Abstract
Le cellule rispondono alla stimolazione chemochine, perdendo la loro forma rotonda in una polarizzazione processo chiamato, e alterando la localizzazione subcellulare di molte proteine. Tecniche di imaging classici sono stati usati per studiare questi fenomeni. Tuttavia, hanno richiesto l'acquisizione manuale di molte cellule seguite da tempo quantificazione della morfologia e la co-localizzazione della colorazione di decine di cellule. Qui, un metodo rapido e potente è descritto per studiare questi fenomeni su campioni costituiti da diverse migliaia di cellule usando un flusso di imaging citometria tecnologia che combina i vantaggi di un microscopio con quelle di un citometro. Utilizzando linfociti T stimolate con CCL19 e colorazione per le molecole MHC di classe I e actina filamentosa, una strategia di gating è presentato per misurare simultaneamente il grado di alterazioni di forma e la misura di co-localizzazione di marcatori che sono affetti da segnalazione CCL19. Inoltre, questa strategia ci ha permesso di gating Observe la segregazione di actina filamentosa (nella parte anteriore) e fosforilata proteine Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (nella parte posteriore) in cellule T polarizzate dopo la stimolazione CXCL12. Questa tecnica è anche utile per osservare l'effetto di blocco sulla polarizzazione di due elementi differenti: inibizione della polimerizzazione mediante un inibitore farmacologico ed espressione dei mutanti del Par6 / atipica PKC percorso di segnalazione. Così, la prova viene dimostrato che questa tecnica è utile per analizzare sia le alterazioni morfologiche e redistribuzioni di proteine.
Introduction
Chemochine sono piccole proteine solubili che attirano le cellule a posizioni specializzate 1. Pertanto, partecipano al corretto posizionamento delle cellule in tessuti, una funzione cruciale per lo sviluppo e la fisiologia. Il sistema immunitario non fa eccezione a questa regola in quanto si basa sull'azione di molti diversi tipi di cellule che agiscono di concerto per montare una risposta immunitaria efficace. Controllando la posizione specifica di un tipo di cellula immunitaria in un dato stato, chemochine sono pre-preliminare antigeni estranei possono essere rilevati e neutralizzati.
In linfociti T in particolare, chemochine si legano a specifici recettori di superficie che, dopo l'impegno, suscitano molti segnali intracellulari (aumento di calcio, ERK fosforilazione, attivazione Rho GTPasi, aumento delle integrine affinità e citoscheletro alterazioni) che favoriscono la motilità cellulare T 2,3. A livello cellulare, si possono osservare alterazioni morfologiche indotte dopo stimolazione chemochine.Questi cambiamenti nella forma delle cellule sono particolarmente drammatica in cellule T: cellule T riposo hanno una morfologia rotonda tallone-come quando si viaggia nel flusso sanguigno. Tuttavia, il rilevamento della presenza di chemochine in siti infiammatori o in prossimità degli organi linfoidi sta per cambiare la forma delle cellule T che ora adottano una tipica morfologia "hand-mirror" costituito da un modulo bipolare: un bordo d'attacco al fronte e un bordo di uscita, o uropod, sul retro 4. Inoltre, componenti intracellulari possono dividersi in queste due regioni opposte di una cellula T polarizzata per sostenere la migrazione. Ad esempio, i filamenti di actina polimerizzazione aumenta su chemochine stimolazione 5 e actina polimerizzata accumula nella parte anteriore di una T cellule polarizzate 2. D'altra parte, diverse proteine, come le proteine fosforilate della Ezrin-radixina-Moesin (ERM) famiglia che collegano la membrana plasmatica della corticale citoscheletro F-actina, ri-localizzano al uropod di polarizzataCellule T 6. È interessante notare che, noi e altri hanno dimostrato che questo processo di polarizzazione è necessario per la migrazione delle cellule T. Infatti, qualsiasi trattamento che interferisce con la polarizzazione inibisce la motilità cellulare. Per esempio, l'inibizione dell'attività dei membri della proteina atipica chinasi C (PKC) famiglia, polarizzazione cellulare PKCζ e PKCι blocchi T e il loro processo di scansione migratoria delle cellule dendritiche 7. Polarizzazione delle cellule T è anche regolato da Rho GTPasi. Abbiamo dimostrato che la modulazione dell'attività RhoA dalla proteina Fam65b recentemente descritta interferisce con i cambiamenti nella morfologia delle cellule T e la loro capacità di migrare in un saggio Transwell 6. Come polarizzazione è un passo prerequisito per la motilità cellulare, è quindi essenziale essere in grado di quantificare come lettura principale di risposte chemochine. Alterazioni di forma delle cellule sono stati precedentemente misurati manualmente 8. Tuttavia, questo tipo di quantificazione è molto in termini di tempo, in modo che di solito solo pochidecine di cellule sono presi in considerazione.
Qui, un nuovo metodo viene presentato per quantificare rapidamente il grado di alterazioni forma di T linfociti esposti a chemochine stimolazione. Un flusso di imaging citometria tecnologia (vedere Tabella di reagenti specifici / Equipment) viene utilizzato, che combina i vantaggi di un citofluorimetro e un microscopio 9 quantificare efficacemente la quantità di cellule polarizzate in diverse condizioni di stimolazione chemochine. Oltre alla quantificazione delle alterazioni morfologiche che si può misurare robusta con questa tecnologia, è anche possibile valutare le variazioni di localizzazione subcellulare di alcune proteine su segnalazione chemochine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di linfociti T
- Preparare principale del mouse o cellule T umane come descritto 10,11.
- Coltivare cellule T umane in mezzo completo RPMI con 10% siero umano AB ad una densità di 2 - 3 x 10 6 cellule / ml.
NOTA: L'uso di siero fetale di vitello (FCS) invece di siero umano può suscitare polarizzazione spontanea di una grande frazione di cellule T umane in coltura. Conservare queste cellule in coltura per 4 - 5 giorni ed ulteriormente processo in qualsiasi momento durante questo periodo. - Mantenere cellule T del mouse in mezzo completo RPMI supplementato con 10% FCS ad una densità cellulare simile. Utilizzare subito o il giorno successivo, dopo una / cultura O N a 37 ° C, in presenza di 10 ng / ml IL7.
- Coltivare la linea cellulare T CEM umano completo RPMI supplementato con 10% FCS.
2. chemochine Stimolazione
- Lavare 5 x 10 5 cellule per condizione sperimentale in caldo medio HBSS integrato con Hepe 10 mMs. Per alcuni esperimenti, co-trasfettare cellule T umane primarie il giorno prima con 2 ug pmaxGFP e 8 mg pcDNA3.1 + (vettore vuoto, controllo), PKCζ chinasi morti, o N-terminali plasmidi PAR6.
- Risospendere il pellet di cellule in warm medio HBSS-Hepes (utilizzare 0,3 ml x numero di condizioni sperimentali).
- Distribuire le cellule in provette da 1,5 ml microcentrifuga.
NOTA: Pertanto, un tubo corrispondente ad una singola condizione sperimentale conterrà 5 x 10 5 cellule in 0,3 ml di HBSS-Hepes medie. Per alcuni esperimenti, aggiungere 500 nM Latrunculin A o veicolo (DMSO) e incubare le cellule per 30 minuti prima della stimolazione chemochine. - Aggiungere da 10 a 500 ng / ml CCL19 o CXCL12 chemochine in ciascun tubo.
NOTA: Usiamo solitamente 10-200 ng chemochine / ml per le cellule T umane. Cellule CEM non esprimono il recettore CCR7 che lega CCL19. Pertanto, le cellule CEM saranno in grado di rispondere a una stimolazione CXCL12. Inoltre, utilizzare concentrazioni più elevate chemochine (300-500 ng / ml) per polarizzare cellule T del mouse. - Capovolgere i tubi diverse volte e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° per 8 o 10 minuti per le cellule T primarie o CEM, rispettivamente.
- Arrestare il processo di polarizzazione aggiungendo a ciascuna provetta 0,3 ml di una soluzione calda contenente 2% paraformaldeide (PFA) e 10 mM Hepes in PBS. Vibrazione le provette e incubare a 37 ° C per 5 min.
3. colorazioni
- Trasferire le cellule dai tubi microcentrifuga di citometria a flusso tubi.
- Riempire i tubi completamente con una soluzione contenente RT 1% di albumina sierica bovina (BSA), EDTA 0,5 mM e 10 mM Hepes in PBS.
- Centrifugare le provette a 460 g per 4 min.
- Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 100 microlitri di una soluzione RT contenente 5% FCS in PBS.
- Aggiungere 5 ml di FITC-anti-HLA-ABC in ogni provetta, li vortice, e incubare per 30 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Lavare le cellule una volta con PBS contenente 5% FCS, unnd una volta con solo PBS.
- A RT: aggiungere 500 microlitri 1% PFA, incubare per 10 min, poi lavare le cellule con una soluzione contenente 1% BSA, EDTA 0,5 mM e HEPES 10 mM in PBS.
- Eliminare il surnatante, riempire completamente i tubi con una soluzione di PBS contenente 0,2% di BSA, 0,1% saponina, 0,5 mM EDTA e 10 mM Hepes (buffer permeabilizzazione).
- Lavare le cellule due volte in questo mezzo.
- Capovolgere i tubi per rimuovere il supporto e vortice li dissociare il pellet.
- Aggiungere 0,25 mg / ml TRITC-falloidina e / o di una diluizione 1: 100 di anticorpi anti-P-ERM a ciascuna provetta, li vortex e incubare per 30 minuti a RT.
- Lavare le cellule con il buffer permeabilizzazione. Incubare con un anticorpo secondario fluorescente se necessario.
- Risospendere le cellule in 200 microlitri di PBS e trasferirli ai tubi microcentrifuga.
NOTA: Le cellule sono pronte per l'acquisizione. Alternativamente, pur mantenendo un volume massimo totale di 200 microlitri per provetta, aggiungere PFA concentrata ad una finale 1%concentrazione al fine di preservare le colorazioni se non devono essere utilizzate le cellule lo stesso giorno per ulteriore elaborazione.
4. Immagini Acquisizione e analisi
- Accendere l'apparecchio (vedi tabella di reagenti specifici / Equipment) e lasciarlo calibrare stesso, in base alle istruzioni del produttore.
NOTA: Il software INSPIRE è stato utilizzato con un obiettivo 40X (0,75 NA). Il software IDEAS 3.0 è stato utilizzato per tutte le quantificazioni segnalati. - Preparare una serie di finestre di acquisizione che possono essere salvate in un modello per futuri esperimenti. Disegnare istogrammi che quantificano i valori di gradiente RMS. Dalla popolazione "In Focus", selezionati sulla RMS istogramma pendenza, delimitano la popolazione "cella singola" su un istogramma della zona. Una volta che la provetta è stata inserita nella macchina, regolare la potenza del laser, cancello a cellule singole e acquisire 5.000 T linfociti.
- Nelle idee morbideware, aprire il file di acquisizione e creare un istogramma che mostra il valore del valore RMS gradiente per le immagini con sfondo chiaro (Canale 1) ottenuto per ogni singola cella. Disegnare un cancello sulla gradiente istogramma RMS che considera le cellule espositrici RMS valore gradiente sopra 57.
NOTA: Il gradiente RMS permette di prendere in considerazione nell'analisi solo i linfociti T che sono nel piano focale. Abbiamo determinato empiricamente che singole cellule che presentano un valore di gradiente RMS superiore a 57 sono nel piano focale, e possono essere considerati accuratamente. - Nel menu Analysis / Maschere, creare una nuova maschera, chiamato Erode (M01,2) dalla maschera morfologia sulle immagini brightfield M01, eroso di 2 pixel. Poi, nel Analisi / menu Impostazioni, creare una nuova caratteristica della zona, calcolato sulla maschera Erode (M01,2). Dalle celle selezionate nel cancello precedente, aprire un istogramma che mostra l'area di celle che utilizzano questa maschera appena creato.
La morfologia maschere che sono disponibili: NOTEpredefinito è molto più grande della dimensione reale della cella. Pertanto, è più preciso di erodere fino a 2 pixel. - Disegnare una porta sulle singole cellule T, escludendo sferette di calibrazione e detriti (piccola area) e le doppiette (Large Area). Regolare questa porta ad ogni acquisizione.
NOTA: Variazioni nella dimensione della cella influenzerà la posizione del cancello. Come cellule T topo sono più piccoli delle cellule T umane che sono a loro volta inferiori cellule CEM, l'area di ogni tipo di cellula sarà proporzionale alle sue dimensioni. - Considerando i singoli, in-fuoco cellule che sono state gated ai passi precedenti, aprire un diagramma a punti costituito dal grezzo Max Pixel sulla colorazione HLA-ABC (canale 2, asse x) in funzione del grezzo Max Pixel sul falloidina colorazione (Channel 4, l'asse y). Creare una porta per escludere gli eventi fluorescenti senza macchia o saturi. Aperte due istogrammi che mostrano la Raw Max Pixel per HLA-ABC (Canale 2) e falloidina (Channel 4) colorazioni.
- Nel Analysis / menù Maschere, createa nuova maschera, chiamato Erode (M02,2) dalla maschera morfologia delle cellule HLA-ABC macchiati (Canale 2), eroso di 2 pixel. Poi, nel Analisi / menu Impostazioni, creare una nuova funzione che consiste del parametro circolarità, calcolato sulla Erode (M02,2).
NOTA: Questo parametro misura la deviazione della forma cellula da un cerchio. Pertanto, una cellula T perfettamente rotonda avrà un valore elevato circolarità che cellule polarizzate allungate esporrà un indice circolarità bassa. - Successivamente, creare un istogramma che riporterà i valori della funzione Circolarità dalle cellule gated precedenza. Utilizzare questo istogramma per tracciare direttamente la distribuzione di un individuo, popolazione cellulare a fuoco secondo il valore della circolarità per ogni singola cella.
- Guardando la forma dell'istogramma per cellule non stimolate, elaborare un cancello per cellule polarizzate, a partire dal valore circolarità basso fino al valore limite circolarità dove la maggior parte delle cellule non stimolatesono tracciate. Guardate il display statistiche per la percentuale di cellule polarizzate tra la popolazione gated (% Gated).
NOTA: Abbiamo impostato questa porta per valori di indice circolarità sotto 13. - Per guardare la polarizzazione della colorazione actina nelle cellule, tracciare un istogramma del brillante dettaglio valore Similarity R3, confrontando la colorazione HLA-ABC (canale 2) e la colorazione falloidina (Channel 4).
NOTA: Più grande è il valore di questa funzionalità, il più sovrapposto le due colorazioni sono. - Utilizzando la stessa strategia di gating come prima, tracciare una porta e sulle cellule non stimolate per la colorazione segregato che mostra la percentuale di cellule con colorazione polarizzata actina.
- Al termine, la percentuale di cellule che mostrano un segregazione nella distribuzione del MHC di classe I e colorazioni falloidina, la percentuale di cellule polarizzate insieme con i valori medi degli indici di similarità e circolarità di tutte le celle ± SD sono mostrati in correspStatistiche onding pannelli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il primo esempio scelto qui riguarda l'uso di linfociti T primari umani stimolati con CCL19. Tuttavia, la stessa strategia può essere utilizzata con le cellule T di topo primaria, linee cellulari T o qualsiasi altro tipo di cellula sensibile alla stimolazione chemochine. La strategia di gating qui presentato comprende una serie di finestre che selezionano gli eventi focalizzato, poi le singole celle. Infine la gamma di intensità di fluorescenza è seguito come esempio su due marcatori: MHC classe I HLA-ABC e actina filamentosa di appoggio (figura 1) o CCL19 stimolate (Figura 2) T linfociti.
Innanzitutto, l'indice circolarità viene misurata in greggia (Figura 1) o CCL19 stimolate (Figura 2) T linfociti. Il fatto che le cellule riposo hanno un picco principale singola con un alto valore di indice Circolarità indica che la maggior parte delle cellule sono vicini per arrotondare. Tuttavia, è chiaro che la stimolazione CCL19 provoca la comparsa ofa secondo sottopopolazione di cellule con un indice di circolarità basso. Questa sottopopolazione comprende le cellule che hanno adottato una morfologia polarizzata. Inoltre, quando rappresentano l'indice di somiglianza tra brillante dettaglio HLA-ABC e colorazione F-actina, si può osservare che alcune cellule mostrano una diminuzione del valore di questo indice previo trattamento CCL19, indicando che entrambi i marcatori mostrano un minor grado di co-localizzazione . È interessante notare dai dot-plot presentati in precedenza, si può posizionare il cursore su un punto particolare per ottenere un'immagine della cellula consistente di un'immagine brightfield e un'immagine per ciascuna delle colorazioni effettuate. Figura 3 presenta quindi esempi di CCL19 stimolati T linfociti che rientrano nel cancello di non polarizzata (Figura 3A) o (Figura 3B), le cellule polarizzate. Si possono visualizzare chiaramente le differenze nella morfologia tra le due sottopopolazioni. Dalle tabelle statistiche sotto gli istogrammi circolarità da figure 1 2, si può tracciare la percentuale di cellule che rientrano nella porta polarizzato in assenza o presenza di CCL19 (Figura 3C). Come previsto, è chiaro che la stimolazione chemochine aumenta la percentuale di cellule T polarizzate (dal 11,2% al 50,6%). Si può anche tracciare l'indice Circolarità media della popolazione cellula intera ottenuti in entrambe le condizioni (Figura 3D). Stimolazione CCL19 suscita un calo in questo indice. Tuttavia, come solo la metà delle cellule sono polarizzati, la variazione dell'indice circolarità media osservata dopo stimolazione CCL19 è piccola.
Analogamente, la figura 4 rappresenta esempi di cellule CCL19 stimolata, in cui sia il HLA-ABC e F-actina colorazioni fanno (Figura 4A) o non colocalize (Figura 4B). Dalle tabelle statistiche sottostanti dettaglio luminosi istogrammi similarità indicati nelle figure 1 e 2, si può ottenere la proporzionedi cellule che presentano un valore di indice inferiore a 1,5, che rappresenta le cellule che presentano un basso grado di co-localizzazione tra HLA-ABC e F-actina. Figura 4C mostra che la frazione di cellule che cade in questa porta aumenta dopo stimolazione CCL19 ( dal 3,4% al 13,9%). Raccogliere i valori dell'indice per ogni singola cella, si può anche tracciare media luminoso Particolare indice somiglianza della popolazione cellula intera ottenuti in entrambe le condizioni (Figura 4D). CCL19 provoca un calo dell'indice, tuttavia, per le stesse ragioni precedentemente, cambiamenti sono piccoli. Osservando le immagini delle celle corrispondenti, sembra che questo calo HLA-ABC - F-actina co-localizzazione è dovuto principalmente al raggruppamento di F-actina in un polo della cellula. Al contrario, la distribuzione subcellulare di molecole HLA-ABC MHC di classe I non sembra essere gravemente colpiti dalla stimolazione CCL19.
Questo è il motivo per cui abbiamo deciso di testare accanto ulteriormentela metodologia analizzando due marcatori (F-actina e fosfo-ERM) noti per segregare in poli opposti di cellule chemochine stimolate T. Cellule T umane stimolate con CXCL12 polarizzati fortemente, come quantificato in Figura 5A con la stessa strategia di gating rispetto a prima (dal 5,95% al 79,10% cellule polarizzate dopo 8 minuti di stimolazione con 50 ng / mL CXCL12). In queste condizioni, vi è una forte diminuzione della brillante dettaglio indice medio di somiglianza come mostrato nelle figure 5B e 5D, il che significa che F-actina e fosfo-ERM colocalizzano meno dopo stimolazione CXCL12. Come previsto, la percentuale di cellule che presentano una separazione dei marcatori scelti qui è maggiore (48%, Figura 5C) rispetto a quelli precedentemente studiate (14%, Figura 4C). Pertanto, il calo del medio dell'indice somiglianza di ciascuna condizione è anche più evidente (Figura 5D). Pertanto, la tecnica di citometria a flusso per immagini qui presentata è suitable per quantificare il grado di co-localizzazione di due colorazioni in contesti diversi.
Infine, abbiamo deciso di illustrare in che misura la perturbazione di qualche elemento del citoscheletro o via di segnalazione noti per influenzare i cambiamenti nella morfologia delle cellule T dopo stimolazione chemochine, potrebbe essere misurato con l'imaging citometria a flusso. Cellule di controllo T sono stati confrontati con alcuni pretrattato con il farmaco-actina interrompere Latrunculin A (Figura 6A). Le cellule sono state stimolate con CXCL12, macchiata di falloidina fluorescente e analizzati da di imaging citometria a flusso. Gli istogrammi che mostrano l'intensità Raw Max Pixel della colorazione F-actina sono indicati per entrambe le popolazioni cellulari (Figura 6A, in alto). Come previsto dall'attività tranciamento di Latrunculin A verso filamenti di actina, l'intensità della colorazione falloidina è inferiore in queste cellule (pannello destro) rispetto al controllo linfociti T trattati con il veicolo DMSO (pannello di sinistra). Inoltre, Latrunculin A-TRcellule T eated presentano un indice di circolarità più grande che indica che rimangono più rotondo rispetto alle cellule di controllo (Figura 6A, in basso). Questo può essere quantificata mediante un cancello posta sulle istogrammi per misurare la percentuale di cellule che presentano alterazioni morfologiche. Anche se il 32% delle cellule di controllo ottiene polarizzata in queste condizioni, solo il 10% dei Latrunculin A -treated T linfociti mostra tutti i cambiamenti di forma (Figura 6B). Pertanto, si è mostrato che il flusso di imaging citometria tecnologia è adatto a misurare differenze di modificazioni morfologiche quando si studia l'effetto potenziale di alcuni elementi citoscheletrici in questo fenomeno.
In secondo luogo, l'acquisizione di un gran numero di cellule con questo metodo apre anche la possibilità di analizzare rapidamente piccoli sottoinsiemi di cellule presenti come minoranza. Nella figura 7, un esempio in cui viene presentato nostra analisi è specificamente limitata al comportamento delle cellule T co-trasfezioneed con GFP insieme con plasmidi codificanti per mutanti dominanti negativi del complesso di polarità Par6 / PKCζ. L'istogramma corrispondente alle cellule non trasfettate ci ha consentito di cancello specificamente sulla GFP + cellule T rilevante (Figura 7A, sinistra). L'intensità di GFP misurata come istogrammi che quantificano la distribuzione dell'intensità di fluorescenza del canale 2 infatti mostra che solo una piccola frazione della popolazione cellula intera è stata trasfettata (Figura 7A). Il grado di polarizzazione morfologica di queste cellule trasfettate è stato poi quantificato misurando solo l'indice circolarità della GFP + cellule (Figura 7B). Un cancello supplementare per cellule T che presentano bassi valori di circolarità permesso stima della percentuale di cellule polarizzate in ogni condizione (figura 7C). I risultati mostrano che l'alterazione della funzione della via di segnalazione Par6 / PKCζ inibito polarizati cellule Til indotta da entrambi chemochine CCL19 e CXCL12, in linea con i nostri risultati precedenti 7.
Figura 1. Risultati rappresentativi non stimolate colorazione sulle cellule T umane primarie. Il pannello superiore sinistro mostra la ripartizione istogramma della RMS gradiente calcolato con la maschera M01 sulle immagini in campo chiaro (Canale 1). Il pannello in alto a destra mostra l'area della maschera M01 eroso di 2 pixel, sulla base delle immagini brightfield (Canale 1) delle cellule In Focus gated dalla trama precedente. I pannelli centrali mostrano i valori di Raw Max pixel di entrambe le colorazioni HLA-ABC e falloidina (Canali 2 e 4, rispettivamente) sia come un punto plot (pannello di sinistra) o come istogrammi (centro destra) e pannelli per l'individuo, in- concentrarsi celle selezionate nel passaggio precedente. Da questa popolazione di singoli, a fuoco le cellule con la corretta colorazione, è calcolata la funzione Circolarità della maschera M02 eroso di 2 pixel della colorazione HLA-ABC (pannello in basso a sinistra) e la funzione di somiglianza R3 brillante dettaglio (in basso pannello di destra) che mostra il grado di somiglianza tra il HLA-ABC e le colorazioni falloidina . Per questi due ultimi lotti, le statistiche che indicano la ripartizione della popolazione (% recintato, in media, la funzione, SD) sono indicati nella tabella di seguito. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Risultati rappresentativi di colorazione sulle cellule T umane primarie stimolate con 200 ng CCL19 / ml per 8 min La strategia layout del pannello e gating sono identici alla figura 1.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dello stato morfologica di T linfociti stimolati da CCL19. (A, B) Esempi di cellule di figura 2 dall'esterno o alla porta "polarizzata", rispettivamente (C) Istogramma mostra la percentuale di cellule T polarizzate ottenuti in assenza di CCL19. (Figura 1, -) o con 200 ng / ml CCL19 (Figura 2, +) (D) istogramma che rappresenta i valori medi dell'indice circolarità ± SE nell'individuo, popolazione-focus cellulare in assenza. (-) o presenza (+) di CCL19. *** P <0.001. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Quantificazione del grado di co-localizzazione tra l'HLA-ABC e colorazioni falloidina. (A, B) Esempi di cellule di figura 2 all'esterno o nel cancello "non colocalized" dal dettaglio luminoso Similarity istogramma, rispettivamente. (C) Istogramma mostra la percentuale di cellule T espongono senza co-localizzazione tra i due marcatori a ONU stimolata (-). (+) o condizioni CCL19-stimolata (D) istogramma che rappresenta i valori medi dell'indice Similarity ± SE nell'individuo, popolazione-focus cellulare in assenza (-) o presenza (+) di CCL19. *** P <0.001. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
p-together.within-page = "always"> 
Figura 5. Analisi di F-actina - fosfo-ERM esclusione su CXCL12 stimolazione delle cellule T primarie umane. (A) Percentuale di cellule T polarizzate in assenza o presenza di CXCL12 (10 o 50 ng / mL). (B) Flusso Imaging citometria istogrammi mostrano la ripartizione dell'individuo, popolazione cellulare a fuoco secondo l'indice di somiglianza brillante dettaglio che confronta il grado di co-localizzazione tra le fosfo-ERM e falloidina colorazioni, in assenza di CXCL12 o con 10 ng / ml o 50 ng / ml CXCL12. (C) Quantificazione della percentuale di cellule che presentano non co-localizzazione il Perm e le colorazioni falloidina a cellule T (D) Quantificazione dei valori medi dell'indice somiglianza ± SE in ogni condizione di stimolate o meno con CXCL12.. *** P <0.001.caricare / 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Effetto della polimerizzazione sulla polarizzazione delle cellule T. (A) F-actina intensità di colorazione (pannelli superiori) e la circolarità (pannelli inferiori) di cellule T umane primarie trattate con Latrunculin A (500 nM, 30 min) o DMSO e quindi stimolate con 100 ng / ml CXCL12 per 8 min. ( B) Istogramma che mostra la percentuale di cellule T polarizzate trattate con DMSO o Latrunculin A dopo 8 minuti di stimolazione con CXCL12. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Espressione del mutante kinase-dead PKCζ o il mutante N-terminale di blocchi PAR6 T polarizzazione cella dopo CCL19 o CXCL12 trattamento. (A) Flusso Imaging citometria istogrammi mostrano l'intensità di espressione di GFP, in cellule non trasfettate T primaria o cellule T primarie co-trasfettate con GFP e un vettore vuoto (controllo) o il mutante chinasi-morto PKCζ o N-terminali parte Par6 (B) Flusso Imaging citometria istogrammi rappresentano l'indice Circolarità della popolazione di cellule GFP-positive esprimono diversi costrutti a livello basale (NS: No Stimulation). o dopo CCL19 o la stimolazione CXCL12 (100 ng / ml per 8 min ). (C) Quantificazione della percentuale di cellule T morfologicamente polarizzate che esprimono i diversi costrutti a livello basale o dopo stimolazione CCL19 o CXCL12. Clicca qui per visualizzare una grande versione di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Usando una tecnologia recente del flusso di imaging citometria, una strategia rapida ed informativo gating per analizzare gli eventi cellulari e molecolari indotti dalla stimolazione chemochine è presentato. Da un unico esperimento, si possono ottenere due tipi principali di informazioni: le variazioni di morfologia cellulare indotta da chemochine stimolazione e la distribuzione subcellulare di proteine differenti durante il processo di polarizzazione. È interessante notare che la prova è prevista anche la possibilità di analizzare un gran numero di cellule, che consente robustezza statistica e analisi pertinenti di una piccola frazione della popolazione cellula intera. Come riportato, questa tecnica può essere utilizzata anche per analizzare gli eventi molecolari ridistribuzione nell'ambito della sinapsi immunologica 12. Inoltre, un set up simile è già stato utilizzato per le cellule T stimolate SDF1 ma nessuna analisi del grado di co-localizzazione tra due marcatori è stato fornito 13.
Sebbenequesta tecnica può quindi essere adatto per molti tipi di cellule, cellule aderenti non possono essere analizzati direttamente e le cellule in sospensione devono essere fissati prima dell'acquisizione. In aggiunta a queste limitazioni intrinseche della macchina, è fondamentale per mantenere le cellule a 37 ° C per la stimolazione di loro. La temperatura è infatti fondamentale per ottenere una corretta polarizzazione delle cellule T dal cambiamenti citoscheletrici, come polimerizzazione di actina che spinge cambiamenti di forma, sono molto dipendente dalla temperatura. I nostri esperimenti con Latrunculin A cellule trattate confermano che adeguata rimodellamento actina indotta dalla stimolazione chemochine è infatti cruciale per una cella di raggiungere il suo stato completamente polarizzato. Oltre ai dati forniti qui con questo farmaco, abbiamo provato anche la tecnologia di imaging di citometria a flusso con linfociti T primari umani trasfettate con le proteine mutanti che inibiscono la via di segnalazione Par6 / PKCζ. Coerentemente con i nostri risultati precedentemente pubblicati 7, si è mostrato che questo complesso di polarità favors polarizzazione delle cellule T.
Dopo stimolazione chemochine, le cellule T perdono la loro morfologia rotonda di adottare una forma polarizzata. Abbiamo trovato il parametro Circolarità di essere il più preciso per quantificare tali alterazioni morfologiche. Tuttavia, altri parametri che descrivono i cambiamenti di forma sono proposte dal software di analisi, come ad esempio il rapporto di aspetto o il Elongatedness. Pertanto, si può facilmente verificare il contributo di un particolare percorso di segnalazione o di una specifica proteina in questo processo.
In questo studio, abbiamo sempre osservato che la percentuale di cellule che presentano una polarizzazione morfologica è superiore a quella per la polarizzazione molecolare. Ciò indica che una frazione di cellule che adottano un cambiamento nella morfologia non presentano grandi ridistribuzione molecolari dei marcatori studiati. Ciò può derivare dal fatto che alcune cellule perdono la loro forma rotonda in modo da presentare un indice Circolarità inferiore pur non mostrano chiaramente un leading bordo e una uropod. Queste cellule T parzialmente polarizzate potrebbero ancora rientrare nel cancello di cellule T morfologicamente polarizzate senza presentare evidenti ridistribuzioni molecolari di marcatori tipici. Inoltre, le differenze nella soglia di segnalazione chemochina che potrebbe essere più alta per i marcatori redistribuzione che per alterazioni di forma potrebbe anche spiegare queste differenze.
Si è anche mostrato che il marcatore HLA-ABC non è relocalized in cellule T polarizzate e non vi è alcun cambiamento nella intensità di questa colorazione dopo stimolazione CCL19. Viceversa, una conferma è fornito qui che colorazione aumenti F-actina upon trattamento CCL19 (Figure 1 e 2) come già noto, poiché la stimolazione chemochina attiva actina polimerizzazione 5. Inoltre, è dimostrato che i filamenti di actina ottenere relocalized nella parte anteriore delle cellule polarizzate. Di conseguenza, il brillante dettaglio dell'indice somiglianza che misura il grado di co-localizzazione tra i due markers tende a diminuire dopo stimolazione CCL19. A titolo di confronto, tale analisi è fornito qui per il grado di F-actina co-localizzazione con proteine fosfo-ERM che vengono esclusi dalla parte anteriore cella. La percentuale di cellule T stimolate chemochine espongono F-actina - MHC classe I segregazione è molto inferiore a quello per F-actina - fosfo-ERM (14% vs. 48%, rispettivamente) poiché rilocalizza F-actina anteriori e proteine fosfo-ERM sul retro delle cellule T polarizzate, mentre la ripartizione delle molecole MHC di classe I, non è influenzata dalla stimolazione chemochine. Questo indice somiglianza brillante dettaglio può quindi essere utilizzato sistematicamente per confrontare la distribuzione di due marcatori in cellule T polarizzate. Pertanto, questa tecnica è molto appropriato per quantificare il grado di co-localizzazione o co-esclusione di due marcatori differenti su un gran numero di cellule o, potenzialmente, sugli eventi rari presenti in una popolazione di cellule ampia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono notevolmente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert e Louise Rimbault dello strumento Cochin Imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da Inserm, CNRS e Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
