-celler, men ingen analyse af graden af co-lokalisering mellem to markører er stillet 13.
Selvomdenne teknik kan således være egnet til mange celletyper, adhærente celler ikke direkte analyseres og celler i suspension skal fastsættes forud for overtagelsen. Ud over disse iboende begrænsninger af maskinen, er det afgørende at holde cellerne ved 37 ° C, når stimulere dem. Temperaturen er faktisk nøglen til at opnå korrekt T-celle polarisering siden cytoskeletale ændringer, såsom actinpolymerisation som driver formændringer, er meget afhængig af temperaturen. Vores eksperimenter med latrunculin en behandlet celler bekræfter, at ordentlig actin remodeling induceret af chemokin stimulation er faktisk afgørende for en celle at nå sit fulde polariserede tilstand. Ud over de oplysninger her med dette stof, vi også testet den billeddannende flowcytometri teknologi med humane primære T-lymfocytter transficeret med mutantproteiner der hæmmer Par6 / PKCζ signalvejen. I overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte resultater 7, er det her vist, at denne polaritet kompleks favors T-celle polarisering.
Ved chemokin stimulation, mister T-celler deres runde morfologi til at vedtage en polariseret form. Vi har fundet Cirkulariteten parameter for at være den mest præcise at kvantificere disse morfologiske ændringer. Men andre parametre, der beskriver formændringer foreslået af analyse software, såsom Aspect Ratio eller Elongatedness. Derfor kan man nemt teste bidrag en bestemt signalvej eller et specifikt protein i denne proces.
I denne undersøgelse har vi altid observeret, at den procentdel af celler, der udviser en morfologisk polarisering er højere end den for molekylær polarisering. Dette indikerer, at en fraktion af celler, der udsteder en ændring i morfologi ikke frembyder store molekylære Videredistributioner af markørerne undersøgt. Det kan skyldes, at nogle celler mister deres runde form, så de udviser en lavere Cirkulariteten indeks selv om de ikke klart viser en leading kant og en uropod. Disse delvist polariserede T-celler kan stadig falde i porten af morfologisk polariserede T-celler uden at fremlægge klare molekylære omfordelinger af typiske markører. Desuden forskelle i kemokinet signalerer tærskel, der kunne være højere for markører omfordeling end for form ændringer kunne også forklare disse forskelle.
Det er også her vist, at HLA-ABC markør ikke relocalized i polariserede T-celler, og der er ingen ændring i intensiteten af denne farvning ved CCL19 stimulation. Omvendt er en bekræftelse her, at F-actin farvning stigninger upon CCL19 behandling (figur 1 og 2), som allerede er kendt, da chemokin stimulation aktiverer actinpolymerisation 5. Desuden er det vist, at actinfilamenter gå relocalized på forsiden af polariserede celler. Derfor Bright Detail Similarity indeks, der måler graden af co-lokalisering mellem både markers tendens til at falde på CCL19 stimulation. Til sammenligning er en sådan analyse er fastsat her for graden af F-actin co-lokalisering med phospho-ERM proteiner, bliver udelukket fra cellen front. Procentdelen af chemokin-stimulerede T-celler, der udviser F-actin - MHC klasse I adskillelse er meget lavere end den for F-actin - phospho-ERM (14% vs. henholdsvis 48%,), da F-actin relocalizes foran og phospho-ERM proteiner på bagsiden af polariserede T-celler, mens fordelingen af MHC klasse I molekyler ikke påvirkes af chemokin stimulation. Denne Bright Detail Ligheden indeks kan således systematisk anvendes til at sammenligne fordelingen af to markører i polariserede T-celler. Derfor er denne teknik er meget hensigtsmæssigt at kvantificere graden af co-lokalisering eller co-udelukkelse af to forskellige markører på et stort antal celler eller potentielt på sjældne hændelser til stede i en bred cellepopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne kraftigt anerkende Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert og Louise Rimbault af Cochin Imaging Facility. Dette arbejde blev støttet af Inserm, CNRS og Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
