Abstract
세포는 과정이라고 편광 자신의 원형을 잃고으로 많은 단백질의 세포 내 현지화를 변경하여 자극을 케모카인에 응답합니다. 고전 이미징 기술은 이러한 현상을 연구하는데 사용되어왔다. 그러나 이러한 형태 및 세포의 수만 염색 공동 지역화 시간 소모적 정량화 하였다 많은 세포의 수동 요구를 취득. 여기서, 신속하고 강력한 방법은 사이토의 것과 현미경의 장점을 결합한 기술 계측법 촬상 흐름을 이용하여 상기 셀 수천 이루어진 샘플들에 이러한 현상을 연구하기 위해 설명된다. MHC 클래스 I 분자와 사상 액틴 용 CCL19 염색 자극 T 림프구를 사용하여, 게이팅 전략 동시에 형상 변화의 정도 및 CCL19 시그널링에 의해 영향 마커의 공동 국산화 정도를 측정하기 위해 제공된다. 또한,이 게이팅 전략은 observ 우리를 허용전자 CXCL12 자극 후 편광 T 세포 (전면) 사상 액틴과 (후면) 인산화 Ezrin-Radixin-Moesin (포스 ERM) 단백질의 분리. Par6 / 비정형 PKC 신호 전달 경로의 돌연변이 발현 억제제 및 약리학 적으로 액틴 중합 억제제 등이 기술은 두 개의 서로 다른 편광 소자에 차단 효과를 관찰하는데 유용 하였다. 따라서, 증거는이 기술은 단백질의 형태 학적 변화 및 재분배 모두를 분석하는 유용한 것을 알 수있다.
Introduction
케모카인 전문 위치 1에 세포를 유치 작은 수용성 단백질이다. 따라서, 그들은 조직에서 세포의 정확한 위치, 개발 및 생리에 중요한 기능에 참여하고 있습니다. 이 효과적인 면역 반응을 탑재 콘서트 행동 많은 다른 종류의 세포의 작용에 의존으로 면역 시스템은이 규칙에 예외는 아닙니다. 외부 항원이 검출 중화되기 전에 주어진 상태에서 하나의 면역 세포 유형의 특정 위치를 제어함으로써, 케모카인 장치들이 필요하다.
특히 T 림프구에서, 케모카인은 T 세포 운동성 2,3- 호의 결합시, 다양한 세포 내 신호를 유도하는, 특정한 표면 수용체 (칼슘 증가, ERK 인산화의 Rho GTP 아제 활성, 인테그린 친화 세포 골격 변화의 증가)에 결합한다. 세포 수준에서, 하나는 케모카인 유도 자극에 형태 학적 변화를 관찰 할 수있다.세포 모양에서 이러한 변화는 T 세포에서 특히 극적 : 혈류에 여행 할 때 휴식 T 세포가 구슬처럼 둥근 형태를 가지고있다. 앞에 리딩 에지 : 그러나, 염증 부위에 또는 림프 기관의 근방에서 케모카인의 존재를 감지 해주기 양극성 형태로 이루어진 전형적인 "핸드 미러"형태를 채택하는 T 세포의 모양을 변경하려고 그리고 다시 4에서 트레일 링 에지, 또는 uropod. 또한, 균체 내 성분은 마이그레이션을 유지 편광 T 세포의 두 대향하는 영역으로 분리 할 수있다. 예를 들면, 케모카인 자극 5 및 액틴 중합시 액틴 필라멘트 중합 증가 편광 된 T 세포 (2)의 전방에 축적한다. 한편, 이러한 피질 F 액틴 세포 골격에 세포막 링크 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM)과 가족의 인산화 된 단백질과 같은 여러 가지 단백질의 편광 uropod에 다시 문 지역화T 세포 (6). 흥미롭게도, 우리 등이 분극 처리는 T 세포의 이주를 위해 필요하다는 것을 보여 주었다. 실제로, 편광을 방해하는 어떤 치료는 세포의 운동성을 억제합니다. 예를 들어, 비정형 단백질 구성원의 활성의 억제는 C (PKC) 계열, 및 PKCζ PKCι 블록 T 세포와 수지상 세포 편광 7들의 이동성 스캔 과정 키나아제. T 세포 분극도의 Rho GTP 아제에 의해 조절된다. 우리는 최근에 기재된 Fam65b에서 RhoA 의한 단백질 활성의 조절이없이 Transwell 분석 6 마이그레이션 T 세포 형태의 변화 및 능력을 방해 것을 보여 주었다. 편광 세포 운동성위한 필수 단계로서, 케모카인은 응답의 메인 리드로 정량화 할 수있는 것이 결정적으로 중요하다. 세포 모양의 변화는 이전에 수동으로 8 측정 하였다. 그러나, 이러한 종류의 정량은 매우 시간 소모적이며, 그 보통 몇 그래서세포의 수만 고려된다.
여기서, 새로운 방법이 급속 케모카인 자극에 노출 된 T 림프구의 형상 변화의 정도를 정량화하기 위해 제시된다. 기술 계측법 촬상 유동은 케 모킨 자극 상이한 조건에서 효율적으로 편광 된 세포의 양을 정량화하는 유세포 및 현미경 (9)의 이점을 결합하는 데 사용된다 (특정 시약 / 장비의 도표 참조). 하나의 기술이 견고하게 측정 할 수있는 형태 학적 변화의 정량화에 또한, 케모카인 시그널링시 일부 단백질의 세포 내 위치 변화를 평가하는 것도 가능하다.
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Protocol
T 림프구의 1. 준비
- 10, 11 설명 된대로 기본 마우스 또는 인간 T 세포를 준비합니다.
- 3 × 106 세포 / ml - (2)의 농도에서 10 % 인간 AB 혈청 완전한 RPMI 배지에서 인간 T 세포를 배양.
주 : 배양 인간 T 세포의 많은 부분의 자발 분극을 유도 할 수 소 태아 혈청 (FCS) 대신에 인간 혈청을 사용. 이 기간 동안 언제든지 5 일 추가로 과정을 - 4 문화에서 이러한 세포를 보관하십시오. - 유사한 세포 밀도로 10 % FCS가 보충 된 완전 RPMI 배지에서 마우스 T 세포를 유지한다. 10 NG / ㎖ IL7의 존재하에 37 ℃에서 즉시 또는 다음 날, O / N에서 배양 한 후 사용한다.
- 완전한 RPMI 10 % FCS로 보충 된 CEM 인간 T 세포주를 배양.
2. 케모카인 자극
- 10 mM의 Hepe 보충 따뜻한 HBSS 매체에 실험 조건 당 5 × 10 5 세포를 씻으의. 몇 가지 실험을 위해, 2 μg의 pmaxGFP 8 μg의 한 pcDNA3.1 + (빈 벡터 제어), 죽은 PKCζ 키나아제, 또는 N- 말단 Par6 플라스미드로 전날 차 인간 T 세포를 공동 형질.
- 따뜻한 HBSS - 헤 페스 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁 (실험 조건 0.3 ㎖의 X 번호를 사용).
- 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 배포합니다.
주 : 따라서 단일 실험 조건에 대응 한 튜브를 0.3 ㎖의 HBSS - 헤 페스 매체에 5 × 105 세포를 포함 할 것이다. 일부 실험에서, 500 nM의 Latrunculin 또는 비히클 (DMSO)를 첨가하고, 케모카인 자극 전에 30 분 동안 세포를 배양한다. - 각 튜브에 10 NG / ㎖의 CCL19 또는 CXCL12 케모카인 (500)에 추가합니다.
참고 : 우리는 보통 10 사용 - 인간 T 세포에 대한 200 NG / ml의 케모카인을. CEM 세포는 CCL19 결합 CCR7 수용체를 발현하지 않습니다. 따라서, CEM 세포 만 CXCL12 자극에 응답 할 수있다. 500 N - 또한, 높은 케모카인 농도 ((300)를 사용하여g / ml)를 마우스 T 세포를 편광 시키. - 튜브를 수회 뒤집고 각각 일차 T 세포 또는 CEM을 8 또는 10 분 동안 37 ° C까지 수조에서이를 부화.
- 각 튜브에 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 PBS의 10 mM의 Hepes를 함유 따뜻한 용액 0.3 ㎖를 첨가하여 분극 처리를 중지. 튜브를 뒤집어 5 분 동안 37 ° C에서 그들을 부화.
3. 염색과
- 튜브 유동 세포 계측법하기 위해 마이크로 원심 튜브에서 세포를 전송합니다.
- 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 mM의 EDTA PBS 및 10 mM의 Hepes를 함유 RT 용액으로 완전히 관을 채운다.
- 4 분 동안 460 XG에 튜브를 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 PBS에서 5 % FCS를 함유 RT 용액 100 ㎕에 세포를 재현 탁.
- 멀리 빛, 소용돌이를, 각 튜브에 FITC-항 HLA-ABC의 5 μl를 추가하고, 실온에서 30 분 동안 그들을 품어.
- , PBS 5 %를 FCS를 함유 한 번 세포를 씻으한 번만 PBS와 ND.
- RT에서 : 다음 1 % BSA, 0.5 mM의 EDTA와 PBS에서 10 mM의 HEPES를 포함하는 용액으로 세포를 씻어 10 분 동안 품어, 500 ㎕의 1 % PFA를 추가합니다.
- 상층 액을 버리고 PBS는 0.2 % BSA, 0.1 % 사포닌, 0.5 mM의 EDTA 10 mM의 헤 페스 (투과성으로 버퍼)를 포함하는 용액으로 완전히 튜브를 입력합니다.
- 이 매체에 두 번 세포를 씻으십시오.
- 배지를 제거하고 세포 펠릿을 해리하도록 와류 튜브 플립.
- 각각의 튜브에 방지 P-ERM 항체의 100 희석, 소용돌이를하고 실온에서 30 분 동안 품어 : 및 / 또는 1 0.25 ㎍ / ㎖의 TRITC-Phalloidin의를 추가합니다.
- 투과성으로 버퍼와 세포를 씻으십시오. 형광 이차 항체로 인큐베이션 필요한 경우.
- 200 μl의 PBS에 세포를 재현 탁하고 마이크로 원심 튜브로 전송.
참고 : 세포는 획득을위한 준비가되어 있습니다. 튜브에 200 μL의 최대 총 부피를 유지하면서 선택적으로, 최종 1 %로 농축시켜 추가 PFA세포는 추가 처리를 위해 당일 사용되지 않아야하는 경우, 순서의 염색 농도를 유지한다.
4. 이미지 수집 및 분석
- 장치 (특정 시약 / 장비의 표 참조)로 전환하고 제조업체의 지침에 따라 자체를 교정 할 수 있습니다.
참고 : INSPIRE 소프트웨어는 40 배 목표 (0.75 NA)로 사용되었다. IDEAS 3.0 소프트웨어는 모든보고 정량화에 사용되었다. - 미래의 실험 템플릿에 저장할 수 있습니다 획득 일련의 창을 준비합니다. RMS 그라데이션 값을 정량화 히스토그램을 그립니다. RMS 그라데이션 막대 그래프에서 선택한 "초점에서"인구에서, 지역의 히스토그램에서 "단일 셀"인구 경계를 정하다. 마이크로 원심 튜브가 기기에 삽입되면, 각 셀에 대한 게이트 레이저 파워를 조정하고 5000 T 림프구를 취득.
- 부드러운 아이디어도자기, 인수 파일을 열고 각 셀에 대해 얻은 밝은 필드 이미지의 그라데이션 RMS 값의 값을 표시하는 막대 그래프 (채널 1)을 만듭니다. 57 위의 RMS에게 그라데이션 값을 나타내는 세포를 고려 RMS 그라데이션 히스토그램에 게이트를 그립니다.
참고 : RMS 구배 분석 초점면에있는 경우에만 T 림프구에서 고려 허용합니다. 우리는 (57)에 우수한 그라데이션 RMS 값을 나타내는 각각의 세포는 초점면에 있고, 정확하게 고려 될 수 있음을 경험적으로 결정했다. - 분석 / 마스크 메뉴에서, 2 픽셀의 침식 시야 이미지 M01,의 형태 마스크에서 (M01,2)을 침식라는 새로운 마스크를 만들 수 있습니다. 그런 다음, 분석 / 침식 (M01,2) 마스크 계산 영역의 새로운 기능을 만들 메뉴를 갖추고 있습니다. 게이트 이전에 선택된 셀로부터,이 새로 만든 마스크를 이용하여 상기 셀 영역을 나타내는 히스토그램을 연다.
참고 :에 의해 사용할 수있는 형태의 마스크디폴트는 셀의 실제 크기보다 훨씬 더 크다. 따라서,이 화소로까지 침식 더 정확하다. - 교정 구슬과 이물질 (작은 지역)과 이중선 (대형 지역)을 제외한 개별 T 세포에 게이트를 그립니다. 각 인수에서이 게이트를 조정합니다.
주 : 셀 크기에 변동이 게이트의 위치에 영향을 미칠 것이다. 마우스 T 세포가 스스로 CEM 세포보다 작은 인간 T 세포보다 작은 같이, 각 세포 유형의 면적의 크기에 비례한다. - 이전 단계에서 게이트 된 하나에 초점 세포를 감안하면, 팔로이 딘의 원시 최대 픽셀의 함수로 HLA-ABC 염색에 원시 최대 픽셀의 (채널 2, X 축)로 구성되는 점 음모를 엽니 다 염색 (채널 4, Y 축). 흠 또는 포화 형광 이벤트를 제외 게이트를 만듭니다. 원시 최대 HLA-ABC를위한 픽셀 (채널 2) 팔로이 딘 (채널 4)의 염색을 보여주는 열기 두 히스토그램.
- 분석 / 마스크 메뉴, CREAT에서2 픽셀의 침식 HLA-ABC 염색 된 세포 (채널 2)의 형태 마스크에서 (M02,2)을 침식라는 개 새로운 마스크. 그런 다음, 분석 / 침식 (M02,2)에 계산 된 원형 매개 변수로 구성된 새로운 기능을 생성, 메뉴 특징.
참고 :이 매개 변수는 원에서 셀 모양의 편차를 측정합니다. 따라서, 완전한 원형 T 세포는 낮은 원형도 지수를 나타낼 것이다 편광 신장 세포 반면 높은 원형도 값을 가질 것이다. - 이어서, 이전 셀로부터 게이트 된 원형 형상의 값을보고 다른 히스토그램을 생성한다. 직접 각각의 개별 셀에 대한 원형도 값에 따라 개인 합초 세포군의 분포를 플롯이 히스토그램을 사용한다.
- 비 - 자극 된 세포에 대한 히스토그램의 형상을 살펴보면, 원형 제한값까지 낮은 원형도 값에서 시작하여, 편광 된 셀을 그리 게이트 여기서 비 자극 된 세포의 대부분플롯됩니다. 게이트 인구 중 편광 세포의 비율에 대한 통계의 디스플레이를 확인합니다 (%는 정문).
참고 : 우리는 13 아래 원형 인덱스 값이 게이트를 설정했습니다. - 세포에서 액틴 염색 편광보고하기 위하여, HLA-ABC 염색 (채널 2) 및 팔로이 딘 염색을 비교 밝은 세부 비슷한 R3 값에 대한 히스토그램을 플롯 (채널 4).
주 :이 기능의 더 큰 값이 더 적 착색 개의 중첩이다. - 이전과 같은 게이팅 전략을 사용하여, 편광 액틴 염색 세포의 백분율을 나타낸다 분리 염색 비 자극 된 세포에 게이트 플롯.
- 완료되면, MHC 클래스 I 및 팔로이 딘 염색에 함께 SD ± 모든 세포의 원형과 비슷한 인덱스의 평균값으로 편광 된 세포의 비율의 분포에 편석을 나타내는 세포의 비율은 corresp에 나타낸다onding 통계 패널.
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Representative Results
여기에서 선택된 첫 번째 예 CCL19 자극 인간 차 T 림프구의 용도에 관한 것이다. 그러나 동일한 전략은 기본 마우스 T 세포, T 세포 라인 또는 케모카인 자극에 응답하여 임의의 다른 세포 유형과 함께 사용될 수있다. 여기에 제시된 게이팅 전략 포커스 이벤트 후, 단일 세포를 선택하는 일련의 윈도우를 포함한다. (그림 1) 또는 CCL19 자극 (그림 2) T 림프구 휴식의 MHC 클래스 I HLA-ABC와 사상 굴지 : 마지막으로 형광 강도의 범위는 두 개의 마커 여기에 예를 들어옵니다.
첫째, 원형 인덱스는 미처리 (도 1) 또는 CCL19 자극 (도 2) T 림프구로 측정된다. 휴식 세포가 높은 진원도 인덱스의 값이 큰 단일 피크를 가지고 있다는 사실은 대부분의 세포가 반올림에 가까운 있음을 나타냅니다. 그러나, CCL19 자극는 O 외관을 유도하는 것이 분명낮은 원형 인덱스 세포의 FA 초 모집단. 이 하위 집단은 편광 형태를 채택 세포를 포함한다. HLA-ABC 및 F 액틴 염색 간의 밝은 세부 비슷한 인덱스를 나타내는 경우 또한, 사람은 일부 셀들이 모두 마커 공동 편재 정도가 낮다 나타내는, CCL19 치료시이 지수의 값의 저하를 나타내는 것을 관찰 할 수있다 . 도트 플롯 이전에 제시된에서 흥미롭게도, 사람. 시야 화상과 수행의 염색 각 화상 이루어진 세포의 사진을 얻기 위해 임의의 특정 점에 커서를 위치하므로 CCL19의 예로는 T 자극 제시도 3 수 비 편광 (그림 3A) 또는 편광 (그림 3B) 세포의 게이트에 빠질 림프구. 하나는 분명히 두 개체군 사이의 형태의 차이를 시각화 할 수 있습니다. 그림 1에서 원형 막대 그래프 아래의 통계 테이블에서 2는 하나의 부재 또는 CCL19의 존재 (도 3c)에 편광 된 게이트에 분류 세포의 백분율을 플롯 할 수있다. 예상대로 케모카인 자극 (11.2 % 내지 50.6 %까지) 편광 된 T 세포의 비율이 증가하는 것이 명백하다. 하나는 두 조건 (도 3D)에서 얻은 전체 세포 집단의 평균 원형도 색인을 플롯 할 수있다. CCL19 자극이 지수의 하락을 유도한다. 절반 만 세포 분극화 그러나, CCL19 자극시 관찰 평균 원형도 지수의 변화는 작다.
마찬가지로, 그림 4는 HLA-ABC와 F - 굴지 모두의 염색은 (그림 4A)를 수행하거나 (그림 4B)을 colocalize하지 않는 한 CCL19 자극 세포의 예를 나타냅니다. 도 1 및도 2에 도시 밝은 세부 유사성 아래 히스토그램 통계 테이블에서, 하나는 비율을 얻을 수있다HLA-ABC 및 F 액틴 간의 공동 지역화 매우 낮은 정도를 나타내는 셀을 나타내는 1.5 이하 인덱스 값을 나타내는 세포.도 4c 보여준다 CCL19 자극시이 게이트 증가 빠진다 세포 분획 ( 3.4 %)에서 13.9 %이다. 각각의 개별 셀에 대한 색인 값을 수집 한 조건은 모두 (도 4d)에서 얻은 전체 세포 집단의 평균 세부 비슷한 밝은 색인을 플롯 할 수있다. CCL19 그러나, 이전과 같은 이유에 의해, 변화가 작고, 지수의 저하를 유도한다. 공동 현지화 F - 굴지 셀의 한 극에 F - 굴지의 클러스터링에 주로 기인 - 해당 셀의 이미지를보고함으로써, HLA-ABC에서이 강하가 나타납니다. 반대로, HLA-ABC MHC 클래스 I 분자의 세포 내 분포는 크게 CCL19 자극에 의해 영향을받을 것 같지 않습니다.
즉, 우리가 다음에 더 테스트하기로 결정 이유입니다공지 된 두 마커 (F 액틴 및 포스 ERM)를 분석하여 방법론은 케모카인 자극 T 세포의 자극에 대향하는 분리. (50 NG / ㎖ CXCL12 자극의 8 분 후, 5.95 % 내지 79.10 % 편광 셀)보다도 같은 게이팅 전략도 5a에 정량화 CXCL12 자극 인간 T 세포는 강하게 편광. F - 굴지 및 포스 ERM은 CXCL12 자극 후 덜 colocalize 의미도 5B와 5D와 같이 이러한 조건에서, 평균 밝은 상세 유사성 지수의 강한 감소가있다. 예상 한 바와 같이, 여기에서 선택된 마커의 편석을 나타내는 세포의 비율은 이전에 연구 된 것 (14 %,도 4C)과 비교하여 (48 %,도 5C) 높다. 따라서, 각 조건의 평균 유사성 지수의 하락은 (그림 5D) 더 분명하다. 따라서, 여기에 제시된 촬상 유세포 기술은 SU이다itable 다른 설정의 두 가지의 염색 공동 현지화의 정도를 정량화한다.
마지막으로, 우리가 어느 정도에 약간의 세포 골격 요소 또는 케모카인의 자극에 따라 T 세포 형태의 변화에 영향을 미치는 것으로 알려진 신호 전달 경로의 교란을 설명하기로 결정, 유동 세포 계측법 영상에 의해 측정 될 수있다. T 조절 세포는 제 A (도 6a) latrunculin 액틴 방해 약물로 전처리 일부를 비교 하였다. 세포 유동 세포 계측법 이미징에 의해 형광 팔로이 딘 염색 및 분석, CXCL12 자극했다. F - 굴지 염색의 원료 최대 픽셀 강도를 나타내는 막대 그래프는 두 세포 집단 (그림 6A, 상단)에 대해 표시됩니다. 액틴 필라멘트 향해 latrunculin (A)의 절단 활성에서 예상대로, 팔로이 딘 염색 강도 DMSO 비히클 (왼쪽 패널)으로 처리 T 림프구 대조군에 비해 이들 세포 (오른쪽 패널)에서 더 낮다. 또한, A-TR을 latrunculin어갈 T 세포가 대조군 세포 (도 6A, 하단)보다 둥글게 유지 나타내는 큰 원형 인덱스를 나타낸다. 이것은 형태 적 변화를 나타내는 세포의 비율을 측정하는 히스토그램에 설정된 게이트에 의해 정량화 될 수있다. 대조군 세포의 32 %가이 상태에서 편광 얻을 수 있지만, 처리 된 T를 latrunculin의 10 %가 전시 모든 형태의 변화 (그림 6B)를 림프구. 따라서, 하나의 현상이 세포 골격의 일부 요소들의 잠재적 인 효과를 연구 할 때 기술 계측법 촬상 흐름 형태 학적 변형의 차이를 측정하기가 적합 함을 여기에 도시되어있다.
둘째,이 방법으로 다수의 셀의 취득은 소수로서 존재하는 세포의 작은 서브 세트를 신속하게 분석 할 수있는 가능성을 연다. 분석은 특히 T 세포의 공동 - 트랜 동작에 제한이있는 경우도 7에서, 예를 제시극성 복잡한 Par6 / PKCζ의 지배적 인 부정적인 돌연변이 인코딩 플라스미드와 함께 GFP와 에디션. 비 형질 감염된 세포에 해당하는 히스토그램은 특히 관련 GFP + T 세포 (그림 7A, 왼쪽)에 게이트에 우리를 허용했다. 채널 (2)의 형광 강도의 분포를 막대 그래프로서 측정 정량화 GFP의 강도는 실제로 전체 세포 집단의 작은 부분 만이 (도 7A)를 형질 감염되었음을 보여준다. 이들 형질 감염된 세포의 형태 학적 편광도이어서 GFP + 세포 (도 7B)의 원형 만 지수를 측정하여 정량 하였다. 원형도의 낮은 값을 보이는 T 세포에 대한 추가 게이트는 각각의 조건 (그림 7C)의 편광 세포의 비율의 추정을 허용했다. 결과 Par6 / PKCζ 신호 경로의 기능 중단은 T 세포 억제 polarizati 보여우리의 이전 연구 결과 7 라인에서 모두 CCL19과 CXCL12 케모카인에 의해 유도합니다.
그림 기본 인간 T 세포 1. 대표 비 자극 염색 결과. 왼쪽 패널 (채널 1) 명 시야 이미지에 M01 마스크 계산 된 그라데이션 RMS의 히스토그램 재분할을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 이전 줄거리 게이트 초점 세포의 시야 화상에 기초하여이 픽셀을 침식 M01 마스크의 영역 (채널 1)을 나타낸다. 중앙 패널은 개인의 HLA-ABC와 Phalloidin의 염색과 (각각 채널 2, 4) 중 도트 플롯 (왼쪽 패널) 나 히스토그램 (중간과 오른쪽 패널)로 모두의 원시 최대 픽셀 값을 보여, IN- 이전 단계에서 선택한 셀을 초점을 맞 춥니 다. 올바른 염색 개인에 초점이 셀 인구에서, HLA-ABC와 Phalloidin의 염색에 사이의 유사성의 정도를 보여주는 HLA-ABC 염색 (왼쪽 패널)와 밝은 상세 유사성 R3 기능 (오른쪽 패널)의 2 픽셀의 침식 M02 마스크에 원형 기능을 계산 . 이 두 가지 최신 플롯의 경우, 인구의 재분할을 나타내는 통계 아래 표에 표시됩니다 (게이트 %가, 기능, SD의 의미). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 그림 1과 8 분 200 NG / ㎖ CCL19 자극 기본 인간 T 세포에 대한 대표적인 염색 결과 패널 배치 및 게이팅 전략은 동일합니다.JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CCL19에 의해 자극 T 림프구의 형태 학적 상태의 정량화. (A, B)도이 외부 또는 "편광"게이트의 세포로서는, CCL19의 부재하에 수득 된 편광 된 T 세포의 비율을 나타내는 각 (C) 히스토그램. (도 1 -) 또는 200 NG와 / CCL19 ml의 (도 2, +)에서 개별적인 ± SE 원형 인덱스의 평균값을 나타내는 (D) 히스토그램 부재시 합초 세포 집단. - CCL19 또는 존재 (+) (). *** P <0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HLA-ABC와 팔로이 딘 시약 염색 사이의 공동 현지화의 정도 그림 4. 정량화. (A, B)도 2 외측 또는 밝은 세부 각각 비슷한 히스토그램에서 "colocalized 없음"게이트로부터 셀들의 예를 도시한다. (C) un- 두 마커 사이의 공동 현지화를 나타내지 않는 T 세포의 백분율을 나타내는 히스토그램 (-) 자극. 또는 CCL19 자극 (+) 상태 개별에서 SE ± 비슷한 인덱스의 평균값을 나타내는 (D) 히스토그램 부재시 합초 세포 집단 - CCL19 또는 존재 (+) (). *** P <0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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F - 굴지의 그림 5. 분석 - 인간의 기본 T 세포의 CXCL12 자극에 따라 포스 ERM 제외. CXCL12 (10 또는 50 NG / ㎖)의 부재 또는 존재하에 편광 T 세포 (A) 백분율. (B) 밝은 세부 비슷한 인덱스에 따른 개인 합초 세포 집단의 재분할을 나타내는 히스토그램 계측법 이미징 흐름 어떠한 공동 현지화를 나타내지 않는 세포의 비율 즉 CXCL12의 부재하에 또는 10 NG / ㎖ 또는 50 NG / ㎖ CXCL12와 포스 ERM 및 팔로이 딘의 염색 간의 공동 국산화 정도를 비교한다. (C) 부량 파마와 T 세포의 염색에 팔로이 딘은 자극 여부와 CXCL12. 각 조건에서 ± SE 비슷한 인덱스의 평균값 (D) 부량. *** P <0.001./ 52140 / 52140fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 "을 업로드>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
T 세포 편광에 액틴의 중합 그림 6. 효과. (A) F 액틴 다음 Latrunculin A (500 nM 내지 30 분) 또는 DMSO로 처리하고 일차 인간 T 세포의 염색 강도 (상부 패널) 및 원형도 (하부 패널) 8 분 동안 100 ng의 / ㎖ CXCL12 자극. ( B) CXCL12 자극의 8 분 후 DMSO 또는 Latrunculin으로 처리 편광 T 세포의 비율을 보여주는 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 PKCζ 키나제 죽은 돌연변이 또는 CCL19 또는 CXCL12 치료 후 Par6 블록 T 세포 편광의 N 말단 돌연변이 7. 식입니다. 비 형질 일차 T 세포 또는 일차 T 세포 공동 - 형질 GFP 및 빈 벡터 (컨트롤) 또는 PKCζ의 키나제 죽은 돌연변이 또는 함께 N 말단에게에서 GFP의 발현 강도를 나타내는 히스토그램 계측법 (A) 영상 흐름, Par6의 부분 (B) 기저 수준에서 상이한 구조를 발현 GFP 양성 세포 집단의 원형도 지수를 나타내는 히스토그램 계측법 이미징 흐름 (NS : 아니오 자극). 또는 CCL19 또는 CXCL12 자극 (후에 100 ng를 / ㎖ 8 분간 ). (C) 기초 수준에서 또는 CCL19 또는 CXCL12 자극 후 다른 구조를 표현하는 형태 학적으로 편광 T 세포의 비율의 정량화. 여기를 클릭하십시오는 ver의 큰 볼이 그림의 시온.
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Discussion
계측법, 신속하고 유익한 게이팅 전략 케모카인 자극에 의해 유도 된 세포 및 분자 이벤트를 분석하는 촬상 흐름의 최신 기술을 사용하는 것이 제시된다. 케모카인 자극 분극 공정 동안 서로 다른 단백질의 세포 내 분포에 의해 유도 된 세포 형태의 변화 : 하나의 실험에서, 하나는 정보의 두 가지 유형을 얻을 수있다. 흥미로운 증거가 통계적 견고성과 전체 세포 집단의 작은 부분의 분석이 가능 관련된 다수의 셀을 분석 할 수있는 가능성이 제공된다. 보고 된 바와 같이,이 기술은 또한 면역 시냅스 (12)의 맥락에서 분자 재분배 이벤트를 분석하는 데 사용될 수있다. 또한, 유사한 셋업 이미 sdf1로 자극 된 T 세포에 사용되었지만 두 마커 사이의 공동 편재 정도 더 분석은 (13)이 제공되지 않았다.
비록따라서,이 기술은 많은 세포 유형에 적합 할 수 있고, 부착 세포를 직접 분석 할 수없고, 현탁액 중의 세포는 앞서 획득을 고정 할 필요가있다. 이러한 시스템의 본질적인 한계 이외에, 그것은 그것들을 자극 할 때 37 ℃에서 세포를 유지하는 것이 중요하다. 같은 모양의 변화를 구동 액틴의 중합, 같은 세포 골격 변화, 온도에 크게 의존하기 때문에 온도는 참으로 적절한 T 세포 편광을 달성하는 데 매우 중요한 역할을합니다. latrunculin 처리 된 세포와 우리의 실험은 세포가 완전 편광 상태를 달성하기 위해 케모카인의 자극에 의해 유도 적절한 굴지의 리모델링이 참으로 중요 있는지 확인합니다. 약물이 여기에 제공된 데이터에 더하여, 우리는 또한 Par6 / PKCζ 시그널링 경로를 저해 돌연변이 단백질로 형질 차 인간 T 림프구와 촬상 유세포 기술을 테스트했다. 지속적으로 우리의 이전에 발행 된 결과 7, 그것은 여기에 표시되는이 극성 복합 FT 세포 편광 avors.
케모카인 자극되면, T 세포는 편광 된 형상을 채택하도록 이들 둥근 형태를 잃는다. 우리는 그 형태 학적 변화를 정량화하기 가장 정확한 될 수있는 원형 매개 변수를 발견했다. 그러나, 모양의 변화를 설명하는 다른 매개 변수와 같은 화면 비율 또는 Elongatedness로, 분석 소프트웨어에 의해 제안된다. 따라서, 용이 한이 프로세스의 특정 신호 전달 경로의 기여도 또는 특정 단백질을 시험 할 수있다.
본 연구에서 우리는 항상 형태학 편광을 나타내는 세포의 비율은 분자 편파보다 높다는 것을 발견했다. 이 마커의 큰 분자 재배포를 표시하지 않는 형태에 변화를 채택 세포의 일부가 연구 있음을 나타냅니다. 이것은 그들이 분명 지도자로 표시되지 않지만 그들은 낮은 원형 인덱스를 나타낼 수 있도록 일부 세포가 둥근 모양을 잃고 있다는 사실에서 발생할 수g 가장자리와 uropod. 이 부분적으로 편광 T 세포는 여전히 전형적인 마커의 명백한 분자 재배포를 제시하지 않고 형태 학적으로 편광 T 세포의 게이트에 빠질 수 있습니다. 마커는 이러한 차이를 설명 할 수있는 형상 변경에 대한보다 재배포 또한, 케모카인 신호 임계 값에 차이가 높을 수 있었다.
또한 HLA-ABC 마커 편광 된 T 세포에서 relocalized되지 않고 CCL19 자극이 염색시의 강도에 변화가없는 것으로 여기에 도시되어있다. 역으로, 확인이 여기에 제공되는 치료시 CCL19 F 액틴 염색 증가한다 (도 1 및 2) 케모카인 자극 액틴 중합 (5)를 기동 때문에 이미 공지 된 바와 같이. 또한, 편광 된 세포의 전면 relocalized 되든지 액틴 필라멘트를 나타낸다. 두 엄마 사이에 공동 현지화의 정도를 측정 결과적으로, 밝은 상세 유사성 지수rkers는 CCL19 자극시에 감소하는 경향이있다. 비교를 위해, 이러한 분석은 전방 셀로부터 배제 얻을 포스 ERM 단백질과 공동 지역화 F 액틴 정도 여기 제공된다. F - 굴지 전시 케모카인 자극 된 T 세포의 비율 - F - 굴지 앞에 relocalizes 이후 포스 ERM (14 % 대를 각각 48 %,) - MHC 클래스 I의 분리는 F - 굴지에 대한보다 훨씬 낮은 MHC 클래스 I 분자의 재분할이 케모카인 자극의 영향을받지 않는 반면, 편광 된 T 세포의 후면 포스 ERM 단백질. 밝고 세부 비슷한 인덱스 따라서 체계적 편광 T 세포에서 두 마커의 분포를 비교하기 위해 사용될 수있다. 따라서,이 기술은 다양한 세포 집단에 존재하는 희소 사건에 잠재적으로 큰 셀의 개수 나, 위치 파악에 공동 또는 두 개의 상이한 마커의 공동 - 배제의 정도를 정량화하는 것은 매우 적합하다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 크게 피에르 Bourdoncle, 토마스 길버트와 코친 이미징 시설의 루이스 Rimbault을 인정합니다. 이 작품은 INSERM, CNRS와 리그 국립 contre 르 암 (퀴프의 labellisée)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
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