Abstract
As células respondem a quimioquinas estimulação por perder a sua forma redonda num processo chamado de polarização, e alterando a localização subcelular de muitas proteínas. Técnicas de imagem clássicos têm sido usados para estudar esses fenômenos. No entanto, eles requerida a aquisição Manual de muitas células seguido de quantificação demorado da morfologia e a co-localização da coloração de dezenas de células. Aqui, um método rápido e eficaz é descrito para estudar estes fenómenos em amostras que consistem em vários milhares de células, utilizando um fluxo de imagens de citometria tecnologia que combina as vantagens de um microscópio com as de um citómetro. Usando os linfócitos T estimulados com CCL19 e coloração para moléculas de MHC de Classe I e a actina filamentosa, uma estratégia de propagação é apresentada para medir simultaneamente o grau de alterações de forma e a dimensão da co-localização de marcadores que são afectadas pela sinalização CCL19. Além disso, esta estratégia gating nos permitiu observoe a segregação de actina filamentosa (na frente) e fosforilada proteínas Ezrin-radixina-moesin (fosfo-ERM) (na parte traseira) em células T polarizadas após a estimulação CXCL12. Esta técnica também foi útil para observar o efeito de bloqueio em polarização de dois elementos diferentes: a inibição da polimerização da actina por um inibidor farmacológico e expressão de mutantes do Par6 / atípica via de sinalização PKC. Assim, a prova é mostrado que esta técnica é útil para analisar as duas alterações morfológicas e redistribuições de proteína.
Introduction
As quimiocinas são proteínas solúveis pequenos que atraem as células para locais especializados 1. Portanto, eles participam do posicionamento correto de células em tecidos, uma função crucial no desenvolvimento e fisiologia. O sistema imunológico não é excepção a esta regra, uma vez que conta com a ação de muitos tipos diferentes de células que agem em conjunto para montar uma resposta imune eficaz. Ao controlar o local específico de um tipo de célula imune em um determinado estado, as quimiocinas são pré-requerida antes de antigénios estranhos pode ser detectada e neutralizada.
Para os linfócitos T, em particular, as quimiocinas se ligam a receptores específicos da superfície que, mediante acoplamento, provocam diversos sinais intracelulares (subida de cálcio, de fosforilação de ERK, activação as Rho GTPases, aumento da afinidade e integrinas alterações do citoesqueleto), que favorecem a motilidade de células T 2,3. Ao nível celular, pode-se observar alterações morfológicas induzidas por estimulação de quimiocinas.Essas mudanças nas formas celulares são especialmente dramática nas células T: células T em repouso têm uma morfologia Conta redonda semelhante ao viajar na corrente sanguínea. No entanto, a detecção da presença de quimiocinas em locais inflamatórios ou na proximidade dos órgãos linfóides vai alterar a forma das células T, que agora adoptar um típico "mão-espelho" morfologia que consiste de uma forma bipolar: um bordo de ataque na frente e um bordo de fuga, ou uropod, na parte de trás 4. Além disso, os componentes intracelulares pode separar em duas regiões opostas de uma célula T polarizada para sustentar a migração. Por exemplo, aumentos de filamentos de actina mediante polimerização de quimiocina estimulação 5 actina polimerizada e acumula-se na parte da frente de uma célula T polarizada 2. Por outro lado, diversas proteínas, tais como proteínas fosforiladas da família Ezrin-radixina-moesina (ERM) que ligam a membrana plasmática para o citoesqueleto de actina F cortical, re-localizar no uropod de polarizadaAs células T 6. Curiosamente, e outros mostraram que este processo de polarização é necessária para a migração de células T. Com efeito, qualquer tratamento que interfere com polarização irá inibir a motilidade celular. Por exemplo, a inibição da actividade dos membros da proteína atípica quinases C (PKC) da família, e PKCζ PKCι blocos t polarização celular e seu processo de digitalização migratório das células dendríticas 7. T polarização celular também é regulada por GTPases Rho. Mostrámos que a modulação da actividade da proteína RhoA por Fam65b recentemente descrito interfere com mudanças na morfologia das células T e a sua capacidade para migrar em um ensaio Transwell 6. Como polarização é um passo de pré-requisito para a motilidade celular, é, portanto, essencial para ser capaz de quantificar, como um visor principal de respostas de quimiocina. Alterações forma da célula foram previamente avaliados manualmente 8. No entanto, este tipo de quantificação é muito demorado, de modo que normalmente apenas algunsdezenas de células são tomadas em consideração.
Aqui, um novo método é apresentado para quantificar rapidamente o grau de alterações de forma dos linfócitos T expostos ao estímulo de quimiocina. Um fluxo de citometria de tecnologia de imagem (ver Tabela de Reagentes Específico / Equipamento) é utilizada, a qual combina as vantagens de um citómetro de fluxo e um microscópio 9 para quantificar eficazmente a quantidade de células polarizadas em diferentes condições de estimulação de quimiocina. Para além da quantificação das alterações morfológicas que se pode medir de forma robusta com esta tecnologia, é também possível avaliar as alterações na localização subcelular de algumas proteínas mediante a sinalização da quimiocina.
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Protocol
1. Preparação de Linfócitos T
- Prepare primário do rato ou células T humanas, como descrito 10,11.
- Cultivar células T humanas em meio RPMI completo com 10% de soro humano AB a uma densidade de 2 - 3 x 10 6 células / ml.
NOTA: A utilização de soro fetal de vitelo (FCS) em vez de soro humano podem induzir a polarização espontânea de uma grande fracção de células T humanas em cultura. Manter essas células em cultura por 4-5 dias, e outro processo-los a qualquer momento durante esse período. - Manter as células T de rato em meio RPMI completo enriquecido com 10% de FCS a uma densidade celular semelhante. Utilizar imediatamente ou no dia seguinte, depois de uma cultura D / N a 37 ° C na presença de 10 ng / ml IL7.
- Cultivar a linha de células T humanas CEM em meio RPMI completo enriquecido com 10% de FCS.
2. Chemokine Estimulação
- Lave 5 x 10 5 células por condição experimental em meio morno HBSS suplementado com 10 mM Hepes. Para algumas experiências, a co-transfecção de células T humanas primárias no dia anterior com 2 ug pmaxGFP e 8 ug pcDNA3.1 + (vector vazio, o controlo), PKCζ cinase morta, ou plasmídeos Par6 N-terminais.
- Ressuspender o sedimento de células em meio HBSS morno-Hepes (0,3 ml usar x número de condições experimentais).
- Distribuir as células em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Portanto, um tubo que corresponde a uma condição experimental único irá conter 5 x 10 5 células em 0,3 mL de meio HBSS-Hepes. Para algumas experiências, adicionar 500 nM Latrunculin A ou veículo (DMSO) e incubar as células durante 30 minutos antes da estimulação de quimiocina. - Adiciona-se 10 a 500 ng / ml ou CCL19 quimiocina CXCL12 em cada tubo.
NOTA: Normalmente, usamos 10-200 quimocina ng / ml para células T humanas. As células CEM não expressam o receptor CCR7 que se liga CCL19. Portanto, células CEM apenas será capaz de responder a um estímulo CXCL12. Além disso, usar concentrações mais elevadas de quimiocinas (300-500 ng / ml) para polarizar as células T do mouse. - Virar os tubos várias vezes e incubar num banho de água a 37 C para 8 ° ou 10 min para as células T primárias ou CEM, respectivamente.
- Parar o processo de polarização através da adição a cada tubo 0,3 ml de uma solução quente contendo 2% de paraformaldeído (PFA) e Hepes 10 mM em PBS. Virar os tubos e incubá-las a 37 ° C durante 5 min.
3. colorações
- Transferem-se as células a partir dos tubos de microcentrífuga para tubos de citometria de fluxo.
- Encher os tubos com uma solução completamente RT contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), EDTA 0,5 mM e Hepes 10 mM em PBS.
- Centrifugar os tubos a 460 xg por 4 min.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 ul de uma solução contendo RT 5% de FCS em PBS.
- Adicionar 5 uL de FITC-anti-HLA-ABC, em cada tubo, eles vórtice, e incubar durante 30 min à temperatura ambiente, longe da luz.
- Lave as células uma vez com PBS contendo 5% de FCS, umnd uma vez com apenas PBS.
- À RT: adicionar 500 uL de 1% de PFA, incubar durante 10 min, em seguida, lavar as células com uma solução contendo 1% de BSA, EDTA 0,5 mM e HEPES 10 mM em PBS.
- Rejeitar o sobrenadante, preencher completamente os tubos com uma solução de PBS contendo 0,2% de BSA, 0,1% de saponina, EDTA 0,5 mM e Hepes 10 mM (tampão de permeabilização).
- Lavar as células duas vezes neste meio.
- Virar os tubos para remover o meio e vortex-los para dissociar o sedimento celular.
- Adicionar 0,25 g / ml TRITC-faloidina e / ou uma diluição 1: 100 de anticorpo anti-P-MTC a cada tubo, eles vórtice e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lavar as células com o tampão de permeabilização. Incubar com anticorpo secundário fluorescente, se necessário.
- Ressuspender as células em 200 ul de PBS e transferi-las para tubos de microcentrífuga.
NOTA: As células estão prontos para a aquisição. Alternativamente, ao mesmo tempo mantendo um volume máximo total de 200 ul por tubo, adicionar PFA concentrada para um final de 1%concentração, a fim de preservar as colorações se as células não estão a ser usados no mesmo dia para processamento adicional.
4. Imagens de Aquisição e Análise
- Ligue o aparelho (ver Tabela de Specific Reagentes / Equipment) e deixá-lo calibrar-se de acordo com as instruções do fabricante.
NOTA: O software INSPIRE foi usado com uma objetiva de 40X (0,75 NA). O software IDEIAS 3.0 foi utilizado para todas as quantificações relatados. - Preparar uma série de janelas de aquisição que podem ser salvos em um modelo para futuras experiências. Empate histogramas que quantifiquem os valores de gradiente RMS. Da população "In Focus", selecionado no RMS histograma degradê, delimitar a população "célula Single" em um histograma da Area. Uma vez que o tubo de microcentrifugadora foi inserido na máquina, ajustar a potência do laser, portão em células individuais e adquirir 5.000 linfócitos T.
- Nos Idéias suavesware, abra o arquivo de aquisição e criar um histograma que irá mostrar o valor do valor RMS gradiente de campo para imagens brilhantes (Canal 1) obtidos para cada célula individual. Desenhe um portão no histograma gradiente RMS que considera células exibindo RMS valor inclinação acima de 57.
NOTA: O gradiente RMS permite ter em conta na análise apenas os linfócitos T que se encontram no plano focal. Determinou-se empiricamente que as células individuais que exibem um valor de gradiente de RMS são superiores a 57 no plano focal, e pode ser considerado com precisão. - No menu Análise / Máscaras, criar uma nova máscara, chamado Erode (M01,2) da máscara de morfologia nas imagens brightfield M01, erodidas de 2 pixels. Em seguida, na Análise / menu Recursos, crie um novo recurso do Espaço, calculado sobre a máscara Erode (M01,2). A partir das células selecionadas na porta anterior, abra um histograma mostrando a área de células usando essa máscara recém-criado.
Máscaras a morfologia que estão disponíveis por: NOTAdefault são muito maiores do que o tamanho real da célula. Assim, é mais preciso que a corroer-se a 2 pixels. - Desenhe um portão nas células T individuais, excluindo as contas de calibração e detritos (pequena área) e as dobletos (grande área). Ajuste este portão em cada aquisição.
NOTA: As variações no tamanho das células irá afectar a posição da porta. Como células T de rato são menores do que as células T humanas que são eles próprios menores que as células CEM, a área de cada tipo de célula será proporcional ao seu tamanho. - Considerando-se as células, em foco individuais que foram fechados com os passos anteriores, abrir um gráfico de pontos que consiste em bruto o pixel máximo na coloração de HLA-ABC (canal 2, o eixo x) em função do pixel em bruto Max a faloidina coloração (Channel 4, o eixo y). Criar um portão para excluir os eventos fluorescentes não coradas ou saturadas. Abra duas histogramas mostram a Raw Max Pixel para HLA-ABC (Canal 2) e phalloidin (Channel 4) colorações.
- Na Análise / menu de Máscaras, createA nova máscara, chamado Erode (M02,2) da máscara morfologia das células HLA-ABC coradas (Canal 2), erodidas de 2 pixels. Em seguida, na Análise / menu Funções, criar uma nova característica que consiste no parâmetro circularidade, calculado sobre o Corrmoa (M02,2).
NOTA: Este parâmetro mede o desvio da forma da célula a partir de um círculo. Portanto, uma célula T perfeitamente redonda terá um valor alto circularidade enquanto que as células polarizadas alongadas irá apresentar um baixo índice de circularidade. - Subsequentemente, criar um outro histograma que irá reportar os valores da característica circularidade das células previamente fechadas. Utilizar esta histograma para traçar directamente a distribuição de um indivíduo, a população de células em foco de acordo com o valor da circularidade para cada célula individual.
- Olhando para o formato do histograma para células não estimuladas, para desenhar um portão células polarizadas, começando no valor circularidade mais baixo até ao valor limite circularidade onde a maioria das células não estimuladassão traçados. Olhe para a exibição de estatísticas para a percentagem de células polarizadas entre a população fechado (% fechado).
NOTA: Criámos esta porta para valores de índice Circularidade abaixo 13. - De forma a olhar para a polarização da coloração de actina nas células, para traçar um histograma do detalhe brilhante valor Similaridade R3, comparando a coloração de HLA-ABC (canal 2) e a coloração com faloidina (Canal 4).
NOTA: Quanto maior o valor desse recurso, o mais sobrepor as duas colorações são. - Utilizando a mesma estratégia gating como antes, traçar uma porta em que as células não-estimuladas para a coloração segregada que mostra a percentagem de células com coloração de actina polarizada.
- Quando concluída, a percentagem de células que manifestam uma segregação na distribuição do MHC de Classe I e colorações faloidina, a percentagem de células polarizadas em conjunto com os valores médios dos índices Circularidade e similaridade de todas as células ± desvio padrão são mostrados na correspEstatísticas onding painéis.
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Representative Results
O primeiro exemplo aqui escolhido se refere à utilização de linfócitos T primárias humanas estimuladas com CCL19. No entanto, a mesma estratégia pode ser usada com células T de rato primário, linhas de células T ou qualquer outro tipo de células responsivas à estimulação da quimiocina. A estratégia de gating aqui apresentado inclui uma série de janelas que selecionam os eventos temáticos, em seguida, as células individuais. Finalmente, o intervalo de intensidade de fluorescência é seguido aqui como um exemplo de dois marcadores: o MHC de classe I HLA-ABC e actina filamentosa de repouso (Figura 1) ou estimulada por CCL19 (Figura 2) linfócitos T.
Em primeiro lugar, o índice de circularidade é medida em não tratadas (Figura 1) ou estimulada por CCL19 (Figura 2) linfócitos T. O fato de que as células em repouso tem um grande pico único com um valor alto índice de circularidade indica que a maioria das células estão perto de completar. No entanto, é evidente que a estimulação CCL19 provoca o aparecimentofa segunda subpopulação de células com um baixo índice de circularidade. Esta subpopulação engloba células que adotaram uma morfologia polarizada. Além disso, quando representando o índice de Similaridade Detalhe brilhante entre HLA-ABC e coloração de F-actina, pode-se observar que algumas células apresentam uma queda no valor deste índice após tratamento CCL19, indicando que ambos os marcadores indicam um grau baixo de co-localização . Curiosamente, a partir dos pontos de parcelas apresentada anteriormente, pode-se posicionar o cursor em qualquer ponto particular, para obter uma imagem da célula que consiste de uma imagem de campo claro e uma imagem para cada uma das colorações realizadas. A Figura 3 apresenta, portanto, exemplos de CCL19 T estimulada linfócitos que caem na porta de não polarizada (Figura 3A) ou células polarizadas (Figura 3B). Pode-se visualizar claramente as diferenças morfológicas entre ambas as subpopulações. A partir das estatísticas tabelas abaixo os histogramas Circularidade de Figuras 1 2, pode-se representar graficamente a percentagem de células que caem na porta polarizada na ausência ou na presença de CCL19 (Figura 3C). Como esperado, é claro que aumenta a estimulação de quimiocina a percentagem de células T polarizadas (de 11,2% para 50,6%). Pode-se também representar graficamente o índice de circularidade da média da população celular total obtido em ambas as condições (Figura 3D). Estimulação CCL19 provoca uma queda no índice. No entanto, uma vez que apenas metade das células são polarizados, a alteração no índice de circularidade significativo observado após estimulação CCL19 é pequena.
Da mesma forma, a Figura 4 representa exemplos de células estimuladas com CCL19, em que ambos os alelos HLA-ABC e a F-actina colorações fazer (Figura 4A) ou não colocalize (Figura 4B). A partir das estatísticas tabelas abaixo os histogramas similaridade Detalhe brilhantes mostrados nas Figuras 1 e 2, pode-se obter a proporçãode células que exibem um valor de índice inferior a 1,5, o que representa as células que exibem um grau muito baixo de co-localização entre o HLA-ABC e F-actina. A figura 4C mostra que a fracção de células que cai nesta porta aumenta após estimulação CCL19 ( de 3,4% para 13,9%). Coletando os valores do índice para cada célula individual, também se pode traçar a Detalhe brilhante média do índice de Similaridade da população de células inteiras obtidas em ambas as condições (Figura 4D). CCL19 provoca uma queda no índice, no entanto, pelas mesmas razões, como anteriormente, as mudanças são pequenos. Ao olhar para as imagens das células correspondentes, verifica-se que esta queda de HLA-ABC - F-actina de co-localização é devido principalmente ao agrupamento de F-actina em um pólo da célula. Por outro lado, a distribuição subcelular de moléculas HLA-ABC MHC de Classe I não parece ser grandemente afectada por estimulação CCL19.
Essa é a razão pela qual nós próxima decidiu testar ainda maisa metodologia através da análise de dois marcadores (F-actina e fosfo-ERM) conhecidos para segregar em pólos de células estimuladas com quimiocinas T adversária. As células T humanas estimuladas com CXCL12 fortemente polarizados, como quantificado na Figura 5A, com a mesma estratégia de propagação do que antes (a partir de 5,95% para 79,10% de células polarizadas após 8 minutos de estimulação com 50 ng / mL CXCL12). Nestas condições, há uma forte diminuição do detalhe brilhante índice de Similaridade significativo, como mostrado nas Figuras 5B e 5D, o que significa que a F-actina e fosfo-MTC colocalize menos após estimulação CXCL12. Como esperado, a percentagem de células que exibem uma segregação dos marcadores escolhidos aqui é mais elevada (48%, Figura 5C) em comparação com os previamente estudados (14%, Figura 4C). Por conseguinte, a queda do valor médio do índice de Similaridade de cada condição também é mais evidente (Figura 5D). Portanto, a técnica de citometria de fluxo de imagem apresentada aqui é suITable para quantificar o grau de co-localização de duas colorações em diferentes configurações.
Finalmente, decidimos ilustrar em que medida a perturbação de algum elemento do citoesqueleto ou via de sinalização conhecido para afectar alterações na morfologia das células T após estimulação de quimiocina, pode ser medida por imagem de citometria de fluxo. As células T de controlo foram comparados com alguns primeiro pré-tratadas com a droga de desregulação actina latrunculin A (Figura 6A). As células foram estimuladas com CXCL12, coradas com faloidina fluorescente e analisadas por citometria de fluxo imagiologia. Os histogramas mostram a intensidade de pixel máximo bruto da coloração de F-actina estão apresentados para ambas as populações de células (Figura 6A, topo). Como esperado a partir da actividade de ruptura de latrunculin A em direcção a filamentos de actina, a intensidade da coloração com faloidina é menor nessas células (painel direito) em comparação com o controle linfócitos T tratadas com o veículo DMSO (painel da esquerda). Além disso, Latrunculin A-trAs células T eated apresentam um índice de circularidade maior indicando que eles permaneçam mais redondo do que células controle (Figura 6A, parte inferior). Isto pode ser quantificado por uma porta definida nos histogramas para medir a percentagem de células que exibem alterações morfológicas. Apesar de 32% das células de controlo ficar polarizada nesta condição, apenas 10% dos latrunculin A tenha sido tratada com linfócitos T apresentam quaisquer alterações de forma (Figura 6B). Portanto, mostra-se aqui que o fluxo de imagem citometria tecnologia é apropriada para medir diferenças de modificações morfológicas quando se estuda o efeito potencial de alguns elementos do citoesqueleto neste fenômeno.
Em segundo lugar, a aquisição de um grande número de células com este método também abre a possibilidade de analisar rapidamente pequenos subconjuntos de células presentes como uma minoria. Na Figura 7, um exemplo é apresentado onde a análise é especificamente restrita para o comportamento de células T de co-transfecçãoed com GFP juntamente com plasmídeos que codificam para mutantes negativos dominantes do complexo polaridade Par6 / PKCζ. O histograma correspondente para que as células não transfectadas permitiu-nos especificamente sobre o portão células T (Figura 7A, esquerda) GFP + relevante. A intensidade de GFP medidos como histogramas que quantificam a distribuição da intensidade de fluorescência do canal 2 de facto mostra que apenas uma pequena fracção da população de células inteiras foi transfectada (Figura 7A). O grau de polarização da morfologia de células transfectadas foi então quantificada medindo apenas o índice de circularidade das células GFP + (Figura 7B). Uma porta adicional para as células T que apresentam baixos valores de circularidade permitiu a estimativa da percentagem de células polarizadas em cada condição (Figura 7C). Os resultados mostram que a ruptura da função da via de sinalização Par6 / PKCζ inibida polarizati células Tem induzida por ambos os CCL19 e CXCL12 quimiocinas, em linha com nossas descobertas anteriores 7.
Figura 1. Os resultados de coloração não estimuladas representativos sobre as células T humanas primárias. O painel superior esquerdo mostra a repartição histograma da Gradiente RMS calculada com a máscara M01 nas imagens de campo claro (Canal 1). O painel superior direito mostra a área da máscara M01 corroído de 2 pixels, com base nas imagens de campo claro (Canal 1) das células Em Foco fechado a partir da trama anterior. Os painéis mostram os valores médios Raw Max Pixel de ambas as colorações HLA-ABC e phalloidin (canal 2 e 4, respectivamente) seja como um gráfico de pontos (painel esquerdo), ou como histogramas (meio e painéis à direita) para o indivíduo, in- concentrar as células seleccionadas no passo anterior. A partir desta população de células individuais em foco com coloração correta, é calculado o recurso Circularity sobre a máscara M02 corroído de 2 pixels da coloração HLA-ABC (painel inferior esquerdo) e Detalhe brilhante característica Similarity R3 (painel inferior direito) que mostra o grau de semelhança entre o HLA-ABC e as colorações phalloidin . Para estas duas últimas parcelas, estatísticas que indicam a repartição da população (% fechado, com média de o recurso, SD) são indicadas em uma tabela abaixo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Os resultados da coloração representativos em células T humanas primárias estimuladas com 200 ng CCL19 / ml, durante 8 min A estratégia layout do painel e de propagação são idênticas à Figura 1.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação do estado morfológico de linfócitos T estimulados por CCL19. (A, B) Exemplos de células da Figura 2 no exterior ou no portão "polarizado", respectivamente (C) Histograma mostrando a percentagem de células T polarizadas obtidos na ausência de CCL19. (Figura 1, -) ou com 200 ng / ml CCL19 (Figura 2, +) (D) histograma representando os valores médios do índice de circularidade ± SE no indivíduo, a população de células em foco na ausência. (-) ou na presença (+) de CCL19. *** P <0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A quantificação do grau de co-localização entre o HLA-ABC e colorações faloidina. (A, B) Exemplos de células da Figura 2 no exterior ou no porta "não colocalized" a partir do histograma de Similaridade brilhante detalhe, respectivamente. (C) Histograma mostrando a percentagem de células T que exibem nenhum co-localização entre ambos os marcadores em un- estimuladas (-). (+) ou condições estimuladas por CCL19 (D) histograma representando os valores médios do índice de Similaridade ± SE no indivíduo, a população de células em foco na ausência (-) ou na presença (+) de CCL19. *** P <0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5. Análise da actina F - exclusão fosfo-MTC CXCL12 mediante a estimulação de células T primárias humanas. (A) Percentagem de células polarizadas T na ausência ou na presença de CXCL12 (10 ou 50 ng / mL). (B) Imagem citometria de fluxo que mostram histogramas a repartição do indivíduo, a população de células em foco de acordo com o detalhe brilhante índice de Similaridade que compara a extensão de co-localização entre os fosfo-MTC e faloidina colorações, na ausência de CXCL12 ou com 10 ng / ml ou 50 ng / ml CXCL12. (C) A quantificação da proporção de células que exibem nenhum co-localização de de Perm e as colorações phalloidin em células T (D) Quantificação dos valores médios do índice de similaridade ± SE em cada condição estimulados ou não com CXCL12.. *** P <0,001.fazer upload / 52140 / "target =" _ 52140fig5large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Efeito da polimerização de actina em células T polarização. (A) F-actina de intensidade da coloração (painéis superiores) e circularidade (painéis inferiores) de células T humanas primárias tratadas com Latrunculin A (500 nM, 30 minutos) ou DMSO e em seguida estimuladas com 100 ng / ml CXCL12 durante 8 min. ( B) Histograma mostrando a porcentagem de células T polarizadas tratados com DMSO ou Latrunculin A após 8 min de estimulação com CXCL12. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Expressão do mutante de cinase morta PKCζ ou o mutante N-terminal de T blocos Par6 polarização celular CCL19 ou CXCL12 após tratamento. (A) histogramas de citometria de fluxo de imagens que mostram a intensidade de expressão de GFP, nas células não transfectadas ou as células T primárias T primárias co-transfectadas com GFP e um vector vazio (Controlo) ou o mutante de cinase morta de PKCζ ou o N-terminal parte de Par6 (B) Imagem citometria de fluxo histogramas representam o índice de circularidade da população de células positivas para GFP expressando as diferentes construções no nível basal (NS: Sem estimulação). CCL19 ou após estimulação ou CXCL12 (100 ng / ml durante 8 min ). (C) A quantificação da percentagem de células T morfologicamente polarizadas que expressam as diferentes construções no nível basal ou após CCL19 ou CXCL12 estimulação. Por favor, clique aqui para ver um maior version desta figura.
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Discussion
Usando uma tecnologia recente de citometria de fluxo de imagem, uma estratégia de propagação rápida e informativo para analisar eventos celulares e moleculares induzidos por estimulação de quimiocina é apresentado. A partir de uma única experiência, pode obter-se dois tipos principais de informação: as alterações na morfologia celular induzida por estimulação de quimiocina e a distribuição subcelular de proteínas diferentes durante o processo de polarização. Curiosamente, os dados também é fornecida para a possibilidade de analisar um grande número de células, o que permite que a robustez estatística e análise relevante de uma pequena fracção da população de células inteiras. Como relatado, esta técnica também pode ser utilizada para analisar os acontecimentos moleculares de redistribuição no contexto da sinapse imunológica 12. Além disso, um conjunto semelhante já tem sido usada para as células T estimuladas com sdf1 mas nenhuma análise do grau de co-localização entre dois marcadores foi fornecida 13.
Emboraesta técnica pode, assim, ser adequado para muitos tipos de células, as células aderentes podem não ser directamente analisada e as células em suspensão necessitam de ser fixadas antes da aquisição. Além destas limitações intrínsecas da máquina, que é crítico para manter as células a 37 ° C quando estimulando-os. A temperatura é de facto essencial para atingir apropriada polarização de células T uma vez que as alterações do citoesqueleto, tal como a polimerização da actina que impulsiona as mudanças de forma, são muito dependentes da temperatura. Nossos experimentos com células tratadas latrunculin A confirmar que a remodelação da actina adequada induzida pela estimulação das quimiocinas é realmente crucial para uma célula para atingir o seu estado totalmente polarizada. Além dos dados fornecidos aqui com esta droga, também testou a imagiologia tecnologia de citometria de fluxo com linfócitos T primárias humanas transfectadas com proteínas mutantes que inibem a via de sinalização Par6 / PKCζ. Em concordância com nossos resultados publicados anteriormente 7, mostra-se aqui que essa polaridade complexo favors T polarização celular.
Após a estimulação de quimiocinas, as células T perder sua morfologia redonda para adotar uma forma polarizada. Nós descobrimos que o parâmetro Circularity ser o mais preciso para quantificar essas alterações morfológicas. No entanto, outros parâmetros que descrevem a forma muda são propostos pelo software de análise, como a relação de aspecto ou o Elongatedness. Portanto, pode-se facilmente testar a contribuição de uma via de sinalização especial ou uma proteína específica a este processo.
Neste estudo, foi sempre observado que a percentagem de células que exibem uma polarização morfológica é maior do que aquele para o polarização molecular. Isto indica que uma fracção de células que adotam uma mudança na morfologia não apresentam grandes redistribuição moleculares dos marcadores estudados. Isso pode surgir do fato de que algumas células perdem sua forma redonda para que eles apresentam um índice de circularidade inferior embora eles não mostram claramente uma leading e uma borda uropod. Estas células T parcialmente polarizadas ainda poderia cair no portão de células T morfologicamente polarizadas sem apresentar redistribuições moleculares óbvios de marcadores típicos. Além disso, as diferenças no limiar de sinalização da quimiocina que pode ser mais elevado do que para os marcadores de redistribuição para alterações de forma, também pode explicar esta diferença.
Mostra-se também aqui que o marcador de HLA-ABC não é relocalizada em células T polarizadas e não há nenhuma mudança na intensidade de coloração sobre esta estimulação CCL19. Por outro lado, uma confirmação é indicado aqui que aumentos de coloração de F-actina após tratamento CCL19 (Figuras 1 e 2), como já conhecido, uma vez que a estimulação de quimiocina actina polimerização activa 5. Além disso, é mostrado que os filamentos de actina se relocalizada na frente de células polarizadas. Consequentemente, o índice de similaridade Detalhe brilhante que mede o grau de co-localização entre os dois markers tende a diminuir com a estimulação CCL19. Como comparação, uma tal análise é fornecido aqui para o grau de F-actina de co-localização com proteínas fosfo-MTC que se excluídos da frente da célula. A percentagem de células T estimulada por quimiocinas exibem F-actina - MHC de classe I segregação é muito menor do que aquele para o F-actina - fosfo-MTC (14% vs 48%, respectivamente), uma vez relocalizes F-actina à frente e proteínas fosfo-ERM na traseira de células T polarizadas, enquanto que a repartição de moléculas MHC Classe I não é afetada por estímulos de quimiocinas. Este índice de similaridade Detalhe brilhante pode assim ser usado sistematicamente para comparar a distribuição de dois marcadores em células T polarizadas. Portanto, esta técnica é muito adequado para quantificar o grau de co-localização ou co-exclusão de dois marcadores diferentes de um grande número de células ou, potencialmente, em eventos raros presentes em uma ampla população de células.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem grandemente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert e Louise Rimbault da Facilidade Cochin Imaging. Este trabalho foi apoiado pelo Inserm, CNRS e Ligue Nationale contre le Câncer (Equipe labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
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