Abstract
Zellen reagieren auf die Stimulation durch in einem Prozess namens Polarisation verlieren ihre runde Form, und durch Änderung der subzelluläre Lokalisierung vieler Proteine Chemokin. Klassischen Bildgebungstechniken sind verwendet worden, um diese Phänomene zu untersuchen. Jedoch benötigt sie die manuelle Erfassung vieler Zellen gefolgt von zeitaufwendig Quantifizierung der Morphologie und die Co-Lokalisation der Färbung von zig Zellen. Hier wird ein schnelles und leistungsfähiges Verfahren beschrieben, um diese Phänomene zu Proben aus mehreren Tausenden von Zellen unter Verwendung eines Abbildungs Durchflusszytometrie Technologie, die die Vorteile eines Mikroskops mit denen eines Zytometers kombiniert studieren. Verwendung von T-Lymphozyten mit CCL19 und Färbung für MHC Klasse I-Molekülen und filamentöses Aktin stimuliert wird eine Gating-Strategie dargestellt, um gleichzeitig die den Grad der Gestalt Änderungen und das Ausmaß der Co-Lokalisierung von Markern, die von CCL19 Signalisierung betroffen sind. Darüber hinaus konnten wir diese Gating-Strategie Observe die Trennung von filamentösen Aktin (vorne) und phosphoryliert Ezrin-Radixin-Moesin (Phospho-ERM) Proteine (auf der Rückseite) im polarisierten T-Zellen nach CXCL12 Stimulation. Diese Technik war auch nützlich, um die blockierende Wirkung der Polarisation von zwei verschiedenen Elementen zu beachten: Hemmung der Aktin-Polymerisation von einem pharmakologischen Inhibitors und Expression von Mutanten des Par6 / atypische PKC Signalweg. Somit wird Beweise gezeigt, dass diese Technik ist nützlich, um sowohl morphologische Veränderungen und Protein Umverteilungen analysieren.
Introduction
Chemokine sind kleine lösliche Proteine, die Zellen zu spezialisierten Standorten 1 gewinnen. Daher nehmen sie an der korrekten Positionierung von Zellen in Geweben, eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung und Physiologie. Das Immunsystem ist keine Ausnahme von dieser Regel, wie es auf die Einwirkung von vielen verschiedenen Zelltypen, die in einem Strang, um eine wirksame Immunantwort beruht. Durch die Steuerung der spezifischen Position eines Immunzelltyps in einem bestimmten Zustand sind Chemokine vorge erforderlich, bevor Fremdantigene erkannt und neutralisiert werden.
In T-Lymphozyten, insbesondere Chemokine binden an spezifische Oberflächenrezeptoren, die bei Eingriff, entlocken viele intrazelluläre Signale (Calcium-Anstieg, ERK Phosphorylierung, Rho-GTPasen Aktivierung Anstieg der Integrine Affinität und Zytoskelett-Änderungen), die T-Zell-Motilität 2,3 begünstigen. Auf zellulärer Ebene kann eine morphologische Veränderungen bei Chemokin Stimulation ausgelöst beobachten.Diese Veränderungen in der Zellformen sind besonders dramatisch in T-Zellen: ruhende T-Zellen bei Reisen in den Blutstrom über eine wulstartige runde Morphologie. Jedoch ist die Erfassung der Gegenwart von Chemokinen an Entzündungsstellen oder zumin Nähe Lymphorganen gehen, um die Form von T-Zellen, die nun eine typische "hand-Spiegel" Morphologie, bestehend aus einer bipolaren Form annehmen ändern: eine führende Kante an der Vorderseite und eine Hinterkante oder Uropod, an der Rückseite 4. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Komponenten in diesen zwei gegenüberliegenden Bereichen eines polarisierten T-Zelle zu trennen, um die Migration zu erhalten. Beispielsweise Aktinfilamente Polymerisation steigt auf Chemokin Stimulation 5 und polymerisierten Actin reichert sich an der Vorderseite eines polarisierten T-Zelle 2. Auf der anderen Seite, mehrere Proteine, wie phosphorylierte Proteine der Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) -Familie, die Plasmamembran zu der kortikalen F-Aktin zu verbinden, erneut lokalisiert am Uropod polarisierterT-Zellen 6. Interessanterweise haben wir und andere zeigen, dass diese Polarisierung Prozess wird für T-Zell-Migration erforderlich. Tatsächlich wird jede Behandlung, die mit Polarisations stört zellulären Motilität zu hemmen. Zum Beispiel die Hemmung der Aktivität der Mitglieder der atypischer Proteinkinasen C (PKC) Familie PKCζ und PKCι Blöcke T Zellpolarisation und deren Migrationsscanprozess der dendritischen Zellen 7. T-Zell-Polarisation auch von Rho-GTPasen geregelt. Wir haben gezeigt, dass die Modulation des RhoL Aktivität durch den kürzlich beschriebenen Fam65b Protein interferiert mit T-Zell-Veränderungen in der Morphologie und ihrer Fähigkeit, in einem Transwell-Assay 6 migrieren. Als Polarisations Voraussetzung Schritt zelluläre Motilität ist es daher von entscheidender Bedeutung, um es als eine Haupt Auslesen Chemokin Reaktionen zu quantifizieren. Zellform Veränderungen wurden bisher manuell 8 gemessen. Allerdings ist diese Art der Quantifizierung sehr zeitaufwendig, so dass in der Regel nur wenigeZehn Zellen berücksichtigt.
Hier wird ein neues Verfahren vorgestellt, um schnell quantifiziert den Grad der Formänderungen von T-Lymphozyten auf die Stimulation Chemokin ausgesetzt. Eine Abbildungs Durchflusszytometrie-Technologie (siehe Tabelle Spezifische Reagenzien / Equipment) verwendet wird, der die Vorteile eines Durchflusszytometers und ein Mikroskop 9 kombiniert, um die Menge des polarisierten Zellen unter verschiedenen Bedingungen von Chemokin Stimulation effizient zu quantifizieren. Zusätzlich zur Quantifizierung der morphologischen Veränderungen, die eine robuste Konstruktion mit dieser Technik gemessen werden kann, ist es auch möglich, Veränderungen der subzellulären Lokalisation von einigen Proteinen bei Chemokinsignalisierung bewerten.
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Protocol
1. Herstellung von T-Lymphozyten
- Bereiten primären Maus oder humanen T-Zellen wie beschrieben 10,11.
- Kultivieren humaner T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% Humanserum AB in einer Dichte von 2 - 3 x 10 6 Zellen / ml.
HINWEIS: Die Verwendung von fötalem Kälberserum (FCS) anstelle von Humanserum kann spontane Polarisation von einem großen Teil der menschlichen T-Zellen in der Kultur hervorruft. Bewahren Sie diese Zellen in Kultur für 4-5 Tage und weiter zu verarbeiten, diese jederzeit während dieser Periode. - Pflegen Maus-T-Zellen in komplettem RPMI-Medium mit 10% FCS ergänzt war, bei einer ähnlichen Zelldichte. Sofort verwenden oder am nächsten Tag, nach einer O / N-Kultur bei 37 ° C in Gegenwart von 10 ng / ml IL7.
- Kultivieren der CEM menschlichen T-Zelllinie in komplettem RPMI, ergänzt mit 10% FCS.
2. Chemokine Stimulation
- Waschen 5 x 10 5 Zellen pro Versuchsbedingung in warmem HBSS Medium mit 10 mM Hepe ergänzts. Für einige Experimente, Co-Transfektion von primären humanen T-Zellen am Tag zuvor mit 2 pg pmaxGFP und 8 ug pcDNA3.1 + (Leervektor, Kontrolle), PKCζ Kinase tot, oder N-terminalen Par6 Plasmide.
- Zellpellet in warmem HBSS-HEPES-Medium (0,3 ml verwenden x Anzahl der Versuchsbedingungen).
- Verteilen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: Daher wird ein Rohr entsprechend einer einzelnen experimentellen Bedingung 5 x 10 5 Zellen in 0,3 ml HBSS-HEPES Medium enthalten. Für einige Experimente, 500 nM Latrunculin A oder Vehikel (DMSO) und inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten vor dem Chemokin-Stimulation. - Hinzufügen 10 bis 500 ng / ml CCL19 oder CXCL12 Chemokin in jedes Röhrchen.
HINWEIS: Wir verwenden normalerweise 10 bis 200 ng / ml Chemokin für den menschlichen T-Zellen. CEM-Zellen exprimieren keine CCR7 Rezeptor, CCL19 bindet. Daher wird CEM-Zellen nur dann in einem CXCL12 Stimulation reagieren. Darüber hinaus verwenden höheren Chemokin-Konzentrationen (300-500 ng / ml) zu polarisieren, Maus-T-Zellen. - Mehrmals drehen Sie die Rohre und inkubieren sie in einem 37 ° C Wasserbad für 8 oder 10 Minuten für die primäre T-Zellen oder CEM auf.
- Stoppen des Polarisationsprozesses durch Zugabe zu jedem Röhrchen 0,3 ml einer warmen Lösung, die 2% Paraformaldehyd (PFA) und 10 mM Hepes in PBS. Drehen Sie die Rohre und inkubieren sie bei 37 ° C für 5 min.
3. Färbungen
- Übertragen Sie die Zellen aus den Mikrozentrifugenröhrchen auf Zytometrie Rohre fließen.
- Vollständig zu füllen die Rohre mit einer RT-Lösung, die 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes in PBS.
- Zentrifugiere die Röhrchen bei 460 × g für 4 min.
- Den Überstand verwerfen und die Zellen werden in 100 ul einer RT-Lösung, enthaltend 5% FCS in PBS.
- Mit 5 & mgr; l FITC-anti-HLA-ABC in jeder Röhre, Wirbel ihnen und inkubieren für 30 min bei RT, entfernt von Licht.
- Wash-Zellen einmal mit PBS, enthaltend 5% FCS, einnd einmal mit nur PBS.
- Bei RT: add 500 ul 1% PFA, Inkubation für 10 min, dann waschen Sie die Zellen mit einer Lösung, die 1% BSA, 0,5 mM EDTA und 10 mM HEPES in PBS.
- Überstand verwerfen, vollständig zu füllen die Röhrchen mit einer Lösung von PBS, die 0,2% BSA, 0,1% Saponin, 0,5 mM EDTA und 10 mM Hepes (Permeabilisierung Puffer).
- Waschen Sie die Zellen zweimal in diesem Medium.
- Drehen Sie die Rohre, um das Medium zu entfernen und vortexen sie das Zellpellet zu distanzieren.
- Zugabe von 0,25 & mgr; g / ml TRITC-Phalloidin und / oder eine 1: 100-Verdünnung von Anti-P-ERM-Antikörper zu jedem Röhrchen, Wirbel zu und inkubiere für 30 min bei RT.
- Wash-Zellen mit der Permeabilisierung Puffer. Inkubieren mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörper, falls erforderlich.
- Die Zellen in 200 ul PBS und sie auf Mikrozentrifugenröhrchen.
Hinweis: Zellen sind bereit für die Übernahme. Alternativ, während eine maximale Gesamtmenge von 200 ul pro Röhrchen, konzentriertes PFA auf einen endgültigen 1%Konzentration, um die Färbungen zu erhalten, wenn die Zellen nicht am selben Tag für die weitere Verarbeitung verwendet werden.
4. Bilder Erfassung und -analyse
- Schalten Sie das Gerät (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Equipment) und lassen Sie es sich selbst zu kalibrieren nach den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Die INSPIRE-Software wurde mit einem 40X-Objektiv (0,75 NA) verwendet. Der IDEAS 3.0-Software wurde für alle berichteten Quantifizierungen verwendet. - Bereiten Sie eine Reihe von Akquisitionsfenster, die in einer Vorlage für zukünftige Experimente gespeichert werden können. Zeichne Histogramme, die die RMS Gradientenwerte zu quantifizieren. Von der "In Focus" Bevölkerung, auf die RMS Gradientenhistogramm ausgewählt, die Abgrenzung der "Einzelzelle" Bevölkerung in einem Histogramm der Umgebung. Sobald der Mikrozentrifugenröhrchen in die Maschine eingelegt worden ist, stellen Sie die Laserleistung, Tor auf einzelne Zellen und erwerben 5.000 T-Lymphozyten.
- In der Idee Weichware, öffnen Sie den Erwerb Datei und erstellen Sie ein Histogramm, das den Wert des Gradienten RMS-Wert für Hellfeld-Bilder zeigen wird (Kanal 1) für jede einzelne Zelle erhalten. Zeichnen Sie ein Tor auf der RMS Gradientenhistogramm, die Zellen, die RMS Gradientenwert oberhalb 57 hält.
HINWEIS: Der RMS-Gradienten ermöglicht unter Berücksichtigung der Analyse nur die T-Lymphozyten, die in der Brennebene sind. Wir haben empirisch festgestellt, dass die einzelnen Zellen eine RMS Gradientenwert überlegen 57 zeigen, sind in der Brennebene, und kann genau berücksichtigt werden. - In der Analyse / Masken-Menü erstellen Sie eine neue Maske, genannt Erodieren (M01,2) von der Morphologie Maske auf den Hell Bilder M01, von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü ein neues Merkmal der Umgebung, auf dem Erodieren (M01,2) Maske errechnet. Aus den im vorigen Tor ausgewählten Zellen, öffnen Sie ein Histogramm, das die Umgebung der Zellen mit dieser neu geschaffenen Maske.
HINWEIS: Die Morphologie Masken, die von verfügbarenStandard sind viel größer als die tatsächliche Größe der Zelle. Somit ist es genauer, sie zu erodieren bis zu 2 Pixel. - Zeichnen Sie ein Tor zu den einzelnen T-Zellen, ohne den Kalibrierungsperlen und Schmutz (kleine Fläche) und die Dubletten (Großraum). Passen Sie dieses Tor bei jedem Erwerb.
HINWEIS: Variationen in der Zellgröße wird die Position des Tors beeinflussen. Als Maus-T-Zellen sind kleiner als menschliche T-Zellen, die ihrerseits kleiner als CEM-Zellen sind, wird die Fläche eines jeden Zelltyps proportional zu seiner Größe sein. - Unter Berücksichtigung der einzelnen, fokussierten Zellen, die bei den vorherigen Schritten gated wurden Öffnen ein Punkt-Diagramm, bestehend aus der Rohmaterial Max Pixel auf dem HLA-ABC-Färbung (Kanal 2, x-Achse) als Funktion des Raw Max Pixel auf Phalloidin Färbung (Kanal 4, y-Achse). Erstellen Sie ein Tor, um die ungefärbten oder gesättigten fluoreszierende Veranstaltungen auszuschließen. Öffnen Sie zwei Histogramme, die die Raw Max Pixel für HLA-ABC (Kanal 2) und Phalloidin (Channel 4) Färbungen.
- In der Analyse / Masken-Menü createa neue Maske, genannt Erodieren (M02,2) von der Morphologie Maske der HLA-ABC gefärbten Zellen (Kanal 2), von 2 Pixeln erodiert. Dann, in der Analyse / Eigenschaften-Menü, erstellen Sie eine neue Funktion, die aus dem Kreisformparameter, auf dem Erodieren (M02,2) berechnet.
Hinweis: Dieser Parameter misst die Abweichung der Zellform von einem Kreis. Daher wird eine perfekt runde T-Zellen eine hohe Rund Wert während verlängert polarisierten Zellen eine niedrige Kreis Index aufweisen müssen. - Anschließend erstellen Sie ein anderes Histogramm, das die Werte der Kreisformmerkmal von den zuvor geschlossenen Zellen berichten. Verwenden dieses Histogramm unmittelbar plotten die Verteilung eines einzelnen, fokussierten Zellpopulation gemäß dem Wert der Kreisförmigkeit für jede einzelne Zelle.
- Mit Blick auf die Form des Histogramms für Nicht-stimulierte Zellen, zeichnen ein Gate zum polarisierten Zellen, beginnend mit der untersten Kreis Wert bis zum Rund Grenzwert, wo die meisten der nicht-stimulierten Zellenaufgetragen. Sehen Sie in der Statistikanzeige für den Prozentsatz der polarisierten Zellen unter den Wohnbevölkerung (% Gated).
HINWEIS: Wir haben dieses Tor für Kreisformindexwerte unter 13 eingestellt. - Um bei der Polarisation des Actin-Färbung in den Zellen aus, zeichnet eine Histogramm für die Hell-Detail Ähnlichkeit R3 Wert, Vergleichen des HLA-ABC-Färbung (Kanal 2) und der Phalloidin-Färbung (Kanal 4).
HINWEIS: Je größer der Wert dieser Funktion ist, desto mehr überlagert die beiden Färbungen sind. - Unter Verwendung der gleichen Strategie wie zuvor Gating plotten ein Gate an den nicht-stimulierten Zellen für die gesonderte Färbung, die den Prozentsatz an Zellen mit polarisiertem Aktinfärbung zeigt.
- Nach Beendigung werden der Prozentsatz von Zellen, die eine Entmischung in der Verteilung der MHC-Klasse-I und Phalloidin-Färbungen wurde die prozentuale polarisierter Zellen zusammen mit den Mittelwerten der Kreisförmigkeit und Ähnlichkeit Indizes aller Zellen ± SD im entspr gezeigtenonding Statistiken Panels.
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Representative Results
Die erste hier gewählten Beispiel betrifft die Verwendung von humanen primären T-Lymphozyten mit CCL19 stimuliert. Jedoch kann die gleiche Strategie mit primären Maus-T-Zellen, T-Zelllinien oder andere Zelltypen, die auf Chemokin Stimulation verwendet werden. Die Gating-Strategie hier vorgestellten eine Reihe von Fenstern, die die fokussierten Veranstaltungen, dann die einzelnen Zellen auszuwählen. MHC-Klasse-I-HLA-ABC und polymerem Aktin zur Anlage (Figur 1) oder CCL19-stimulierte (Abbildung 2) T-Lymphozyten: Schließlich wird der Bereich der Fluoreszenzintensität wird hier als ein Beispiel für zwei Marker verfolgt.
Zuerst wird die Zirkularität Index in unbehandelten (Abbildung 1) oder CCL19-stimulierte (Abbildung 2) T-Lymphozyten gemessen. Die Tatsache, dass ruhende Zellen haben einen großen einzelnen Peak mit einer hohen Rundheit Indexwert zeigt an, dass die meisten Zellen sind in der Nähe zu runden. Es ist jedoch klar, dass CCL19 Stimulierung ruft das Auftreten ofa zweite Subpopulation von Zellen mit einem niedrigen Kreisformindex. Diese Subpopulation umfasst Zellen, die eine polarisierte Morphologie angenommen haben. Auch, wenn die die Hell-Detail Similarity Index zwischen HLA-ABC und F-Aktin-Färbung kann man beobachten, dass einige Zellen weisen einen Rückgang der Wert dieses Index auf CCL19 Behandlung, was darauf hinweist, dass beide Markierungen zeigen einen geringeren Grad an Co-Lokalisierung . Interessanterweise aus der Dot-Plots zuvor dargestellt, kann man den Cursor auf einen bestimmten Punkt zu positionieren, um ein Bild der Zelle, bestehend aus einem Hellbildes und eines Bildes für jeden der Färbungen durchgeführt erhalten, Fig. 3 stellt somit Beispiele für CCL19 stimulierte T Lymphozyten, die im Tor des nicht polarisierten (3A) oder polarisiert (3B) Zellen fallen. Man kann die Unterschiede in der Morphologie zwischen den beiden Bevölkerungsgruppen deutlich sichtbar zu machen. Aus den Statistiken Tabellen unter dem Kreisform Histogramme aus den 1 2, kann man den Prozentsatz an Zellen, die in der polarisierten Gate in Abwesenheit oder Anwesenheit von CCL19 (3C) fallen zu plotten. Wie erwartet, ist es klar, dass Chemokin Stimulation erhöht den Prozentsatz des polarisierten T-Zellen (von 11,2% auf 50,6%). Man kann auch zu plotten die mittlere Zirkularität Index der Gesamtzellpopulation in beiden Bedingungen (Figur 3D) erhalten. CCL19-Stimulation löst einen Rückgang in diesem Index. , Da nur die Hälfte der Zellen polarisiert sind, ist die Veränderung der auf CCL19-Stimulation beobachtet mittlere Rundheit Index klein.
Ähnlich 4 stellt Beispiele von CCL19-stimulierten Zellen, in denen sowohl die HLA-ABC und die F-Aktin-Färbungen zu tun (4A) oder nicht kolokalisiert (4B). Aus den Statistiktabellen unterhalb der Hell-Detail Ähnlichkeit Histogramme in den Figuren 1 und 2 gezeigt, kann man den Anteil zu erhalten,von Zellen, die einen Indexwert von unter 1,5 aufweisen, welche die Zellen, die einen sehr niedrigen Grad an Co-Lokalisation zwischen HLA-ABC und F-Actin weisen. 4C zeigt, dass der Anteil der Zellen, die in auf CCL19-Stimulation dieses Tor steigt fällt ( von 3,4% auf 13,9%). Sammeln der Werte des Index für jede einzelne Zelle, kann man auch den mittleren plotten Hell ausführliche Ähnlichkeitsindex der gesamten Zellpopulation unter beiden Bedingungen (4D) erhalten. CCL19 ruft einen Abfall in dem Index, jedoch aus den gleichen Gründen, wie zuvor, kleine Änderungen. Mit Blick auf die Bilder der entsprechenden Zellen scheint es, daß dieser Tropfen in HLA-ABC - F-Aktin Kolokalisation ist vor allem aufgrund der Bündelung von F-Aktin in einem Pol der Zelle. Umgekehrt hat die subzelluläre Verteilung von HLA-ABC MHC Klasse I Moleküle nicht zu grob durch CCL19 Stimulation beeinflusst werden.
Das ist der Grund, warum wir als nächstes entschieden, weiter zu testendie Methodik der Analyse zwei Marker (F-Actin und Phospho-ERM) dafür bekannt, in entgegengesetzten Polen der Chemokin-stimulierten T-Zellen zu trennen. Menschlichen T-Zellen mit CXCL12 stimuliert stark polarisiert, wie in Figur 5A mit der gleichen Verknüpfungsstrategie als zuvor (von 5,95% bis 79,10% polarisierten Zellen nach 8 min Stimulierung mit 50 ng / mL CXCL12) quantifiziert. Unter diesen Bedingungen gibt es eine starke Abnahme der mittleren Hell ausführliche Ähnlichkeitsindex, wie in den 5B und 5D gezeigt ist, das heißt, F-Actin und Phospho-ERM colokalisieren weniger nach CXCL12 Stimulation. Wie erwartet, ist der Prozentsatz der Zellen, die eine Entmischung der hier gewählten Marker höher (48%, 5C) im Vergleich zu den zuvor untersuchten (14%, 4C). Entsprechend ist der Abfall der mittleren Ähnlichkeitsindex jeder Bedingung auch deutlicher (Figur 5D). Daher ist die Bild Durchflusszytometrie Technik präsentierten suabler, den Grad der Co-Lokalisierung von zwei Färbungen in unterschiedlichen Umgebungen zu quantifizieren.
Schließlich haben wir uns entschieden, in welchem Umfang zeigen die Störung irgendeines Elements oder Zytoskelett-Signalweges, um Änderungen in T-Zell-Morphologie auf Chemokin Stimulation beeinträchtigen könnte durch Bildgebung gemessen werden Durchflusszytometrie. Steuer T-Zellen wurden zuerst mit einigen mit der Aktin-störenden Arzneimittel Latrunculin A (6A) vorbehandelt verglichen. Die Zellen wurden mit CXCL12 stimuliert, mit fluoreszierenden Phalloidin gefärbt und durch Abbilden der Durchflusszytometrie analysiert. Histogramme, die das rohe Max Pixelintensität des F-Actin-Färbung für beide Zellpopulationen (6A, oben) gezeigt. Wie aus der Trenn Aktivität Latrunculin A Richtung Aktinfilamente erwartet, ist die Intensität des Phalloidin-Färbung unteren in diesen Zellen (rechts) im Vergleich zu mit dem Vehikel DMSO (linkes Feld) behandelten T-Lymphozyten zu steuern. Außerdem Latrunculin A-treated T Zellen eine größere Kreisförmigkeit Index anzeigt, dass sie noch runder als Kontrollzellen (6A, unten). Dies kann durch ein Tor auf der Histogramme gesetzt, um den Prozentsatz von Zellen, die morphologischen Veränderungen zeigen Messung quantifiziert werden. Obwohl 32% der Kontrollzellen erhalten polarisiert in diesem Zustand nur 10% der Latrunculin A behandelten T-Lymphozyten weisen keine Formänderungen (6B). Daher wird hier dargestellt, dass die Abbildungs Durchflusszytometrie Technologie geeignet ist, Unterschiede in der morphologischen Veränderungen zu messen, wenn man die mögliche Wirkung von einigen Zytoskelettelementen dieses Phänomens untersucht.
Zum anderen eröffnet auch der Erwerb einer großen Anzahl von Zellen mit dieser Methode die Möglichkeit, sich schnell kleine Teilmengen als Minderheit vorhandenen Zellen analysieren. In 7 ist ein Beispiel dargestellt, wo die Analyse ist speziell auf das Verhalten von T-Zellen co-transfizieren eingeschränkted mit GFP zusammen mit Plasmiden, die für dominant-negative Mutanten der Polarität komplexer Par6 / PKCζ. Das Histogramm, die den nicht-transfizierten Zellen wurde uns Gate speziell im entsprechenden GFP + T-Zellen (7A, links) erlaubt. Die Intensität der GFP gemessen als Histogramme, die die Verteilung der Fluoreszenzintensität des Kanals 2 zu quantifizieren zeigen, dass tatsächlich nur ein kleiner Bruchteil der gesamten Zellpopulation transfiziert wurde (7A). Der Grad der morphologischen Polarisation dieser transfizierten Zellen wurde dann durch die Messung des Kreisformindex der GFP + -Zellen (7B) quantifiziert. Ein zusätzliches Tor für T-Zellen, die niedrige Werte der Kreisförmigkeit erlaubt Schätzung des Prozentsatzes der polarisierten Zellen in jedem Zustand (7C). Die Ergebnisse zeigen, dass die Störung der Funktion des Par6 / PKCζ Signalweg gehemmt T-Zell-polarizatiauf die von beiden CCL19 und CXCL12 Chemokine mit unseren bisherigen Erkenntnissen 7 induziert, im Einklang.
Abbildung 1. Repräsentative nicht-stimulierten Färbungsergebnisse auf primären humanen T-Zellen. Die obere linke Panel zeigt das Histogramm Verteilung der Gradient RMS mit dem M01-Maske auf den Hellfeldbilder berechnet (Kanal 1). Der obere rechte Bild zeigt den Bereich der M01-Maske von 2 Pixeln erodiert, basierend auf den Hell Bilder (Kanal 1) der In Focus Zellen aus dem früheren Grundstück Wohnanlage. Die Mitteltafeln zeigen die Raw Max Pixelwerte sowohl der HLA-ABC und Phalloidin Färbungen (Kanäle 2 bzw. 4) entweder als Punkt-Diagramm (links) oder als Histogramme (mittlere und rechte Platten) für den Einzelnen, in- Fokus-Zellen bei dem vorhergehenden Schritt gewählt. Aus dieser Population von einzelnen, in-Fokus-Zellen mit der richtigen Färbung, wird die Rundheit-Funktion auf dem M02-Maske von 2 Pixel des HLA-ABC-Färbung (linke untere Feld) und der Bright Details Ähnlichkeit R3-Funktion (unten rechts), der den Grad der Ähnlichkeit zwischen der HLA-ABC und den Phalloidin Färbungen erodiert berechnet . Für diese beiden letzten Grundstücke, Statistiken, die die Verteilung der Bevölkerung (% gated, bedeutet der Funktion, SD) sind in der folgenden Tabelle angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 2: Vertreter Färbungsergebnisse auf primären humanen T-Zellen mit 200 ng / ml CCL19 8 min stimuliert Der Schaltschrankaufbau und Gating-Strategie sind identisch mit Abbildung 1.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung der morphologische Zustand der T-Lymphozyten durch CCL19 stimuliert. (A, B) Beispiele für Zellen, aus Figur 2 im Freien oder im "polarisiert" gate, bzw. (C) Das Histogramm zeigt den Prozentsatz von polarisierten T-Zellen in Abwesenheit von CCL19 erhalten. (Abbildung 1, -) oder mit 200 ng / ml CCL19 (Abbildung 2, +) (D) Histogramm, die die Mittelwerte der Kreisformindex ± SE in das Individuum, in Fokus Zellpopulation in Abwesenheit. (-) oder Anwesenheit (+) von CCL19. *** P <0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Quantifizierung der Grad der Co-Lokalisation zwischen dem HLA-ABC und Phalloidin Färbungen. (A, B) Beispiele für Zellen, die aus Abbildung 2 im Freien oder in der "nicht kolokalisiert" Tor vom Helle Details Ähnlichkeit Histogramm auf. (C) Das Histogramm zeigt den prozentualen Anteil der T-Zellen keine Kolokalisation zwischen den beiden Markierungen in un- Aussteller stimuliert (-). oder CCL19-stimuliert (+) Bedingungen (D) Histogramm, die die Mittelwerte der Ähnlichkeitsindex ± SE in das Individuum, in Fokus-Zellpopulation in der Abwesenheit (-) oder Anwesenheit (+) von CCL19. *** P <0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 5. Analyse der F-Aktin - Phospho-ERM Ausschluss auf CXCL12 Stimulation von humanen primären T-Zellen. (A) Anteil der polarisierten T-Zellen in der Abwesenheit oder Gegenwart von CXCL12 (10 oder 50 ng / ml). (B) Imaging Durchflusszytometrie Histogrammen, welche die Aufteilung der einzelnen, fokussierten Zellpopulation nach der Hell ausführliche Ähnlichkeitsindex daß vergleicht das Ausmaß der Co-Lokalisierung zwischen den phospho-ERM und Phalloidin-Färbungen in Abwesenheit von CXCL12 oder mit 10 ng / ml oder 50 ng / ml CXCL12. (C) Quantifizierung des Anteils der Zellen keinen Colokalisierung aufweist Perm und die Phalloidin Färbungen in T-Zellen stimuliert oder nicht mit CXCL12. (D) Quantifizierung der Mittelwerte der Similarity Index ± SE in jedem Zustand. *** P <0.001.Upload / 52.140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Einfluss der Aktin-Polymerisation auf T-Zell-Polarisation. Mit 100 ng / ml CXCL12 (A) F-Aktin Färbeintensität (obere Tafeln) und Kreisförmigkeit (untere Felder) von primären humanen T-Zellen mit Latrunculin A (500 nm, 30 min) oder DMSO behandelt und dann stimuliert für 8 min. ( B) Histogramm zeigt den prozentualen Anteil der polarisierten T-Zellen mit DMSO oder Latrunculin A nach 8 min Stimulation mit CXCL12 behandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 7. Angabe der PKCζ kinase-dead Mutante oder das N-terminale Mutante von Par6 Blöcke T-Zell-Polarisation nach CCL19 oder CXCL12 Behandlung. (A) Imaging Durchflusszytometrie Histogrammen, welche die Expression von GFP Intensität in nicht-transfizierten primären T-Zellen oder primäre T-Zellen co-transfiziert mit GFP und einem leeren Vektor (Kontrolle) oder die Kinase-dead Mutante PKCζ oder der N-terminalen Teil Par6 (B) Imaging Durchflusszytometrie Histogramme, die die Zirkularität Index des GFP-positive Zellpopulation exprimiert den verschiedenen Konstrukten auf das Grundniveau (NS: keine Stimulation). oder nach CCL19 oder CXCL12 Stimulation (100 ng / ml für 8 min ). (C) Quantifizierung der Anteil der morphologisch polarisierten T-Zellen, die die verschiedenen Konstrukte im Basisniveau oder nach CCL19 oder CXCL12 Stimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehension von dieser Figur.
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Discussion
Mit einem letzten Technologie der Bildgebung Durchflusszytometrie, eine schnelle und informative Gating-Strategie zur zellulären und molekularen Ereignisse, die von Chemokin-Stimulation induziert Analyse wird vorgestellt. Die Veränderungen der Zellmorphologie von Chemokin-Stimulation und die subzelluläre Verteilung von verschiedenen Proteinen während des Polarisationsvorganges hervorgerufen: Von einem einzigen Experiment kann man zwei Arten von Informationen zu erhalten. Interessanterweise wird die Beweis auch die Möglichkeit, eine große Anzahl von Zellen, die statistische Robustheit und relevante Analyse eines kleinen Bruchteil der gesamten Zellpopulation ermöglicht Analyse bereitgestellt. Wie berichtet, kann diese Technik auch für die Analyse von molekularen Umverteilung Ereignisse in Zusammenhang mit der immunologischen Synapse 12 verwendet werden. Zusätzlich wurde eine ähnliche Einrichtung bereits SDF1-stimulierte T-Zellen verwendet worden, aber keine Analyse des Grades der Kolokalisation zwischen zwei Markern wurde 13 versehen.
ObwohlDiese Technik kann somit für viele Zelltypen können anhaftenden Zellen nicht direkt analysiert werden und Zellen in Suspension müssen vor der Übernahme festgelegt. Zusätzlich zu diesen inneren Begrenzungen der Maschine ist es wichtig, die Zellen bei 37 ° C zu halten, wenn sie die Stimulierung. Die Temperatur ist in der Tat die richtige Taste T Zellpolarisation zu erzielen, da Zytoskelett Veränderungen wie Aktin-Polymerisation, die Formänderungen antreibt, sind sehr abhängig von der Temperatur. Unsere Versuche mit Latrunculin A behandelten Zellen zu bestätigen, dass die richtige Aktin-Umbildung von Chemokin Stimulation induziert ist tatsächlich entscheidend für eine Zelle in ihre vollständig polarisierten Zustand zu erreichen. Zusätzlich zu den Daten ein mit diesem Medikament vorgesehen ist, testeten wir auch die Abbildungs Durchflusszytometrie Technologie mit primären humanen T-Lymphozyten mit mutierten Proteinen, die den Par6 / PKCζ Signalweg inhibieren transfiziert. In Übereinstimmung mit unseren bereits veröffentlichten Ergebnisse 7 wird hier gezeigt, dass diese Polarität komplexer favors T-Zell-Polarisation.
Nach Chemokin Stimulation, T-Zellen verlieren ihre runde Morphologie, eine polarisierte Form anzunehmen. Wir haben die Kreisformparameter die genaueste, diese morphologischen Veränderungen quantifizieren zu sein gefunden. Jedoch sind auch andere Parameter Formänderungen beschreiben die Analyse-Software vorgeschlagen, wie das Seitenverhältnis oder die Elongatedness. Daher kann man leicht prüfen, den Beitrag einer bestimmten Signalwegs oder eines bestimmten Proteins in diesem Prozess.
In dieser Studie haben wir immer beobachtet, daß der Prozentsatz an Zellen, die eine morphologische Polarisation ist höher als die für die molekulare Polarisation. Dies zeigt, dass ein Bruchteil der Zellen, die eine Veränderung der Morphologie nicht vorstellen großen molekularen Umlagerungen der Marker übernehmen sucht. Dies kann aus der Tatsache, dass einige Zellen verlieren ihre runde Form, so dass sie eine geringere Kreisformindex, obwohl sie nicht zeigen deutlich eine leadin entsteheng Kante und eine Uropod. Diese teilweise polarisiert T-Zellen noch im Tor von morphologisch polarisierten T-Zellen fallen könnten ohne Vorlage offensichtlich molekularen Umlagerungen von typischen Markierungen. Außerdem müssen die Unterschiede in der Chemokin Meldeschwelle, die höher sein können für Marker Umverteilung als für Formveränderungen können auch diese Unterschiede zu erklären.
Es wird hier auch gezeigt, dass die HLA-ABC-Marker nicht polarisierten T-Zellen relokalisiert und es gibt keine Änderung in der Intensität der Färbung bei CCL19 Stimulation. Umgekehrt wird eine Bestätigung vorgesehen sein, dass F-Actin-Färbung steigt auf CCL19 Behandlung (1 und 2), wie bereits bekannt, da Chemokin Stimulation aktiviert Actinpolymerisation 5. Außerdem wird gezeigt, dass Aktinfilamente an der Vorderseite der polarisierten Zellen relokalisiert erhalten. Folglich wird die Hell-Detail Ähnlichkeitsindex, der das Ausmaß der Co-Lokalisierung misst zwischen jedem markers neigt dazu, auf CCL19-Stimulation zu verringern. Als Vergleich wird eine solche Analyse hier für den Grad des F-Actin-Kolokalisation mit phospho-EMR-Proteine, die von der Zellenfront ausgegrenzt ist. Der Prozentsatz der Chemokin-stimulierten T-Zellen, die F-Actin - MHC Klasse I Segregation ist viel niedriger als die für die F-Aktin - phospho-ERM (14% vs. 48%, jeweils), da F-Aktin relokalisiert vorn und Phospho-EMR-Proteine an der Rückseite des polarisierten T-Zellen, während die Verteilung der MHC-Klasse-I-Moleküle nicht durch Chemokin Stimulation beeinflusst. Dieser hell ausführliche Ähnlichkeitsindex können so systematisch verwendet, um die Verteilung der beiden Marker in polarisierten T-Zellen zu vergleichen. Daher ist diese Technik sehr gut geeignet, um den Grad der Co-Lokalisierung oder Co-Ausschluß von zwei verschiedenen Markierungen auf einer großen Anzahl von Zellen oder zu quantifizieren, potentiell auf seltene Ereignisse in einem breiten Zellpopulation vorhanden ist.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert und Louise Rimbault des Cochin Imaging Facility deutlich erkennen. Diese Arbeit wurde von Inserm, CNRS und Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe einem Gütezeichen) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
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