Abstract
Las células responden a la estimulación de quimiocinas por la pérdida de su forma redonda en un proceso llamado polarización, y mediante la alteración de la localización subcelular de muchas proteínas. Las técnicas clásicas de imágenes se han utilizado para estudiar estos fenómenos. Sin embargo, se requiere la adquisición manual de de muchas células, seguido de tiempo cuantificación de la morfología y la co-localización de la tinción de decenas de células. Aquí, un método rápido y potente se describe para estudiar estos fenómenos en muestras compuestas por varios miles de células por medio de un flujo de imágenes citometría de tecnología que combina las ventajas de un microscopio con los de un citómetro. El uso de linfocitos T estimulados con CCL19 y tinción para las moléculas MHC de clase I y actina filamentosa, una estrategia gating se presenta para medir simultáneamente el grado de alteraciones de la forma y el grado de co-localización de los marcadores que se ven afectados por la señalización de CCL19. Por otra parte, esta estrategia gating nos permitió OBSERVe la segregación de actina filamentosa (en el frente) y fosforilados proteínas Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (en la parte trasera) en las células T polarizadas después CXCL12 estimulación. Esta técnica también es útil para observar el efecto de bloqueo en la polarización de dos elementos diferentes: la inhibición de la polimerización de la actina por un inhibidor farmacológico y expresión de mutantes de la / PKC atípicas vía de señalización Par6. De este modo, se muestra evidencia de que esta técnica es útil para analizar tanto las alteraciones morfológicas y redistribuciones de proteínas.
Introduction
Las quimioquinas son pequeñas proteínas solubles que atraen a las células a ubicaciones especializados 1. Por lo tanto, participan en la correcta posición de las células en los tejidos, una función crucial en el desarrollo y la fisiología. El sistema inmunológico no es una excepción a esta regla, ya que se basa en la acción de muchos tipos de células diferentes que actúan en concierto para montar una respuesta inmune efectiva. Mediante el control de la ubicación específica de un tipo de célula inmune en un estado dado, quimiocinas son pre-requerido antes de antígenos extraños pueden ser detectados y neutralizados.
En los linfocitos T, en particular, las quimioquinas se unen a receptores específicos de la superficie que, tras el acoplamiento, provocan muchas señales intracelulares (altura de calcio, la fosforilación de ERK, la activación de Rho GTPasas, el aumento de las integrinas de afinidad y alteraciones del citoesqueleto) que favorecen la motilidad celular T 2,3. A nivel celular, se puede observar alteraciones morfológicas provocados a la estimulación de quimiocina.Estos cambios en las formas de células son especialmente dramática en las células T: células T en reposo tienen una morfología redonda de cordón cuando se viaja en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la detección de la presencia de quimiocinas en sitios de inflamación o en la proximidad de los órganos linfoides se va a cambiar la forma de las células T que ahora adoptar una morfología típica de "espejo de mano" que consiste en una forma bipolar: un borde de ataque en la parte delantera y un borde de salida, o urópodo, en la parte posterior 4. Además, los componentes intracelulares pueden segregar en estas dos regiones opuestas de una célula T polarizada para sostener la migración. Por ejemplo, los filamentos de actina de polimerización aumenta tras la estimulación de quimiocina 5 y actina polimerizada se acumula en la parte delantera de una célula T polarizada 2. Por otro lado, varias proteínas, tales como proteínas fosforiladas de la Ezrin-radixina-Moesin (ERM) de la familia que unen la membrana plasmática a la cortical del citoesqueleto de actina F, re-localizar en el urópodo de polarizadoLas células T 6. Curiosamente, nosotros y otros han demostrado que se requiere este proceso de polarización para la migración de células T. De hecho, cualquier tratamiento que interfiere con polarización inhibir la motilidad celular. Por ejemplo, la inhibición de la actividad de los miembros de la proteína atípica quinasas C (PKC) de la familia, la polarización celular y PKCζ PKCι bloques de T y su proceso de escaneo migratorio de las células dendríticas 7. Polarización de las células T también está regulada por Rho GTPasas. Hemos demostrado que la modulación de la actividad de RhoA por la proteína Fam65b descrito recientemente interfiere con los cambios en la morfología de células T y su capacidad para migrar en un ensayo Transwell 6. Como la polarización es un paso requisito previo para la motilidad celular, por lo que es crucial para poder cuantificar como una lectura principal de las respuestas a quimiocinas. Alteraciones de la forma de la célula se midieron previamente manualmente 8. Sin embargo, este tipo de cuantificación es muy lento, de modo que por lo general sólo unos pocosdecenas de células se toman en cuenta.
Aquí, un nuevo método se presenta para cuantificar rápidamente el grado de alteraciones de la forma de los linfocitos T expuestos a quimioquinas estimulación. Un flujo de imágenes citometría de la tecnología (véase la Tabla de reactivos específicos / Equipment) se utiliza, que combina las ventajas de un citómetro de flujo y un microscopio 9 para cuantificar de manera eficiente la cantidad de células polarizadas en diferentes condiciones de estimulación de quimioquinas. Además de la cuantificación de las alteraciones morfológicas que uno puede medir la firmeza con esta tecnología, también es posible evaluar los cambios en la localización subcelular de algunas proteínas sobre la señalización de quimiocinas.
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Protocol
1. Preparación de los linfocitos T
- Preparar ratón primaria o células T humanas como se describe 10,11.
- Cultivar las células T humanas en medio completo RPMI con 10% de suero humano AB a una densidad de 2 - 3 x 10 6 células / ml.
NOTA: El uso de suero de ternera fetal (FCS) en lugar de suero humano puede provocar la polarización espontánea de una gran fracción de células T humanas en cultivo. Mantener estas células en cultivo durante 4 - 5 días, y otro proceso en cualquier momento durante este período. - Mantener las células T de ratón en medio completo RPMI suplementado con 10% de FCS a una densidad celular similar. Utilice inmediatamente o al día siguiente, después de un cultivo O / N a 37 ° C en presencia de 10 ng / ml IL7.
- Cultivar la línea celular T CEM humana en RPMI completo suplementado con 10% de FCS.
2. Estimulación de quimioquinas
- Lave 5 x 10 5 células por condición experimental en medio HBSS caliente suplementado con 10 mM Hepes. Para algunos experimentos, co-transfectar células T humanas primarias el día anterior con 2 g pmaxGFP y 8 g pcDNA3.1 + (vector vacío, control), PKCζ quinasa muerta, o plásmidos PAR6 N-terminales.
- Resuspender el sedimento celular en medio cálido HBSS-Hepes (usar 0.3 ml x número de condiciones experimentales).
- Distribuir las células en 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
NOTA: Por lo tanto, un tubo que corresponde a una sola condición experimental contendrá 5 x 10 5 células en 0,3 ml de medio HBSS-Hepes. Para algunos experimentos, añadir 500 nM latrunculina A o vehículo (DMSO) y se incuban las células durante 30 min antes de la estimulación de quimiocinas. - Añadir de 10 a 500 ng / ml o CCL19 de quimioquinas CXCL12 en cada tubo.
NOTA: Utilizamos generalmente 10-200 quimiocina ng / ml para las células T humanas. CEM células no expresan el receptor CCR7 que une CCL19. Por lo tanto, las células CEM sólo serán capaces de responder a una estimulación CXCL12. Por otra parte, utilizar concentraciones más altas de quimioquinas (300-500 ng / ml) para polarizar las células T de ratón. - Voltear los tubos varias veces e incubar en un 37 ° C baño de agua durante 8 o 10 minutos para que las células T primarias o CEM, respectivamente.
- Detener el proceso de polarización mediante la adición a cada tubo 0,3 ml de una solución caliente que contiene 2% de paraformaldehído (PFA) y Hepes 10 mM en PBS. Voltear los tubos y los incuban a 37 ° C durante 5 min.
3. Las tinciones
- Transferencia de las células de los tubos de microcentrífuga a citometría de flujo tubos.
- Llenar completamente los tubos con una solución de RT que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA), EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM en PBS.
- Centrifugar los tubos a 460 g durante 4 min.
- Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de una solución a TA que contiene 5% de FCS en PBS.
- Añadir 5 l de FITC-anti-HLA-ABC en cada tubo, vórtice, y los incuban durante 30 min a RT, lejos de la luz.
- Lavar las células una vez con PBS que contiene 5% de FCS, unand una vez con PBS solo.
- En RT: añadir 500 l 1% PFA, incubar durante 10 min, a continuación, lavar las células con una solución que contiene 1% de BSA, EDTA 0,5 mM y HEPES 10 mM en PBS.
- Descartar el sobrenadante, llenar los tubos completamente con una solución de PBS que contenía 0,2% de BSA, 0,1% de saponina, EDTA 0,5 mM y Hepes 10 mM (tampón de permeabilización).
- Lavar las células dos veces en este medio.
- Voltear los tubos para eliminar el medio y Vortex a disociar el sedimento celular.
- Añadir 0,25 g / ml TRITC-faloidina y / o una dilución 1: 100 de anticuerpo anti-P-ERM a cada tubo, vórtice ellos y se incuba durante 30 min a TA.
- Lavar las células con el tampón de permeabilización. Incubar con un anticuerpo secundario fluorescente si es necesario.
- Resuspender las células en 200 l de PBS y transferirlas a tubos de microcentrífuga.
NOTA: Las células están listas para la adquisición. Alternativamente, mientras se mantiene un volumen máximo total de 200 l por tubo, añadir concentrado PFA a una final 1%concentración con el fin de preservar las tinciones si las células no están para ser usados el mismo día para su posterior procesamiento.
4. Las imágenes Adquisición y Análisis
- Encienda el aparato (véase la Tabla de específico Reactivos / Equipo) y se deja calibrar sí de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: El software INSPIRE se utilizó con un objetivo de 40X (0,75 NA). El software IDEAS 3,0 se utilizó para todos los cuantificaciones reportados. - Preparar una serie de ventanas de adquisición que se pueden guardar en una plantilla para futuros experimentos. Dibuja histogramas que cuantifican los valores de gradiente de RMS. De la población "In Focus", seleccionado en el RMS histograma gradiente, delimitar la población "célula única" en un histograma de la Zona. Una vez que el tubo de microcentrífuga se ha insertado en la máquina, ajustar la potencia del láser, la puerta en las células individuales y adquirir 5000 T linfocitos.
- En las Ideas blandosware, abra el archivo de adquisición y crear un histograma que mostrará el valor del valor RMS gradiente de imágenes de campo claro (Canal 1) obtenida para cada célula individual. Dibuja una puerta en el histograma gradiente RMS que considera células que presentan RMS valor de gradiente anterior 57.
NOTA: El gradiente de RMS permite tener en cuenta en el análisis sólo los linfocitos T que están en el plano focal. Hemos determinado empíricamente que las células individuales que presentan un valor de gradiente RMS superior a 57 están en el plano focal, y se pueden considerar con precisión. - En el menú Análisis / Máscaras, crear una nueva máscara, llamado Erode (M01,2) de la máscara de la morfología en las imágenes de campo claro M01, erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica de la zona, calculado sobre la máscara Erode (M01,2). Desde las celdas seleccionadas en la puerta anterior, abra un histograma que muestra el Área de células usando esta máscara de nueva creación.
La morfología de las máscaras que están disponibles por: NOTApor defecto son mucho más grandes que el tamaño real de la célula. Por lo tanto, es más preciso para erosionar que hasta 2 píxeles. - Dibuja una puerta en las células T individuales, con exclusión de las microesferas y escombros (pequeña área) y los dobletes (grandes Area). Ajuste esta puerta en cada adquisición.
NOTA: Las variaciones en el tamaño de la celda afectará a la posición de la puerta. Como las células T de ratón son más pequeños que las células T humanas que son ellos mismos más pequeño que las células CEM, el área de cada tipo de célula será proporcional a su tamaño. - Teniendo en cuenta las células individuales, en foco que fueron cerrada en los pasos anteriores, abrir un gráfico de puntos que consiste en el Raw Max Pixel en la tinción de HLA-ABC (Canal 2, eje x) como una función de la Raw Max Pixel en la faloidina tinción (Canal 4, eje y). Crear una puerta para excluir los eventos fluorescentes sin teñir o saturados. Abra dos histogramas que muestran la cruda Max Pixel para HLA-ABC (Canal 2) y phalloidin (Canal 4) coloraciones.
- En el Análisis / menú Máscaras, createa nueva máscara, llamado Erode (M02,2) de la máscara de la morfología de las células HLA-ABC manchados (Canal 2), erosionadas de 2 píxeles. Luego, en el Análisis / menú Características, crear una nueva característica que consiste en el parámetro de circularidad, calculado sobre la Erode (M02,2).
NOTA: Este parámetro mide la desviación de la forma de la célula de un círculo. Por lo tanto, una célula T perfectamente redonda tendrá un valor alto circularidad mientras que las células polarizadas alargadas exhibirá un bajo índice de circularidad. - Posteriormente, crear otro histograma que reportar los valores de la función de circularidad de las células previamente cerradas. Utilice este histograma para trazar directamente la distribución de un individuo, población de células de enfoque de acuerdo con el valor de la circularidad para cada celda individual.
- En cuanto a la forma del histograma para las células no estimuladas, dibujar una puerta para células polarizadas, a partir del valor circularidad más bajo hasta el valor límite de la circularidad donde la mayoría de las células no estimuladasse trazan. Mire la pantalla de estadísticas para el porcentaje de células polarizadas entre la población cerrada (% Recinto).
NOTA: Hemos establecido esta puerta para los valores de índice de circularidad siguientes 13. - Con el fin de mirar a la polarización de la tinción de actina en las células, trazar un histograma para el Detalle Bright valor de similitud R3, comparando la tinción de HLA-ABC (canal 2) y la tinción faloidina (Canal 4).
NOTA: Cuanto más grande sea el valor de esta característica, el más superpone las dos coloraciones son. - Usando la misma estrategia de gating como antes, trazar una puerta en las células no estimuladas para la tinción segregada que muestra el porcentaje de células con tinción de actina polarizada.
- Cuando se haya completado, el porcentaje de células que muestran una segregación en la distribución de la MHC de clase I y tinciones con faloidina, el porcentaje de células polarizadas junto con los valores medios de los índices de la circularidad y la similitud de todas las células ± SD se muestran en la corresppaneles estadísticas onding.
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Representative Results
El primer ejemplo elegido aquí se refiere al uso de linfocitos T primarias humanas estimuladas con CCL19. Sin embargo, la misma estrategia se puede utilizar con las células T de ratón primario, líneas de células T o cualquier otro tipo de células sensibles a la estimulación de quimiocina. La estrategia gating que aquí se presenta incluye una serie de ventanas que se seleccionan los eventos enfocados, entonces las células individuales. Por último, la gama de intensidad de fluorescencia se sigue aquí como un ejemplo en dos marcadores: el MHC de clase I HLA-ABC y actina filamentosa para el descanso (Figura 1) o CCL19 estimuladas (Figura 2) linfocitos T.
En primer lugar, el índice de circularidad se mide en no tratado (Figura 1) o CCL19 estimuladas (Figura 2) linfocitos T. El hecho de que las células en reposo tienen un pico único importante con un alto valor de índice de circularidad indica que la mayoría de las células están cerca de redondear. Sin embargo, es claro que la estimulación CCL19 provoca la aparición ofa segunda subpoblación de células con un bajo índice de circularidad. Esta subpoblación abarca células que han adoptado una morfología polarizada. También, cuando se representa el índice de similitud Detalle brillante entre HLA-ABC y la tinción de actina F, se puede observar que algunas células muestran una caída en el valor de este índice tras el tratamiento CCL19, lo que indica que ambos marcadores muestran un menor grado de co-localización . Curiosamente, a partir de las punto-parcelas presentaron anteriormente, se puede colocar el cursor en cualquier punto en particular para obtener una imagen de la célula que consiste en una imagen de campo claro y una imagen para cada una de las tinciones realizadas. Figura 3 presenta así ejemplos de CCL19 estimulados T linfocitos que se encuentran en la puerta de las células polarizadas (Figura 3B) no polarizada (Figura 3A) o. Uno puede visualizar claramente las diferencias en la morfología entre las dos subpoblaciones. De las tablas estadísticas por debajo de los histogramas de la circularidad de las figuras 1 2, se puede trazar el porcentaje de células que caen en la puerta polarizada en ausencia o presencia de CCL19 (Figura 3C). Como era de esperar, es claro que la estimulación de quimiocina aumenta el porcentaje de células T polarizadas (de 11,2% a 50,6%). También se puede trazar el índice de circularidad media de toda la población de células obtenida en ambas condiciones (Figura 3D). CCL19 estimulación provoca una caída en este índice. Sin embargo, como sólo la mitad de las células están polarizadas, el cambio en el índice de circularidad media observada tras la estimulación CCL19 es pequeño.
Del mismo modo, la figura 4 representa ejemplos de células CCL19 estimulada, en el que tanto el HLA-ABC y la F-actina tinciones hacen (Figura 4 A) o no colocalize (Figura 4B). De las tablas estadísticas por debajo de los histogramas de similitud Detalle brillantes mostrados en las Figuras 1 y 2, se puede obtener la proporciónde células que exhiben un valor de índice por debajo de 1,5, lo que representa las células que exhiben un grado muy bajo de co-localización entre HLA-ABC y F-actina. La Figura 4C muestra que la fracción de células que cae en esta puerta aumenta tras la estimulación CCL19 ( del 3,4% al 13,9%). La recogida de los valores del índice para cada célula individual, también se puede trazar la media Detalle Bright índice de similitud de toda la población de células obtenida en ambas condiciones (Figura 4D). CCL19 provoca una caída en el índice, sin embargo, por las mismas razones que anteriormente, los cambios son pequeños. Al observar las imágenes de las células correspondientes, parece que esta caída de HLA-ABC - F-actina co-localización se debe principalmente a la agrupación de F-actina en uno de los polos de la célula. Por el contrario, la distribución subcelular de las moléculas de HLA-ABC MHC de clase I no parece ser sumamente afectada por la estimulación CCL19.
Esa es la razón por la que al lado decidimos probar másla metodología del análisis de dos marcadores (F-actina y fosfo-ERM) que se sabe que segregan en polos de las células T de quimioquinas estimulada opuestas. Las células T humanas estimuladas con CXCL12 polarizados fuertemente, tal como se cuantifica en la figura 5A con la misma estrategia gating que antes (de 5,95% a 79,10% de células polarizadas después de 8 min de estimulación con 50 ng / ml CXCL12). En estas condiciones, hay una fuerte disminución en la media del índice de Detalle brillante similitud como se muestra en las figuras 5B y 5D, lo que significa que F-actina y fosfo-ERM colocalize menos después de CXCL12 estimulación. Como se esperaba, el porcentaje de células que muestran una segregación de los marcadores elegidos aquí es mayor (48%, Figura 5C) en comparación con los previamente estudiados (14%, Figura 4C). De acuerdo con ello, la disminución de la media de índice de similitud de cada afección también es más evidente (Figura 5D). Por lo tanto, la técnica de citometría de flujo de imágenes que aquí se presenta es suitable para cuantificar el grado de co-localización de dos coloraciones en diferentes entornos.
Finalmente, decidimos para ilustrar en qué medida la perturbación de algún elemento del citoesqueleto o la vía de señalización conocido para afectar a los cambios en la morfología de las células T a la estimulación de quimiocina, podría ser medido por citometría de flujo de imágenes. Las células T de control se compararon primero con un poco de pretratada con el fármaco actina perturbar latrunculin A (Figura 6A). Las células fueron estimuladas con CXCL12, se tiñeron con faloidina fluorescente y se analizaron por citometría de flujo la formación de imágenes. Los histogramas muestran la cruda intensidad Max Pixel de la tinción de actina F se muestran para las dos poblaciones celulares (Figura 6A, arriba). Como era de esperar de la actividad de ruptura de latrunculin A hacia los filamentos de actina, la intensidad de la tinción faloidina es menor en estas células (panel derecho) en comparación con el control de linfocitos T tratadas con el vehículo DMSO (panel izquierdo). Por otra parte, latrunculin A-trLas células T eated presentan un índice de circularidad grande que indica que siguen siendo más redonda que las células control (Figura 6A, abajo). Esto puede ser cuantificado por una puerta situada en los histogramas para medir el porcentaje de células que exhiben alteraciones morfológicas. Aunque el 32% de las células de control se polarizan en esta condición, sólo el 10% de latrunculin A tratada con linfocitos T presentan cualquier cambio de forma (Figura 6B). Por lo tanto, aquí se muestra que el flujo de imágenes citometría de tecnología es adecuada para medir las diferencias en modificaciones morfológicas cuando se estudia el efecto potencial de algunos elementos del citoesqueleto en este fenómeno.
En segundo lugar, la adquisición de un gran número de células con este método también abre la posibilidad de analizar rápidamente pequeños subconjuntos de células presentes como una minoría. En la Figura 7, se presenta un ejemplo donde nuestro análisis se limita específicamente para el comportamiento de las células T co-transfectared con GFP junto con plásmidos que codifican para los mutantes negativos dominantes del complejo polaridad Par6 / PKCζ. El histograma correspondiente a las células no transfectadas nos ha permitido puerta específicamente en las células T (Figura 7A, izquierda) GFP + relevante. La intensidad de GFP medida como histogramas que cuantifican la distribución de la intensidad de fluorescencia del canal 2 de hecho muestra que sólo una pequeña fracción de toda la población de células ha sido transfectadas (Figura 7A). A continuación, el grado de polarización morfológica de estas células transfectadas se cuantificó midiendo sólo el índice de circularidad de las células GFP + (Figura 7B). Una puerta adicional para las células T que presentan valores bajos de la circularidad permitió la estimación del porcentaje de células polarizadas en cada condición (Figura 7C). Los resultados muestran que la interrupción de la función de la vía de señalización Par6 / PKCζ inhibida polarizati de células Ten inducida por ambas quimiocinas CCL19 y CXCL12, en línea con nuestros hallazgos previos 7.
Figura 1. Resultados de tinción no estimulados representativos sobre las células T humanas primarias. El panel superior izquierdo muestra el reparto histograma de la Gradiente RMS calculado con la máscara M01 en las imágenes de campo claro (Canal 1). El panel superior derecha muestra el área de la máscara M01 erosionado de 2 píxeles, basado en las imágenes de campo claro (Canal 1) de las células en Focus cerradas de la trama anterior. Los paneles centrales muestran los valores Raw Max Pixel tanto de las coloraciones de HLA-ABC y phalloidin (canales 2 y 4, respectivamente), ya sea como un gráfico de puntos (panel izquierdo) o como histogramas (medio y paneles de la derecha) para el individuo, in- centrarse células seleccionadas en el paso anterior. De esta población de células individuales en foco con tinción correcta, se calcula la función circularidad en la máscara M02 erosionado de 2 píxeles de la tinción HLA-ABC (panel inferior izquierdo) y el detalle brillante característica Similitud R3 (panel inferior derecho) que muestra el grado de similitud entre el HLA-ABC y las coloraciones phalloidin . Para estas dos últimas parcelas, las estadísticas que indican el reparto de la población (% cerrada, con una media de la función, SD) se indican en la tabla de abajo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Tinción resultados representativos de las células T humanas primarias estimuladas con 200 CCL19 ng / ml durante 8 min La estrategia de diseño del panel y conmutación son idénticos a la figura 1.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación del estado morfológico de los linfocitos T estimulados por CCL19. (A, B) Ejemplos de células de la figura 2 fuera o en la puerta "polarizado", respectivamente (C) Histograma que muestra el porcentaje de células T polarizadas obtenidos en ausencia de CCL19. (Figura 1, -) o con 200 ng / ml CCL19 (Figura 2, +) (D) Histograma que representa los valores medios del índice de circularidad ± SE en el individuo, la población de células de enfoque en ausencia. (-) o presencia (+) de CCL19. *** P <0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cuantificación del grado de co-localización entre el HLA-ABC y tinciones con faloidina. (A, B) Ejemplos de células de la figura 2 fuera o en la puerta "no colocalized" de la Detalle brillante histograma Similitud, respectivamente. (C) Histograma que muestra el porcentaje de células T que exhiben no co-localización entre ambos marcadores en desempleo estimulado (-). o (+) Condiciones de CCL19 estimuladas (D) Histograma que representa los valores medios del índice de Similitud ± SE en el individuo, la población de células de enfoque en ausencia (-) o presencia (+) de CCL19. *** P <0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5. Análisis de F-actina - exclusión fosfo-ERM a CXCL12 estimulación de las células T primarias humanas. (A) Porcentaje de células T polarizadas en la ausencia o presencia de CXCL12 (10 o 50 ng / mL). (B) flujo Imaging citometría de histogramas que muestran la repartición del individuo, población de células de enfoque de acuerdo con el detalle brillante índice de similitud que compara el grado de co-localización entre las coloraciones de fosfo-ERM y faloidina, en ausencia de CXCL12 o con 10 ng / ml o 50 ng / ml CXCL12. (C) Cuantificación de la proporción de células que presentan no co-localización de la ondulación permanente y las tinciones con faloidina en células T estimuladas o no con CXCL12. (D) Cuantificación de los valores medios de índice de similitud ± SE en cada condición. *** P <0,001.subir / 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Efecto de la polimerización de la actina en la polarización de las células T. (A) F-actina intensidad de la tinción (paneles superiores) y circularidad (paneles inferiores) de las células T humanas primarias tratadas con latrunculina A (500 nM, 30 min) o DMSO y después se estimularon con 100 ng / ml CXCL12 para 8 min. ( B) Histograma que muestra el porcentaje de células T polarizadas tratados con DMSO o latrunculina A después de 8 minutos de estimulación con CXCL12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Expresión de la quinasa muertos mutante PKCζ o el mutante N-terminal de PAR6 bloques T polarización de las células después de CCL19 o CXCL12 tratamiento. (A) El flujo de Imaging citometría de histogramas que muestran la intensidad de la expresión de GFP, en las células no transfectadas T primarias o células T primarias co-transfectadas con GFP y un vector vacío (control) o el mutante quinasa muertos de PKCζ o la N-terminales parte de Par6 (B) flujo Imaging citometría de histogramas que representan el índice de circularidad de la población de células GFP-positivas que expresan las diferentes construcciones a nivel basal (NS: No estimulación). o después de CCL19 o estimulación CXCL12 (100 ng / ml para 8 min ). (C) La cuantificación del porcentaje de células T morfológicamente polarizadas que expresan las diferentes construcciones a nivel basal o después CCL19 o CXCL12 estimulación. Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
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Discussion
Usando una tecnología reciente del flujo de imágenes citometría, una estrategia rápida e informativo gating para analizar los eventos celulares y moleculares inducidos por la estimulación de quimiocinas se presenta. De un solo experimento, se pueden obtener dos tipos principales de información: los cambios en la morfología celular inducida por la estimulación de quimioquinas y la distribución subcelular de proteínas diferentes durante el proceso de polarización. Curiosamente, también se proporciona evidencia de la posibilidad de analizar un gran número de células, lo que permite solidez estadística y el análisis pertinente de una pequeña fracción de toda la población celular. Como se informó, esta técnica también se puede utilizar para analizar los sucesos de redistribución moleculares en el contexto de la sinapsis inmunológica 12. Además, un conjunto similar hasta ya ha sido utilizado para las células T estimuladas sdf1 pero ningún análisis del grado de co-localización entre dos marcadores se ha proporcionado 13.
Aunqueesta técnica puede por lo tanto ser adecuado para muchos tipos de células, las células adherentes no pueden ser analizadas directamente y células en suspensión necesitan ser fijados antes de la adquisición. Además de estas limitaciones intrínsecas de la máquina, es crítico para mantener las células a 37 ° C durante la estimulación de ellos. La temperatura es de hecho clave para lograr la correcta polarización de las células T ya que los cambios del citoesqueleto, tales como la polimerización de actina que impulsa cambios en la forma, son muy dependientes de la temperatura. Nuestros experimentos con células A latrunculin tratados confirman que la remodelación de la actina inducida por la estimulación adecuada de quimioquinas es de hecho crucial para una célula para lograr su estado completamente polarizada. Además de los datos proporcionados aquí con este medicamento, también a prueba la tecnología de citometría de flujo de imágenes con linfocitos T primarias humanas transfectadas con proteínas mutantes que inhiben la vía de señalización Par6 / PKCζ. Consistentemente con nuestros resultados publicados anteriormente 7, se muestra aquí que esta polaridad complejo fsabores polarización de las células T.
Tras la estimulación de quimioquinas, las células T pierden su ronda morfología de adoptar una forma polarizada. Hemos encontrado el parámetro circularidad ser la más precisa para cuantificar esas alteraciones morfológicas. Sin embargo, otros parámetros que describen cambios en la forma son propuestos por el software de análisis, tales como la relación de aspecto o la Elongatedness. Por lo tanto, se puede probar fácilmente la contribución de una vía de señalización en particular o una proteína específica en este proceso.
En este estudio, siempre hemos observado que el porcentaje de células que muestran una polarización morfológica es mayor que el de la polarización molecular. Esto indica que una fracción de células que adoptan un cambio en la morfología no presentan grandes redistribuciones moleculares de los marcadores estudiados. Esto podría surgir del hecho de que algunas células pierden su forma redonda por lo que presentan un índice de circularidad inferior aunque no muestran claramente una leading borde y un urópodo. Estas células T parcialmente polarizados todavía podrían caer en la puerta de las células T morfológicamente polarizadas sin presentar redistribuciones moleculares evidentes de marcadores típicos. Por otra parte, las diferencias en el umbral de señalización de quimioquinas que podrían ser más altas para los marcadores de redistribución que para alteraciones de la forma también podría explicar estas diferencias.
También se muestra aquí que el marcador HLA-ABC no se relocalized en las células T polarizadas y no hay cambio en la intensidad de esta coloración a la estimulación CCL19. A la inversa, se proporciona una confirmación aquí que la tinción aumenta F-actina por tratamiento CCL19 (Figuras 1 y 2) como ya se conoce, ya que la estimulación de quimiocinas se activa la polimerización de actina 5. Por otra parte, se demuestra que los filamentos de actina conseguir relocalizada en la parte frontal de las células polarizadas. En consecuencia, el índice de similitud Detalle brillante que mide el grado de co-localización entre ambos markers tiende a disminuir a la estimulación CCL19. Como comparación, se proporciona un análisis de este tipo aquí por el grado de F-actina co-localización con proteínas fosfo-ERM que quedan excluidos de la parte delantera de la célula. El porcentaje de células T de quimioquinas estimulada expositoras F-actina - MHC de clase I segregación es mucho menor que el de F-actina - fosfo-ERM (14% vs. 48%, respectivamente) desde relocaliza F-actina en la parte delantera y proteínas fosfo-ERM en la parte posterior de las células T polarizadas, mientras que el reparto de las moléculas MHC de clase I no se ve afectada por la estimulación de quimioquinas. Este índice de similitud Detalle brillante por lo tanto se puede utilizar de forma sistemática para comparar la distribución de los dos marcadores en las células T polarizadas. Por lo tanto, esta técnica es muy apropiado para cuantificar el grado de co-localización o co-exclusión de dos marcadores diferentes en un gran número de células o, potencialmente, en eventos raros presentes en una población de células amplio.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen enormemente Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert y Louise Rimbault del Fondo para el Cochin Imaging. Este trabajo fue apoyado por el INSERM, CNRS y la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
