Abstract
Les cellules répondent à la stimulation par la chimiokine perdre leur forme ronde dans un processus appelé polarisation, et en modifiant la localisation subcellulaire de nombreuses protéines. Techniques d'imagerie classiques ont été utilisées pour étudier ces phénomènes. Cependant, ils doivent l'acquisition manuelle de nombreuses cellules, suivie par une quantification du temps de la morphologie et de la co-localisation de la coloration de plusieurs dizaines de cellules. Ici, un procédé rapide et puissant est décrit à étudier ces phénomènes sur des échantillons constitués de plusieurs milliers de cellules en utilisant une cytométrie en flux de la technologie de formation d'image qui combine les avantages d'un microscope à celles d'un cytomètre. Utilisation de lymphocytes T stimulés avec CCL19 et coloration pour les molécules MHC de classe I et de l'actine filamenteuse, une stratégie de déclenchement est présenté simultanément à mesurer le degré de modifications de forme et l'étendue de la co-localisation de marqueurs qui sont affectés par la signalisation de CCL19. En outre, cette stratégie de porte nous a permis de OBSERVe la séparation de l'actine filamenteuse (à l'avant) et phosphorylée Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) protéines (à l'arrière) dans les cellules T polarisées après CXCL12 stimulation. Cette technique est également utile pour observer l'effet de blocage sur la polarisation de deux éléments différents: l'inhibition de la polymérisation de l'actine par un inhibiteur pharmacologique et l'expression de mutants de la / voie de signalisation de la PKC atypique PAR6. Ainsi, la preuve montre que cette technique est utile d'analyser les altérations morphologiques et redistributions de protéines.
Introduction
Les chimiokines sont de petites protéines solubles qui attirent les cellules à des endroits spécialisés 1. Par conséquent, ils participent au positionnement correct de cellules dans les tissus, un rôle crucial dans le développement et la physiologie. Le système immunitaire ne fait pas exception à cette règle car il repose sur l'action de nombreux différents types de cellules qui agissent de concert pour monter une réponse immunitaire efficace. En contrôlant la localisation spécifique d'un type de cellule immunitaire dans un état donné, les chimiokines sont des pré-requis avant antigènes étrangers peuvent être détectés et neutralisés.
Dans les lymphocytes T en particulier, les chimiokines se lient à des récepteurs spécifiques de surface qui, lors de l'engagement, suscitent de nombreux signaux intracellulaires (élévation du calcium, la phosphorylation de ERK, activation GTPases Rho, augmentation des intégrines affinité et altérations du cytosquelette) qui favorisent motilité des cellules T 2,3. Au niveau cellulaire, on peut observer des altérations morphologiques induites par stimulation de chimiokine.Ces changements dans les formes cellulaires sont particulièrement dramatique dans les cellules T: les cellules T au repos ont une morphologie ronde bourrelet lorsque vous voyagez dans le flux sanguin. Cependant, la détection de la présence de chimiokines dans les sites inflammatoires ou à proximité des organes lymphoïdes va changer la forme des cellules T qui adoptent désormais une «main-miroir» morphologie typique composé d'une forme bipolaire: un bord d'attaque à l'avant et un bord arrière, ou uropode, 4 à l'arrière. En outre, les composants intracellulaires peuvent séparer dans ces deux régions opposées d'une cellule T de polarisation pour maintenir la migration. Par exemple, les filaments d'actine polymérisation augmente lors d'une stimulation de chimiokine 5 actine polymérisée et se accumule à l'avant d'une cellule polarisée T 2. D'autre part, plusieurs protéines telles que les protéines phosphorylées de la famille Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) qui relient la membrane plasmique au cytosquelette d'actine corticale, relocaliser au uropode de polarisationLes cellules T 6. Fait intéressant, nous et d'autres avons montré que ce processus de polarisation est nécessaire pour la migration des cellules T. En effet, un traitement qui interfère avec la polarisation va inhiber la motilité cellulaire. Par exemple, l'inhibition de l'activité des membres de la protéine atypique kinases C (PKC) famille, PKCÇ et PKCι blocs T polarisation de la cellule et le processus de balayage de migration des cellules dendritiques 7. T polarisation cellulaire est également réglementée par GTPases Rho. Nous avons montré que la modulation de l'activité de la protéine RhoA par Fam65b récemment décrit interfère avec les changements de cellules T de la morphologie et de leur capacité à migrer dans un dosage 6 Transwell. Comme polarisation est une étape préalable à la motilité cellulaire, il est donc crucial d'être en mesure de quantifier comme un indicateur principal de réponses de chimiokines. modifications de la forme des cellules ont déjà été mesurés manuellement 8. Cependant, ce type de dosage est très chronophage, de sorte que seuls quelques-uns habituellementdizaines de cellules sont prises en compte.
Ici, une nouvelle méthode est présentée à quantifier rapidement le degré de modifications de forme de lymphocytes T exposés à la chimiokine stimulation. Un flux d'imagerie de cytométrie la technologie (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) est utilisée, qui combine les avantages d'un cytomètre de flux et un microscope neuf pour quantifier efficacement la quantité de cellules polarisées dans différentes conditions de stimulation de chimiokine. En plus de la quantification des altérations morphologiques que l'on peut mesurer robuste avec cette technologie, il est également possible d'évaluer les changements dans la localisation subcellulaire de certaines protéines de chimiokine sur la signalisation.
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Protocol
1. Préparation des lymphocytes T
- Préparer la souris primaire ou cellules T humaines comme décrit 10,11.
- Cultiver les cellules T humaines dans un milieu complet RPMI avec 10% de sérum AB humain à une densité de 2-3 x 10 6 cellules / ml.
NOTE: L'utilisation de sérum de veau foetal (FCS) à la place du sérum humain peuvent induire la polarisation spontanée d'une grande fraction de cellules T humaines en culture. Gardez ces cellules en culture pendant 4-5 jours, et autre processus à tout moment pendant cette période. - Maintenir les cellules T de souris dans du milieu RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS à une densité cellulaire similaire. Utilisez immédiatement ou le lendemain, après une culture O / N à 37 ° C en présence de 10 ng / ml IL7.
- Cultiver la lignée cellulaire T humaine CEM dans RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS.
2. Chemokine Stimulation
- Laver 5 x 10 5 cellules par condition expérimentale en milieu HBSS chaud complété avec 10 mM HEPEs. Pour certaines expériences, co-transfection de cellules T humaines primaires la veille avec 2 pg pmaxGFP et 8 pg pcDNA3.1 + (vecteur vide, contrôle), PKCÇ kinase morts, ou des plasmides PAR6 N-terminaux.
- Reprendre le culot cellulaire dans un milieu HBSS chaud-Hepes (utiliser 0,3 ml x nombre de conditions expérimentales).
- Distribuez les cellules dans 1,5 ml microtubes.
NOTE: En conséquence, un tube correspondant à une seule condition expérimentale contient 5 x 10 5 cellules dans 0,3 ml de milieu HBSS-HEPES. Pour certaines expériences, ajouter 500 nM Latrunculin A ou de véhicule (DMSO) et on incube les cellules pendant 30 min avant la stimulation de chimiokine. - Ajouter 10 à 500 ng / ml CCL19 ou chimiokine CXCL12 dans chaque tube.
NOTE: Nous utilisons habituellement 10-200 chimiokine ng / ml pour les cellules T humaines. Cellules CEM ne expriment pas le récepteur CCR7 qui se lie CCL19. Par conséquent, les cellules CEM ne seront en mesure de répondre à une stimulation de CXCL12. En outre, utiliser des concentrations plus élevées de chimiokines (300-500 ng / ml) pour polariser les cellules T de souris. - Retourner les tubes à plusieurs reprises et les incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 8 à 10 min ou de cellules T primaires ou CEM, respectivement.
- Arrêter le processus de polarisation en ajoutant à chaque tube 0,3 ml d'une solution chaude contenant 2% de paraformaldehyde (PFA) et Hepes 10 mM dans du PBS. Retourner les tubes et les incuber à 37 ° C pendant 5 min.
3. colorations
- Transférer les cellules des microtubes à la cytométrie en flux tubes.
- Remplir les tubes avec une solution complètement RT contenant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,5 mM d'EDTA et 10 mM de Hepes dans du PBS.
- Centrifuger les tubes à 460 g pendant 4 min.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul d'une solution contenant RT 5% de FCS dans du PBS.
- Ajouter 5 ul de FITC-anti-HLA-ABC dans chaque tube, les vortex, et incuber pendant 30 min à température ambiante, à l'abri de la lumière.
- Laver les cellules une fois avec du PBS contenant 5% de FCS, unend fois avec du PBS seulement.
- A RT: ajouter 500 ul de 1% de PFA, incuber pendant 10 min, puis laver les cellules avec une solution contenant 1% de BSA, 0,5 mM d'EDTA et 10 mM de HEPES dans du PBS.
- Jeter le surnageant, complètement remplir les tubes avec une solution de PBS contenant 0,2% de BSA, 0,1% de saponine, 0,5 mM d'EDTA et 10 mM de Hepes (tampon de perméabilisation).
- Laver les cellules deux fois dans ce milieu.
- Retourner les tubes pour éliminer le milieu et Vortex les dissocier le culot cellulaire.
- Ajouter 0,25 ug / ml TRITC-phalloïdine et / ou une dilution 1: 100 d'anticorps anti-P-ERM à chaque tube, les vortex et incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Laver les cellules avec le tampon de perméabilisation. Incuber avec un anticorps secondaire fluorescent si nécessaire.
- Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS et les transférer à des microtubes.
REMARQUE: Les cellules sont prêts pour l'acquisition. Sinon, tout en gardant un volume total maximal de 200 pi par tube, ajouter concentré PFA à une finale 1%concentration afin de préserver les colorations si les cellules ne sont pas à utiliser le même jour pour un traitement ultérieur.
4. Images acquisition et d'analyse
- Allumer l'appareil (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) et laissez-le se calibrer selon les instructions du fabricant.
REMARQUE: Le logiciel INSPIRE été utilisé avec un objectif 40X (0,75 NA). Le logiciel IDEAS 3.0 a été utilisé pour tous les quantifications signalés. - Préparer une série de fenêtres d'acquisition qui peuvent être sauvegardés dans un modèle pour de futures expériences. Dessinez histogrammes qui quantifient les valeurs de gradient de RMS. De la population "In Focus", sélectionnés sur les RMS de l'histogramme gradient, délimiter la population "cellule unique" sur un histogramme de la zone. Une fois que le tube de microcentrifugation a été inséré dans la machine, régler la puissance du laser, porte sur des cellules individuelles et d'acquérir des lymphocytes T 5000.
- Dans les idées molleslogiciel, ouvrez le fichier d'acquisition et de créer un histogramme qui indique la valeur de la valeur RMS de gradient pour les images de champ lumineux (canal 1) obtenu pour chaque cellule individuelle. Dessinez une grille sur le gradient histogramme RMS qui considère cellules présentant RMS valeur gradient ci-dessus 57.
NOTE: Le gradient RMS permet de prendre en compte dans l'analyse uniquement les lymphocytes T qui sont dans le plan focal. Nous avons déterminé de manière empirique que les cellules individuelles présentant une valeur de gradient supérieure à RMS 57 sont dans le plan focal, et peuvent être considérés de façon précise. - Dans le / menu Analyse des Masques, créer un nouveau masque, appelé Erode (M01,2) du masque de la morphologie sur les images en fond clair M01, érodés de 2 pixels. Puis, dans l'Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonctionnalité de la zone, calculé sur le masque Erode (M01,2). A partir des cellules sélectionnées dans la grille précédente, ouvrir un histogramme montrant la zone de cellules à l'aide de ce masque nouvellement créé.
La morphologie des masques qui sont disponibles par: NOTEdéfaut sont beaucoup plus grande que la taille réelle de la cellule. Ainsi, il est plus précis de l'éroder jusqu'à deux pixels. - Dessinez une porte sur les cellules T individuelles, à l'exception des billes de calibration et de débris (petite zone) et les doublets (grande surface). Réglez cette porte à chaque acquisition.
REMARQUE: Les variations de la taille des cellules auront une incidence sur la position de la porte. Comme les cellules T de souris sont plus petites que les cellules T humaines qui sont eux-mêmes plus petites que les cellules CEM, la surface de chaque type de cellule est proportionnelle à sa taille. - Considérant les cellules individuelles, de mise au point qui ont été fermée dans les étapes précédentes, ouvrez une parcelle points constituée de la Raw Max Pixel sur la coloration HLA-ABC (canal 2, axe des x) en fonction de la Raw Max Pixel sur la phalloïdine coloration (Channel 4, axe y). Créer un portail d'exclure les événements fluorescentes non colorées ou saturés. Ouvrez deux histogrammes montrant la Raw Max Pixel pour HLA-ABC (canal 2) et phalloïdine (Channel 4) colorations.
- Dans l'analyse / menu Masques, createa nouveau masque, appelé Erode (M02,2) du masque de la morphologie des cellules HLA-ABC colorées (canal 2), érodés de 2 pixels. Puis, dans l'Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonction consistant en le paramètre de circularité, calculé sur la Erode (M02,2).
NOTE: Ce paramètre mesure la déviation de la forme de la cellule d'un cercle. Par conséquent, une cellule T parfaitement ronde aura une valeur de circularité élevée tandis que les cellules polarisées allongés présentera un indice de circularité bas. - Par la suite, créer un autre histogramme qui rendra compte les valeurs de la fonction de circularité des cellules précédemment gated. Utilisez cet histogramme pour tracer directement la distribution d'un individu, la population cellulaire de mise au point selon la valeur de la circularité de chaque cellule individuelle.
- Au vu de la forme de l'histogramme pour les cellules non stimulées, tracer une grille de cellules polarisées, à partir de la valeur de circularité la plus basse jusqu'à la valeur limite de circularité où la plupart des cellules non stimuléessont tracées. Regardez l'affichage des statistiques pour le pourcentage de cellules polarisées parmi la population fermée (Gated%).
NOTE: Nous avons mis cette porte pour les valeurs de l'indice circularité ci-dessous 13. - Afin de regarder la polarisation de la coloration de l'actine dans les cellules, tracer un histogramme pour la Détail Lumineux valeur similarité R3, comparant la coloration HLA-ABC (canal 2) et la coloration de la phalloïdine (Channel 4).
NOTE: Plus la valeur de cette fonction, plus superpose les deux colorations sont. - En utilisant la même stratégie de déclenchement comme précédemment, tracer une grille sur des cellules non stimulées pour la coloration distinct qui montre le pourcentage de cellules présentant une coloration de l'actine polarisée.
- Une fois terminé, le pourcentage de cellules présentant une ségrégation dans la distribution du CMH de classe I et de colorations phalloïdine, le pourcentage de cellules polarisées ainsi que les valeurs moyennes des indices circularité et la similitude de toutes les cellules ± SD sont présentés dans l'correspStatistiques onding panneaux.
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Representative Results
Le premier exemple choisi ici concerne l'utilisation de lymphocytes T primaires humains stimulés avec CCL19. Cependant, la même stratégie peut être utilisée avec des cellules T de souris primaires, des lignées de cellules T ou tout autre type sensible à la stimulation de chimiokine sur les cellules. La stratégie présentée ici de déclenchement comprend une série de fenêtres qui sélectionnent les événements ciblés, puis les cellules individuelles. Enfin la plage d'intensité de fluorescence est suivie ici à titre d'exemple sur les deux marqueurs: le CMH de classe I HLA-ABC et actine filamenteuse de repos (figure 1) ou CCL19 stimulées (figure 2) les lymphocytes T.
Tout d'abord, l'indice de circularité est mesurée en non traitée (figure 1) ou CCL19 stimulées (figure 2) les lymphocytes T. Le fait que les cellules au repos ont un seul pic majeur avec une valeur d'indice de circularité élevée indique que la plupart des cellules sont proches de compléter. Cependant, il est clair que la stimulation de CCL19 suscite l'apparition ofa seconde sous-population de cellules avec un indice de circularité bas. Cette sous-population comprend des cellules qui ont adopté une morphologie polarisée. En outre, lors de la représentation de l'indice de similarité détaillée lumineux entre HLA-ABC et coloration F-actine, on peut observer que certaines cellules présentent une baisse de la valeur de cet indice par traitement de CCL19, ce qui indique que les deux marqueurs présentent un degré inférieur de co-localisation . Fait intéressant, des dot-parcelles présentées précédemment, on peut positionner le curseur sur ne importe quel point particulier pour obtenir une image de la cellule constituée d'une image en fond clair et une image pour chacun des colorations réalisées. La figure 3 présente donc des exemples de CCL19 stimulés T lymphocytes qui tombent dans la grille de non polarisée (figure 3A) ou (figure 3B) des cellules polarisées. On peut visualiser clairement les différences de morphologie entre les deux sous-populations. D'après les statistiques tableaux ci-dessous les histogrammes circularité de figures 1 2, on peut tracer le pourcentage de cellules qui se situent dans la grille polarisée en l'absence ou en présence de CCL19 (figure 3C). Comme prévu, il est évident que la stimulation de chimiokine augmente le pourcentage de cellules T polarisées (de 11,2% à 50,6%). On peut également tracer l'indice de circularité moyenne de l'ensemble de la population cellulaire obtenue dans les deux conditions (Figure 3D). la stimulation de CCL19 induit une baisse de cet indice. Toutefois, seulement la moitié des cellules sont polarisées, la variation de l'indice de circularité moyenne a été observée lors d'une stimulation de CCL19 est faible.
De même, la figure 4 représente des exemples de cellules CCL19 stimulées, dans lequel à la fois l'allèle HLA-ABC et la F-actine des colorations faire (figure 4A) ou ne pas colocalisent (figure 4B). D'après les statistiques les tableaux ci-dessous Détail vives histogrammes de similarité représentées dans les figures 1 et 2, on peut obtenir la proportionde cellules qui présentent une valeur d'indice inférieure à 1,5, représentant les cellules qui présentent un degré de co-localisation entre HLA-ABC et la F-actine très faible. La figure 4C montre que la fraction de cellules qui tombe dans cette grille augmente lors d'une stimulation de CCL19 ( de 3,4% à 13,9%). Collecte des valeurs de l'indice pour chaque cellule individuelle, on peut aussi tracer le détail brillant indice similarité moyenne de l'ensemble de la population cellulaire obtenue dans les deux conditions (figure 4D). CCL19 induit une baisse de l'indice, cependant, pour les mêmes raisons que précédemment, les variations sont faibles. En regardant les images des cellules correspondantes, il semble que cette baisse de HLA-ABC - F-actine co-localisation est principalement due au regroupement de F-actine dans un pôle de la cellule. En revanche, la distribution subcellulaire de molécules HLA-ABC CMH de classe I ne semble pas être excessivement affectées par la stimulation de CCL19.
Ce est la raison pour laquelle nous avons ensuite décidé de tester davantagela méthodologie en analysant deux marqueurs (F-actine et phospho-ERM) connus pour séparer dans les pôles de cellules de chimiokines T stimulées adverse. Les cellules T humaines stimulées par CXCL12 fortement polarisées, telle que quantifiée sur la figure 5A avec la même stratégie de déclenchement avant que (de 5,95% à 79,10% de cellules polarisées après 8 minutes de stimulation avec 50 ng / mL CXCL12). Dans ces conditions, il ya une forte diminution de la Détail Lumineux indice moyen similarité comme indiqué dans les figures 5B et 5D, ce qui signifie que F-actine et phospho-ERM colocalisent moins après CXCL12 stimulation. Comme prévu, le pourcentage de cellules présentant une ségrégation des marqueurs choisis ici est plus élevé (48%, figure 5C) par rapport à celles précédemment étudiées (14%, Figure 4C). Par conséquent, la baisse de l'indice de similarité moyenne de chaque condition est également plus évidente (figure 5D). Par conséquent, la technique de cytométrie de flux de formation d'image présentée ici est suItableau pour quantifier le degré de co-localisation des deux colorations dans différents contextes.
Enfin, nous avons décidé d'illustrer la mesure dans laquelle la perturbation d'un élément du cytosquelette ou voie de signalisation connu pour affecter des changements dans la morphologie des cellules T lors d'une stimulation de chimiokine, peut être mesuré par cytométrie de flux imagerie. Contrôle cellules T ont d'abord été comparés avec certaines prétraité avec le médicament de l'actine perturbateurs latrunculine A (figure 6A). Les cellules ont été stimulées avec CXCL12, colorées avec de la phalloïdine fluorescente et analysées par cytométrie en flux imagerie. Histogrammes montrant l'intensité Raw Max Pixel de la coloration F-actine sont présentés pour les deux populations cellulaires (figure 6A, en haut). Comme attendu à partir de l'activité de sectionnement latrunculine A en direction de filaments d'actine, l'intensité de la coloration de la phalloïdine est plus faible dans ces cellules (panneau de droite) par rapport à contrôler les lymphocytes T traités avec le véhicule DMSO (panneau de gauche). En outre, la latrunculine A-trcellules T auffee présentent un indice de circularité plus grande indiquant qu'ils restent plus rond que les cellules de contrôle (figure 6A, en bas). Ceci peut être quantifié par une porte située sur les histogrammes pour mesurer le pourcentage de cellules qui présentent des modifications morphologiques. Bien que 32% des cellules de contrôle obtenir polarisée dans cet état, seulement 10% des latrunculine Un -Traité lymphocytes T présentent pas de changements de forme (figure 6B). Par conséquent, il est montré ici que le flux d'imagerie de cytométrie technologie est adaptée pour mesurer les différences dans les modifications morphologiques quand on étudie l'effet potentiel de certains éléments du cytosquelette dans ce phénomène.
D'autre part, l'acquisition d'un grand nombre de cellules avec ce procédé se ouvre également la possibilité d'analyser rapidement des petits sous-ensembles de cellules présentes comme une minorité. Sur la figure 7, un exemple est présenté où l'analyse est limitée, en particulier le comportement des cellules T co-transfectered avec la GFP avec des plasmides codant pour des mutants négatifs dominants du complexe de polarité PAR6 / PKC. L'histogramme correspondant aux cellules non transfectées nous a permis de porte spécifiquement sur la GFP pertinentes + cellules T (figure 7A, gauche). L'intensité de la GFP mesurée sous forme d'histogrammes qui quantifient la distribution de l'intensité de fluorescence du canal 2 montre en effet que seule une petite fraction de l'ensemble de la population cellulaire a été transfectée (figure 7A). Le degré de polarisation de ces morphologique des cellules transfectées a ensuite été quantifiée en mesurant seulement l'indice de circularité des cellules GFP + (figure 7B). Une grille supplémentaire pour les cellules T présentant de faibles valeurs de circularité a permis l'estimation du pourcentage de cellules polarisées dans chaque état (figure 7C). Les résultats montrent que la perturbation de la fonction de la voie de signalisation PAR6 / PKC inhibe polarizati de cellules Tsur induite par les deux chimiokines CCL19 et CXCL12, en ligne avec nos résultats antérieurs 7.
Figure 1. représentatifs des résultats non stimulées coloration sur les cellules T humaines primaires. Le panneau supérieur gauche montre la répartition de l'histogramme de la Gradient RMS calculée avec le masque M01 sur les images de champ lumineux (canal 1). Le panneau supérieur droit montre la zone du masque M01 érodée de deux pixels, sur la base des images en fond clair (canal 1) des cellules In Focus gated de la parcelle précédente. Les panneaux du milieu montrent les valeurs Raw Max Pixel des deux colorations HLA-ABC et phalloïdine (canaux 2 et 4, respectivement) soit comme un tracé de points (panneau de gauche) ou que les histogrammes (milieu et panneaux de droite) pour l'individu, y concentrer cellules sélectionnées à l'étape précédente. De cette population de cellules individuelles, de mise au point avec coloration correcte, est calculée la fonction de circularité sur le masque M02 érodée de deux pixels de la coloration HLA-ABC (panneau inférieur gauche) et le détail brillant fonction similarité R3 (panneau en bas à droite) montrant le degré de similitude entre le HLA-ABC et les colorations phalloïdine . Pour ces deux dernières parcelles, statistiques indiquant la répartition de la population (% fermée, moyenne de la fonction, SD) sont indiquées dans un tableau ci-dessous. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Représentatifs des résultats de coloration sur les cellules T humaines primaires stimulées avec 200 CCL19 ng / ml pendant 8 min La stratégie d'agencement du panneau et de déclenchement sont identiques à la figure 1.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Quantification de l'état morphologique des lymphocytes T stimulés par CCL19. (A, B) Des exemples de cellules de la figure 2 à l'extérieur ou dans la porte "polarisée", respectivement (C) Histogramme montrant le pourcentage de cellules T polarisées obtenus en l'absence de CCL19. (Figure 1, -) ou avec 200 ng / ml CCL19 (figure 2, +) (D) Histogramme représentant les valeurs moyennes de l'indice de circularité ± SE dans l'individu, de la population de cellules de mise au point en l'absence. (-) ou en présence (+) de CCL19. *** P <0,001. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Quantification du degré de co-localisation entre le HLA-ABC et colorations de phalloïdine. (A, B) Des exemples de cellules de la figure 2 à l'extérieur ou à la porte "pas colocalisés" du Détail Lumineux similarité de l'histogramme, respectivement. (C) histogramme montrant le pourcentage de cellules T ne présentant pas de co-localisation entre les deux marqueurs dans ONU- stimulées (-). ou des conditions de CCL19 stimulées (+) (D) Histogramme représentant les valeurs moyennes de l'indice de similarité ± SE dans l'individu, la population de cellules de mise au point en l'absence (-) ou en présence (+) de CCL19. *** P <0,001. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 5. Analyse de la F-actine - phospho-ERM exclusion CXCL12 sur la stimulation des cellules T primaires humains. (A) Pourcentage de cellules T polarisées en l'absence ou en présence de CXCL12 (10 ou 50 ng / ml). (B) l'écoulement d'imagerie par cytométrie histogrammes montrant la répartition de l'individu, de la population de mise au point cellule selon l'Detail lumineux indice de similarité qui compare la mesure de la co-localisation entre les phospho-phalloïdine colorations GRE et, en l'absence de CXCL12 ou avec 10 ng / ml ou 50 ng / ml CXCL12. (C) La quantification de la proportion de cellules ne présentant pas de co-localisation de Perm et les colorations de phalloïdine dans les cellules T (D) Quantification des valeurs moyennes de l'indice de similarité ± SE dans chaque état stimulées ou non avec CXCL12.. *** P <0,001.télécharger / 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Effet de la polymérisation de l'actine dans des cellules T de polarisation. (A) F-actine intensité de coloration (panneaux supérieurs) et Circularité (panneaux inférieurs) des lymphocytes T humains primaires traités avec Latrunculin A (500 nM, 30 min) ou du DMSO et ensuite stimulées avec 100 ng / ml CXCL12 pendant 8 min. ( B) histogramme montrant le pourcentage de cellules T polarisées traités avec du DMSO ou Latrunculin A après 8 minutes de stimulation avec CXCL12. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Expression du mutant de kinase-dead PKCÇ ou le mutant N-terminale de T blocs PAR6 polarisation cellulaire après traitement CCL19 ou CXCL12. (A) l'écoulement d'imagerie par cytométrie histogrammes montrant l'intensité de l'expression de GFP dans les cellules non transfectées T primaires ou des cellules T primaires co-transfectées avec la GFP et un vecteur vide (témoin) ou le mutant de kinase-dead de PKC ou la N-terminaux une partie de PAR6 (B) l'écoulement d'imagerie par cytométrie histogrammes représentant l'indice de circularité de la population de cellules GFP-positives exprimant les différentes constructions au niveau basal (NS: pas de stimulation). ou après CCL19 ou de stimulation de CXCL12 (100 ng / ml pour 8 min ). (C) Quantification du pourcentage de cellules T morphologiquement polarisées exprimant les différentes constructions au niveau basal ou après CCL19 ou CXCL12 stimulation. Se il vous plaît, cliquez ici pour afficher un plus grand version de ce chiffre.
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Discussion
Grâce à une technologie récente des flux d'imagerie de cytométrie une stratégie rapide et informative déclenchement d'analyser des événements cellulaires et moléculaires induits par la stimulation de la chimiokine est présenté. A partir d'une seule expérience, on peut obtenir deux types d'informations: les changements dans la morphologie cellulaire induites par stimulation de la chimiokine et la distribution subcellulaire de protéines différentes pendant le processus de polarisation. Fait intéressant, la preuve est également prévu la possibilité d'analyser un grand nombre de cellules, ce qui permet robustesse statistique et des analyses pertinentes d'une petite fraction de l'ensemble de la population de cellules. Comme indiqué, cette technique peut également être utilisée pour analyser les événements moléculaires de redistribution dans le cadre de la synapse immunologique 12. En outre, un ensemble similaire jusqu'à a déjà été utilisé pour les cellules T stimulées sdf1 mais aucune analyse du degré de co-localisation entre deux marqueurs a été fournie 13.
Bien queCette technique peut donc être adapté à de nombreux types de cellules, les cellules adhérentes ne peuvent pas être directement analysées et des cellules en suspension doivent être fixées avant l'acquisition. En plus de ces limitations intrinsèques de la machine, il est essentiel de maintenir les cellules à 37 ° C lorsque les stimuler. La température est en effet essentiel pour obtenir une polarisation correcte des cellules T depuis les changements cytosquelettiques, telles que la polymérisation de l'actine qui entraîne des changements de forme, sont très dépendants de la température. Nos expériences avec des cellules traitées latrunculine A confirment que le remodelage de l'actine induite par une stimulation appropriée de chimiokine est en effet crucial pour une cellule atteigne son état entièrement polarisée. En plus des données fournies ici avec ce médicament, nous avons également testé la technique de cytométrie de flux de formation d'image avec des lymphocytes T primaires humains transfectés avec des protéines mutantes qui inhibent la voie de signalisation PAR6 / PKC. En cohérence avec nos résultats publiés antérieurement 7, il est montré ici que cette polarité complexe favors T polarisation de la cellule.
Lors de la stimulation de chimiokine, les cellules T perdent leur morphologie ronde pour adopter une forme polarisée. Nous avons trouvé le paramètre de circularité d'être le plus précis pour quantifier ces altérations morphologiques. Cependant, d'autres paramètres décrivant les changements de forme sont proposés par le logiciel d'analyse, tels que le ratio d'aspect ou l'Elongatedness. Par conséquent, on peut facilement tester la contribution d'une voie de signalisation particulière ou une protéine spécifique dans ce processus.
Dans cette étude, nous avons toujours observé que le pourcentage de cellules présentant une polarisation morphologique est plus élevé que celui de la polarisation moléculaire. Ceci indique qu'une fraction des cellules qui adoptent une modification de la morphologie ne présentent pas de grandes redistributions moléculaires des marqueurs étudiés. Cela pourrait provenir du fait que certaines cellules perdent leur forme ronde, de sorte qu'ils présentent un indice de circularité inférieure même se ils ne montrent pas clairement un leading bord et un uropode. Ces cellules T partiellement polarisée pourraient encore tomber à la porte des cellules T morphologiquement polarisées sans présenter redistributions moléculaires évidentes de marqueurs typiques. En outre, les différences dans le seuil de signalisation de chimiokine qui pourraient être plus élevés pour les marqueurs de redistribution que pour des modifications de forme pourrait également expliquer ces différences.
Il est également montré ici que le marqueur HLA-ABC est pas relocaliser dans les cellules T polarisées et il n'y a pas de changement dans l'intensité de cette coloration lors de la stimulation de CCL19. Inversement, une confirmation est fournie ici que la F-actine coloration augmente lors du traitement de CCL19 (figures 1 et 2) comme déjà connu, depuis la stimulation de chimiokine active 5 polymérisation de l'actine. En outre, il est démontré que les filaments d'actine se relocaliser à l'avant des cellules polarisées. Par conséquent, l'indice de similarité Détail brillant qui mesure l'ampleur de la co-localisation entre les deux markers tend à diminuer lors de la stimulation de CCL19. A titre de comparaison, une telle analyse est prévu ici pour le degré de F-actine co-localisation avec des protéines phospho-GRE qui se exclu de la face avant de la cellule. Le pourcentage de cellules T stimulées par des chimiokines présentant la F-actine - CMH de classe I ségrégation est beaucoup plus faible que celui de la F-actine - phospho-MCE (14% contre 48%, respectivement) depuis relocalise F-actine à l'avant et protéines phospho-ERM à l'arrière des cellules T polarisées, alors que la répartition des molécules du CMH de classe I ne est pas affecté par la stimulation de chimiokine. Ce détail brillant indice de similarité peut donc être systématiquement utilisé pour comparer la distribution des deux marqueurs dans les cellules T polarisées. Par conséquent, cette technique est très approprié pour quantifier le degré de co-localisation ou co-exclusion de deux marqueurs différents sur un grand nombre de cellules ou, éventuellement, sur des événements rares présentes dans une population de cellules de large.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs remercient grandement Pierre Bourdoncle, Thomas et Louise Guilbert Rimbault du Fonds Cochin Imaging. Ce travail a été soutenu par l'Inserm, le CNRS et la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
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