Abstract
Клетки реагируют на хемокинов стимуляцию теряют круглую форму в процессе, называемом поляризации, а изменения внутриклеточную локализацию многих белков. Классические методы визуализации были использованы для изучения этих явлений. Тем не менее, они требуют ручной приобретение многих клеток с последующим трудоемким количественной оценки морфологии и со-локализации окрашивания десятков клеток. Здесь быстрый и мощный способ описан для изучения этих явлений на образцах, состоящих из нескольких тысяч клеток с использованием потока изображений цитометрии технологии, которая сочетает в себе преимущества микроскопом с результатами цитометром. Использование Т-лимфоциты, стимулированные CCL19 и окрашивания для молекул MHC класса I и фибриллярного актина, стратегия стробирования представлены одновременно измерять степень формы изменения и степень совместной локализации маркеров, которые страдают от CCL19 сигнализации. Кроме того, эта стратегия стробирования позволило нам Observе сегрегация фибриллярного актина (на переднем плане) и фосфорилированного эзрина-Radixin-Moesin (фосфо-ERM) белки (сзади) в поляризованном Т-клеток после CXCL12 стимуляции. Эта методика также полезна для наблюдения за блокирующий эффект на поляризации двух различных элементов: ингибирование полимеризации актина путем фармакологического ингибитора и экспрессии мутантов Par6 / атипичной PKC сигнального пути. Таким образом, доказательства показали, что этот метод полезен для анализа как морфологические изменения и белковые перераспределения.
Introduction
Хемокины небольшие растворимые белки, которые привлекают клетки специализированных местах 1. Таким образом, они участвуют в правильном расположении клеток в тканях, важнейшие функции в процессе развития и физиологии. Иммунная система не является исключением из этого правила, как это полагается по действию многих различных типов клеток, которые действуют сообща, чтобы обеспечить эффективную иммунную реакцию. Управляя конкретного местоположения одного типа иммунных клеток в данном состоянии, хемокины предварительно требуется до чужеродные антигены могут быть обнаружены и нейтрализованы.
В Т-лимфоцитов, в частности, хемокинов связываются со специфическими рецепторами на поверхности, которые, при соединении, вызывают много внутриклеточные сигналы (рост кальция, ERK фосфорилирования, Rho GTPases активации, увеличение Интегрины близость и цитоскелета изменения), которые способствуют Т-клеток моторику 2,3. На клеточном уровне, можно наблюдать морфологические изменения вызывали на хемокинов стимуляции.Эти изменения в клеточных форм особенно значительным в Т-клеток: покоящиеся Т-клетки имеют борта, как круглый морфологию при движении в потоке крови. Тем не менее, зондирование присутствии хемокинов в местах воспаления или в непосредственной близости от лимфоидных органов собирается изменить форму Т-клеток, в настоящее время принять типичный "ручное зеркало" Морфология, состоящий из биполярного виде: передний край на фронте и заднюю кромку, или Уропод, на задней 4. Кроме того, внутриклеточные компоненты могут разделять в этих двух противоположных областей поляризованного Т-клеток для поддержания миграции. Например, актиновые филаменты полимеризации увеличивается при стимуляции хемокинов 5 и полимеризованного актина накапливается в передней части поляризованного Т-клеток 2. С другой стороны, некоторые белки, такие как фосфорилированы белков Эзрин-Radixin-Moesin (ERM) семьи, которая свяжет плазматическую мембрану кортикальной F-актина цитоскелета, повторно локализовать в уропода поляризованногоТ-клетки 6. Интересно, что мы и другие показали, что этот процесс поляризации требуется для Т миграции клеток. Действительно, любое лечение, что мешает поляризации будет ингибирования клеточной подвижности. Например, ингибирование активности членов атипичной протеинкиназ C (РКС) семьи, PKCζ и PKCι блоки T поляризации клеток и их миграции процесс сканирования дендритных клеток 7. Т-клеток поляризация также регулируется Rho ГТФ. Мы показали, что модуляция активности RhoA по недавно описанного белка Fam65b мешает изменений Т-клеток в морфологии и их способности к миграции в анализе Transwell 6. Как поляризации является необходимым условием для клеточного шаг подвижности, это, таким образом, важно, чтобы иметь возможность количественно оценить его в качестве основного считывания ответов хемокинов. Формы клеток изменения были ранее измеренное вручную 8. Тем не менее, этот вид количественного очень много времени, так что, как правило, лишь немногиедесятки клеток учитываются.
Здесь новый метод представлен быстро количественно степень изменения формы Т-лимфоцитов, подверженных хемокинов стимуляции. Поток изображений цитометрии технологии (см таблицу специфических реагентов / Оборудование) используется, которая сочетает в себе преимущества проточной цитометрии и микроскопа 9 количественно эффективно количество поляризованных клетках в различных условиях хемокинов стимуляции. В дополнение к количественной оценки морфологических изменений, которые можно измерить энергично с этой технологией, можно также оценить изменения в субклеточном локализации некоторых белков при хемокинов сигнализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение Т-лимфоцитов
- Подготовка первичной мышь или человека Т-клеток, как описано 10,11.
- Выращивают человека Т-клеток в полной RPMI среде с 10% человеческой сыворотки АВ с плотностью 2 - 3 × 10 6 клеток / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: использование эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), а не человеческой сыворотки может вызвать спонтанная поляризация крупной фракции Т-клеток человека в культуре. Храните эти клетки в культуре в течение 4 - 5 дней и дальнейшего процесса их в любое время в течение этого периода. - Поддержание мыши Т-клеток в полной RPMI среде, дополненной 10% FCS в подобной плотности клеток. Используйте сразу или на следующий день, после того, как O / N культуры при 37 ° С в присутствии 10 нг / мл IL7.
- Культивируйте СЕМ человека Т-клеток линии в комплекте RPMI, дополненной 10% FCS.
2. Хемокин Стимуляция
- Вымойте 5 х 10 5 клеток на экспериментальной состоянии в теплой HBSS среде с добавлением 10 мМ Hepeс. Для некоторых экспериментов, со-трансфекции первичных человеческих Т-клеток накануне с 2 мкг pmaxGFP и 8 мкг pcDNA3.1 + (пустой вектор, контроль), PKCζ киназы мертвых, или N-концевых плазмид PAR6.
- Ресуспендируют осадок клеток в теплой HBSS-Hepes среды (используйте 0,3 мл х количество экспериментальных условиях).
- Распределите клеток в 1,5 мл микропробирок.
Примечание: Таким образом, одна трубка, соответствующий одной экспериментальной состоянии будет содержать 5 × 10 5 клеток в 0,3 мл HBSS-Hepes среды. Для некоторых экспериментов, добавить 500 нМ Латрункулин или транспортного средства (ДМСО) и инкубируют клетки в течение 30 мин перед стимуляцией хемокинов. - Добавить 10 до 500 нг / CCL19 мл или CXCL12 хемокинов в каждой пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно используем 10 - 200 нг / мл хемокинов для Т-клеток человека. CEM клетки не экспрессируют рецептор CCR7, что связывает CCL19. Таким образом, клетки СЕМ будет только в состоянии реагировать на CXCL12 стимуляции. Кроме того, использовать более высокие концентрации хемокинов (300 - 500 нг / мл) для поляризации Т-клеток мыши. - Флип трубок несколько раз и инкубировать их на водяной бане 37 ° в течение 8 или 10 мин для первичных Т-клеток или CEM, соответственно.
- Остановить процесс поляризации путем добавления в каждую пробирку 0,3 мл теплого раствора, содержащего 2% параформальдегида (PFA) и 10 мМ Hepes в PBS. Переверните трубы и инкубировать их при 37 ° С в течение 5 мин.
3. окрашивания
- Передача клеток из микропробирок с проточной цитометрии труб.
- Заполните трубы полностью раствором RT, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ Hepes в PBS.
- Центрифуга труб при 460 мкг в течение 4 мин.
- Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 100 мкл раствора RT, содержащей 5% FCS в PBS.
- Добавить 5 мкл FITC-анти-HLA-ABC в каждую пробирку, вихревые их, и инкубируют их в течение 30 мин при комнатной температуре, в защищенном от света.
- Промыть клетки один раз ФБР, содержащим 5% ФТС,ND один раз только PBS.
- В RT: добавить 500 мкл 1% PFA, инкубировать в течение 10 мин, затем промыть клетки с раствором, содержащим 1% BSA, 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ HEPES в PBS.
- Жидкость над осадком сливают, заполняют трубы полностью раствором PBS, содержащим 0,2% БСА, 0,1% сапонина, 0,5 мМ ЭДТА и 10 мМ HEPES (пермеабилизации буфер).
- Промыть клетки дважды в этой среде.
- Флип трубы, чтобы удалить среду и вихревых их отделить осадок клеток.
- Добавить 0,25 мкг / мл TRITC-фаллоидином и / или один: 100 разбавление анти-Р-ERM антитела в каждую пробирку, вихревые их и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Вымойте клеток с буфером пермеабилизации. Инкубируйте с флуоресцентным вторичного антитела, если это необходимо.
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS и передачи их в микроцентрифужных пробирках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки готовы к приобретению. С другой стороны, при сохранении общего максимального объема 200 мкл на пробирку, добавляют концентрированную PFA до конечной 1%концентрация для того, чтобы сохранить окрашивания, если клетки не будут использоваться в тот же день для дальнейшей обработки.
4. Изображения для сбора и анализа
- Включите аппарат (см таблицу специфических реагентов / Оборудование), и пусть он калибровки себя в соответствии с инструкциями изготовителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: программное обеспечение INSPIRE был использован с 40х объективом (0,75 NA). ИДЕИ 3,0 программного обеспечения был использован для всех зарегистрированных количественными. - Подготовить ряд окон приобретение, которое может быть сохранено в качестве шаблона для будущих экспериментов. Нарисуйте гистограммы, которые количественно значения градиента RMS. Из "В фокусе" населения, отобранных на RMS градиент гистограммы, разграничить населения "Single Cell" на гистограмме Района. После того, как микроцентрифужных трубки был вставлен в устройство, регулировки мощности лазера, ворота на отдельные клетки и приобрести 5000 Т-лимфоцитов.
- В Идей мягкихпосуда, откройте файл приобретения и создать гистограмму, которая будет показывать значение среднеквадратичного значения градиента для изображений в светлом поле (канал 1), полученные для каждой отдельной клетки. Нарисуйте ворота на гистограммы градиентного RMS, что считает клетки, обладающие RMS значение градиента выше 57.
ПРИМЕЧАНИЕ: градиент RMS позволяет учитывать в анализе только Т-лимфоцитов, которые находятся в фокальной плоскости. Мы определены эмпирически, что отдельные клетки, проявляющие градиента среднеквадратичное значение превосходит 57 в фокальной плоскости, и может быть точно считать. - В анализ / меню Маски, создать новую маску, называется Ирода (M01,2) от морфологии маску на светлое изображений M01, эродированных 2 пикселей. Тогда, в анализу / Особенности меню, создать новую функцию Area, рассчитанного на Ирода (M01,2) маски. Из клеток, выбранных на предыдущем ворот, откройте гистограмму, показывающую диапазон ячеек, использующих эту вновь созданную маску.
ПРИМЕЧАНИЕ: морфология маски, которые доступны напо умолчанию намного больше, чем фактический размер ячейки. Таким образом, является более точным, разрушать его до 2 пикселей. - Нарисуйте ворота на отдельных Т-клеток, за исключением калибровки бисером и мусора (малая площадь) и дублетов (большая площадь). Отрегулируйте эти ворота на каждом приобретения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения в размер ячейки будет влиять на положение ворот. Как Т-клетки мыши меньше, чем Т-клеток человека, которые сами по себе меньше, чем клеток СЕМ, площадь каждого типа клеток будут пропорционально его размеру. - С учетом одно-, в фокусе клетки, которые были стробированных на предыдущих шагах, открыть точка участок, состоящий из исходных Max Pixel на окрашивание по HLA-ABC (канал 2, ось х) в зависимости от сырья Макс пиксела на фаллоидином окрашивание (Channel 4, ось у). Создать ворота, чтобы исключить неокрашенных или насыщенные события люминесцентные. Открытые две гистограммы, показывающие Raw Макс пикселей для HLA-ABC (канал 2) и фаллоидина (канал 4) окрашивания.
- В анализ / меню Маски, создаEA новая маска, называется Ирода (M02,2) от морфологии маска HLA-ABC окрашенных клеток (канал 2) подорвало из 2 пикселей. Тогда, в анализу / Особенности меню, создать новую функцию, состоящую из параметра округлости, рассчитанный на Erode (M02,2).
Примечание: Этот параметр измеряет отклонение формы клеток из круга. Таким образом, совершенно круглые Т-клеток будет иметь большое значение округлости, тогда как удлиненные поляризованных клеток будет демонстрировать низкий коэффициент округлости. - Впоследствии, создать еще один гистограмму, которая будет отчитываться значения функции округлости из ранее закрытых ячеек. Эта гистограмма непосредственно участок распределение индивидуального, в фокусе клеточной популяции в соответствии с величиной округлости для каждой отдельной клетки.
- Глядя на форму гистограммы для нестимулированных клеток, нарисуйте ворота для поляризованных клетках, начиная с самой низкой стоимостью округлости до предела округлость значения, где большинство нестимулированных клетокнанесены. Посмотрите на дисплей статистики по проценту поляризованных клетках среди закрытом населения (% закрытого типа).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы поставили эти ворота для значений индекса округлости ниже 13. - Для того, чтобы смотреть на поляризации актина окрашивания в клетках, построить гистограмму для ярких деталях значение подобия R3, сравнивая окрашивание HLA-ABC (канал 2) и окрашивание фаллоидином (Channel 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: больше значение этой функции, более налагаются два окрашивания есть. - Используя ту же стратегию стробирования, как и прежде, участок ворота на не стимулированных клеток для раздельного окрашивания, который показывает процент клеток с окрашиванием поляризованного актина.
- После завершения процент клетки, обладающие сегрегации в распределении МНС класса I и фаллоидином окрашивания, процент поляризованных клетках вместе со средними значениями округлости и индексы общности всех клеток ± SD показаны в-корреспондентonding Статистика панелей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В первом примере выбраны здесь относится к использованию человеческих первичного Т-лимфоцитов, стимулированных CCL19. Тем не менее, та же стратегия может быть использована с основным мыши Т-клеток, Т-клеточных линий или любого другого типа клеток в ответ на стимулирование хемокинов. Стратегия стробирования, представленные здесь включает в себя ряд окон, которые выбирают сфокусированные события, то отдельные клетки. Наконец диапазон интенсивности флуоресценции следует здесь в качестве примера на двух маркеров: MHC класса I HLA-ABC и фибриллярного актина для отдыха (рисунок 1) или CCL19-стимулированной (рис 2) Т-лимфоцитов.
Во-первых, индекс округлость измеряется в необработанном (фиг.1) или CCL19-стимулированных (фиг.2) Т-лимфоцитов. Дело в том, что покоящиеся клетки играют важную единственный пик с высоким значением индекса округлости показывает, что большинство клеток близки к круглой. Тем не менее, очевидно, что CCL19 раздражение вызывает появление уплотнительноеFA второй субпопуляции клеток с низким индексом округлости. Это субпопуляции охватывает клетки, которые приняли поляризованный морфологию. Кроме того, при представлении в ярких деталях схожесть индекс между HLA-ABC и F-актина окрашивания, можно заметить, что некоторые клетки обладают падение стоимости этого показателя после обработки CCL19, указывая, что оба маркера показали более низкую степень совместной локализации , Интересно, что из дот-участков представлены ранее, можно расположить curser на какой-либо конкретной точки, чтобы получить представление о клетке, состоящей из светлого образа и изображения для каждого из окрашиванием выполнены. Рисунок 3, таким образом, представляет примеры CCL19 стимулировали T лимфоциты, которые попадают в воротах, не поляризовано (рис 3А) или поляризованных (рис 3B) клеток. Можно четко визуализировать различия в морфологии между двумя подгруппах. Из таблиц статистики ниже гистограммы округлости из рис 1 2, можно построить процент клеток, которые попадают в поляризованном ворот в отсутствие или в присутствии CCL19 (рис 3C). Как и ожидалось, становится ясно, что хемокин стимуляции увеличивает процент поляризованных Т-клеток (от 11,2% до 50,6%). Можно также построить среднему показателю округлости всей клеточной популяции, полученной в обоих условиях (рис 3D). CCL19 раздражение вызывает падение этого показателя. Однако, как только половина клетки поляризованы, изменение средней круглости индекса наблюдается при стимуляции CCL19 мала.
Кроме того, фиг.4 представляет примеры CCL19-стимулированных клеток, в которых как HLA-ABC и F-актина окрашивание делает (фиг.4а) или не локализуются (фиг.4В). Из таблиц статистики ниже яркая деталь подобия гистограмм, показанных на рисунках 1 и 2, можно получить долюклеток, которые обладают значение индекса ниже 1,5, представляющий клетки, которые обладают очень низкой степенью совместной локализации между HLA-ABC и F-актина. фиг 4C показывает, что доля клеток, что попадает в эти ворота возрастает при стимуляции CCL19 ( от 3,4% до 13,9%). Сбор значений индекса для каждой отдельной клетки, можно также построить среднюю яркая деталь на схожесть индекс всей клеточной популяции, полученной в обоих условиях (рис 4D). CCL19 вызывает падение индекса, однако, по тем же причинам, что и ранее, изменения невелики. Глядя на изображения соответствующих клеток, кажется, что это капля в HLA ABC-- F-актин совместная локализация в основном за счет кластеризации F-актина в одном полюсе клетки. С другой стороны, внутриклеточное распределение молекул HLA-ABC MHC I класса, кажется, не быть сильно зависит от CCL19 стимуляции.
Это причина, почему мы в следующий раз решил испытать дальшеметодологию анализа двух маркеров (F-актин и фосфо-ERM), известный разделения в противоположных полюса хемокинов, стимулированных Т-клеток. Т-клеток человека, стимулированных CXCL12 поляризованный сильно, как количественно на фиг.5А с одной и той же стратегии стробирования, чем раньше (от 5,95% до 79,10% поляризованных клеток после 8 мин стимуляции с 50 нг / мл) CXCL12. В этих условиях, существует сильное уменьшение среднего яркая деталь показатель подобия, как показано на фиг 5В и 5D, это означает, что F-актина и фосфо-ERM локализуются меньше после CXCL12 стимуляции. Как и ожидалось, процент клеток, проявляющих сегрегации маркеров, выбранных здесь выше (48%, 5С) в сравнении с теми, ранее изученных (14%, рис 4в). Соответственно, снижение среднего индекса подобия каждого состояния также более очевидным (рис 5D). Таким образом, методика цитометрии потока изображений, представленные здесь, суITable чтобы количественно оценить степень совместной локализации двух окрашивания в различных условиях.
Наконец, мы решили проиллюстрировать, до какой степени возмущение некоторых цитоскелета элемента или сигнального пути как известно, влияют изменения в Т клеточной морфологии на хемокинов стимуляции, может быть измерена с помощью визуализации проточной цитометрии. Управление Т-клетки были впервые по сравнению с некоторыми предварительно обрабатывают актина, разрушающие лекарства Латрункулин A (6А). Клетки стимулировали CXCL12, окрашивали флуоресцентным фаллоидином и анализировали с помощью проточной цитометрии визуализации. Гистограммы, показывающие интенсивность сырье Макс пикселя F-актина окрашивания показаны для обоих клеточных популяций (рис 6A, вверху). Как и ожидалось от отделени активности Латрункулин А к актиновых филаментов, интенсивность окрашивания фаллоидином ниже в этих клетках (справа) по сравнению с контрольными Т-лимфоциты, обработанные ДМСО транспортного средства (слева). Кроме того, Латрункулин A-TReated Т-клетки демонстрируют больший показатель округлости, указывающее, что они остаются универсал, чем контрольные клетки (фиг.6А, нижняя). Это может быть количественно с помощью затвора, установленного на гистограммах, чтобы измерить процент клеток, демонстрирующих морфологические изменения. Хотя 32% контрольных клеток поляризуются в этом состоянии, только 10% из Латрункулин A -обработанной Т-лимфоцитов проявляют какие-либо изменения формы (рис 6б). Таким образом, здесь показано, что поток изображений цитометрии технология подходит для измерения различий в морфологических изменений при изучении потенциального влияния некоторых цитоскелета элементов в этом явлении.
Во-вторых, приобретение большого количества клеток с этим способом также открывает возможность для анализа быстро небольшие подмножества клеток, присутствующих в меньшинстве. На фиг.7 представлен пример, где наш анализ особых ограничений на поведение Т-клеток со-трансфекцииред с GFP вместе с плазмидами, кодирующими для доминантных негативных мутантов полярности комплекса Par6 / PKCζ. Гистограмма соответствующие не-трансфицированных клеток позволило нам ворот специально на подходящей GFP + Т-клеток (рис 7А, слева). Интенсивность GFP измеряют как гистограммы, что количественно распределение интенсивности флуоресценции канала 2, действительно показывают, что только небольшая часть всей популяции клеток была трансфицировали (7А). Степень морфологической поляризации этих трансфицированных клеток затем количественно, измеряя только индекс округлости из GFP + клеток (фиг 7b). Дополнительный затвор для Т-клеток, проявляющих низкие значения округлости позволил оценить процент поляризованных клеток в каждом условии (7С). Результаты показывают, что разрушение функции сигнализации Par6 / PKCζ пути ингибирует Т-клеток polarizatiпо наведению обоих CCL19 и CXCL12 хемокинов, в соответствии с нашими предыдущими выводами 7.
Рисунок 1. Типичные нестимулированных Результаты окрашивания на первичных человеческих Т-клеток. Верхняя левая панель показывает гистограммы передел градиента RMS рассчитанное с маской M01 на изображение в светлом поле (канал 1). Верхняя правая панель показывает область маски M01 размытой из 2 точек, на основе светлого изображений (канал 1) клеток в фокусе закрытых от предыдущего участка. Средние панели показывают значения Raw Макс пикселя обоих окрашивания HLA-ABC и фаллоидином (каналы 2 и 4, соответственно) либо в виде точки участка (левая панель) или как гистограммы (средняя и правая панели) для индивидуума, в том сосредоточиться ячейки, выбранные на предыдущем шаге. С этого населения отдельных, находящихся в фокусе клеток с правильной окраски, рассчитывается функцию округлости на маске M02 размытой из 2 пикселей окрашивания HLA-ABC (нижняя левая панель) и яркая деталь функции Сходство R3 (нижняя правая панель) показывает степень сходства между HLA-ABC и окрашивания фаллоидином , Для этих двух последних участков, статистика, указывающие на передел населения (% закрытого, значит, в особенности, SD) указаны в таблице ниже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:. Представитель результаты окрашивания на первичных человеческих Т-клеток, стимулированных 200 нг / мл CCL19 в течение 8 мин стратегия макет панели и литниковой идентичны Рисунок 1.JPG "целевых =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественное определение морфологического состояния Т-лимфоцитов, стимулированных CCL19. (А, В) Примеры клеток из фиг.2 снаружи или в "поляризованного" ворот, соответственно (С) Гистограмма показывает процент поляризованных Т-клеток, полученных в отсутствие CCL19. (Рис 1, -) или 200 нг / мл CCL19 (рис 2, +) (D) Гистограмма представляющих средние значения индекса округлости ± SE в личности, в фокусе клеточной популяции в отсутствие. (-) или в присутствии (+) от CCL19. *** Р <0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. Количественная оценка степени совместной локализации между HLA-ABC и фаллоидином окрашивания. (A, B) Примеры клеток из рисунка 2 на улице или в состоянии «Не локализуются" ворота из ярких деталях сходство гистограммы, соответственно. (C) Гистограмма показывает процент Т-клеток не проявляющих не совместной локализации между двумя маркерами в не- стимулируется (-). или CCL19-стимулированной (+) условия (D) Гистограмма представляющих средние значения индекса сходства ± SE в личности, в фокусе клеточной популяции в отсутствие (-) или в присутствии (+) от CCL19. *** Р <0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
р-together.within-страницы = "всегда"> 
Рисунок 5. Анализ F-актина - фосфо-ERM исключение на CXCL12 стимуляции человеческих первичных Т-клеток. () Доля поляризованных Т-клеток в отсутствие или в присутствии CXCL12 (10 или 50 нг / мл). (B) изображений проточной цитометрии гистограммы, показывающие передел личности, в фокусе клеточной популяции в соответствии с яркая деталь индекса сходства который сравнивает степень совместной локализации между фосфо-ERM и фаллоидином окрашивания, в отсутствие CXCL12 или 10 нг / мл или 50 нг / мл CXCL12. (С) Количественное определение доли клеток не проявляющих не совместной локализации Перми и фаллоидином окрашивание в Т-клетках, стимулированных или не с CXCL12. (D) Количественное определение средних значений индекса сходства ± SE в каждом состоянии. *** Р <0,001.Загрузка / 52140 / 52140fig5large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Влияние полимеризации актина на Т-клеток поляризации. (А) F-актин интенсивности окрашивания (верхние панели) и округлость (нижние панели) первичных Т-клеток человека, обработанных Латрункулин A (500 нм, 30 мин) или ДМСО, а затем стимулировали 100 нг / мл CXCL12 в течение 8 мин. ( B) гистограмму, показывающую процентное поляризованных Т-клеток, обработанных ДМСО или Латрункулин А через 8 минут стимуляции с CXCL12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7. Экспрессия киназы мертвой мутанта PKCζ или N-концевой мутанта Par6 блоков Т-клеток после поляризации CCL19 или CXCL12 лечения. (А) поток изображений цитометрии гистограммы, показывающие интенсивность экспрессии GFP, в не-трансфицированных первичных Т-клеток или Т-клеток первичной совместно трансфицировали GFP и пустым вектором (контроль) или киназы мертвой мутанта PKCζ или N-концевых часть Par6 (В) изображений проточной цитометрии гистограмм, представляющих индекс округлости из GFP-положительных клеток, экспрессирующих населения различных конструкций в базальном уровне (NS: Нет Стимуляция). или после CCL19 или CXCL12 стимуляции (100 нг / мл в течение 8 мин ). (C) Количественная оценка процент морфологически поляризованных Т-клеток, выражающих различные конструкции на базального уровня или после CCL19 или CXCL12 стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше верСион этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование недавно созданной технологии потока изображений цитометрии, быстрый и информативный стратегия стробирования для анализа клеточных и молекулярных событий, вызванных хемокинов стимуляции представлена. Из одном эксперименте, можно получить два основных типа информации: изменения в морфологии клеток, вызванных стимуляцией хемокинов и субклеточном распределении различных белков в процессе поляризации. Интересно, что свидетельствует также предоставляется возможность анализировать большое количество клеток, что позволяет статистической значимости и соответствующий анализ малой доли всего клеточной популяции. Как сообщалось, эта методика может быть также использована для анализа событий молекулярные перераспределения в контексте иммунологического синапса 12. Кроме того, подобный набор до уже был использован для sdf1-стимулированных Т-клетках, но не анализ степени совместной локализации между двумя маркерами не было предоставлено 13.
ХотяЭта техника может, таким образом, пригодны для многих типов клеток, прилипшие клетки не могут быть непосредственно проанализированы и клетки в суспензии должны быть исправлены до приобретения. В дополнение к этим внутренних ограничений машины, очень важно, чтобы клетки при 37 ° С при стимуляции их. Температура действительно ключ к достижению надлежащего Т-клеток поляризации, так как изменения цитоскелета, такие как полимеризация актина, что лежащая в форму, очень сильно зависят от температуры. Наши эксперименты с Латрункулин А обработанных клеток подтвердить, что собственно актина реконструкции индуцируется хемокинов стимуляции действительно решающее значение для клеток для достижения своей полностью поляризованного состояния. В дополнение к данным здесь с этим препаратом, мы также протестировали технологию проточной цитометрии изображений с человека первичная Т-лимфоцитов, трансфецированных мутантных белков, которые ингибируют сигнальный путь Par6 / PKCζ. Последовательно с ранее опубликованными результатами 7, здесь показано, что эта полярность комплекс Favors Т-клеток поляризацию.
По хемокинов стимуляции Т-клетки теряют круглый морфологию принять поляризованный форму. Мы нашли параметр округлости наиболее точным для количественной оценки этих морфологических изменений. Тем не менее, другие параметры, описывающие изменения формы предлагается с помощью программного обеспечения для анализа, такие как соотношение сторон или Elongatedness. Таким образом, можно легко проверить вклад конкретного сигнального пути или конкретного белка в этом процессе.
В этом исследовании, мы всегда наблюдали, что процент клеток, проявляющих морфологический поляризации выше, чем для поляризации молекул. Это указывает на то, что часть клеток, которые принимают изменение в морфологии не представит больших молекулярных перераспределению маркеров изучены. Это может возникнуть из-за того, что некоторые клетки теряют круглую форму, так что они проявляют более низкий индекс округлости, хотя они четко не показывать leadinг край и Уропод. Эти частично поляризованных Т-клетки могут по-прежнему не в воротах морфологически поляризованных Т-клеток без предъявления очевидные молекулярные перераспределение типичных маркеров. Кроме того, различия в порог сигнализации хемокинов, которые могут быть выше для маркеров, чем для перераспределения формы изменений также может объяснить эти различия.
Показано также, что здесь маркер HLA-ABC не relocalized в поляризованных Т-клеток, и нет никаких изменений в интенсивности этого окрашивания при CCL19 стимуляции. С другой стороны, подтверждение приводится здесь в том, что F-актина окрашивания увеличивается при лечении CCL19 (фиг.1 и 2), как уже известно, поскольку стимуляция хемокинов включает полимеризацию актина 5. Кроме того, было показано, что актиновые филаменты получить relocalized в передней части поляризованных клеток. Следовательно, яркая деталь Сходство индекс, который измеряет степень совместной локализации между обоими маrkers имеет тенденцию к снижению при CCL19 стимуляции. Для сравнения, такой анализ представлен здесь на соискание ученой степени F-актин совместная локализация с фосфо-ERM белков, которые получают исключена из клеток передней панели. Процент хемокинов, стимулированных Т-клеток, обладающих F-актина - МНС класса I сегрегации значительно ниже, чем для F-актина - фосфо-ERM (14% против 48% соответственно) Поскольку F-актина relocalizes на фронте и фосфо-ERM белки в задней части поляризованных Т-клеток, в то время как передел молекул MHC класса I не зависит от хемокинов стимуляции. Это яркая деталь индекса сходства, таким образом, можно систематически используется для сравнения распределения двух маркеров в поляризованном Т-клеток. Таким образом, этот метод очень подходит для количественной оценки степени совместной локализации или совместно исключением двух различных маркеров на большом количестве клеток или, возможно, в редких событий, присутствующих в широком клеточной популяции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы значительно признать Пьера Bourdoncle, Томас Гилберт и Луиза Rimbault в Кочин изображениями фонда. Эта работа была поддержана Inserm, CNRS и Ligue Nationale контр ле Рак (Equipe labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
